白酒以谷物为主要原料，经发酵、蒸煮、陈酿和勾兑而成[1-2]，根据香型分为12种[3-4]。其中，酱香型白酒因其独特的酿造工艺、细腻优雅的浓郁香味和丰满醇厚的口感在人们的日常生活中有着重要的地位[5]，随着酱香型白酒市场效益的增加，不法分子制造并销售假冒高端白酒以牟取暴利，工业酒精勾兑造假、以低端酒冒充高端酒和以年份较短冒充年份较长的老酒等掺假方式较为常见[6]，不利于白酒市场的健康发展。目前常用的鉴别手段主要有产品包装防伪识别和品酒师依靠经验从颜色、香气、口感等方面进行评定两种，但是随着造假技术的提高，单一的防伪标识已无法达到目的，且品酒师的评鉴结果常常受个人主观因素和环境因素影响[3]。 基于此，建立一种快速准确的真假白酒鉴别方法对打击制假售假、维护企业形象与消费者合法权益具有重要意义。
白酒中挥发性风味成分可分为骨架成分及微量成分[7]，常用检测技术有气相色谱-氢火焰离子化检测器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪[8-9]，GC-FID已被广泛应用于白酒中较高含量的骨架成分检测，GC-MS用于白酒中含量较低的微量成分检测[10-11]。主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least-squares-discrimination analysis，OPLS-DA）等化学计量学方法广泛应用于酒类产品年份[12]、产地[5，13]和香型[14]等的鉴别。孙细珍等[15]利用气相色谱技术对真假白酒进行检测，结合偏最小二乘判别分析（partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）构建真假酒的判别和验证模型，实现了真假酒的有效区分，并找到了25种区别真假白酒之间的差异性成分。杜玲玲[16]研究表明，气相色谱法结合化学计量学方法可对真假金门高粱酒进行鉴别。 刘嘉飞等[17]通过高分辨质谱结合PCA构建了真假干邑白兰地的区分模型，真假酒之间、不同等级之间的酒能明显区分，为其真假鉴别及组分鉴定提供参考。目前，鲜见关于白酒真实性鉴别的研究报道。
本研究采用GC-FID和GC-MS技术对酱香型白酒真假酒中挥发性风味物质进行分析，结合PCA和OPLS-DA建立真假白酒的判别分析模型，结合变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值及方差分析P值（VIP值＞1，P＜0.05）筛选区分真假酒的差异挥发性风味化合物后构建预测模型，并对预测结果进行验证。以期为真假白酒鉴别提供方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
39个酱香型白酒真实酒样（T）（编号为T1～T39）：贵州某知名酱酒公司；43个假酒样品（F）（F1～T43）：由市场监管局鉴定；16个未知真实性的酒样（X）（X1～X16）：本实验室其余样品中随机挑选。
1.1.2 化学试剂
叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸、乙醛、丙醛、丁酸乙酯、戊酸、己酸、辛酸、庚酸、4-甲基戊醇标准品（纯度均＞98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；仲丁醇、丙醇、异戊醇、己酸乙酯、戊醇、3-羟基-2-丁酮、庚酸乙酯、乳酸乙酯、己醇、乙酸、糠醛、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、β-苯乙醇、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、二甲基二硫、2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、苯乙酮、1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷、2-乙酰基-5-甲基呋喃、2-糠醇、2-十三烷酮、2-乙酰基吡咯等标准品（纯度均＞98%）：上海安谱实验科技股份有限公；乙醚（色谱纯）、氯化钠（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；正己烷（色谱纯）：安徽天地高纯溶剂有限公司。
1.2 仪器与设备
8890气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）、8890-5977B气相色谱-质谱联用仪、DB-FFAP色谱柱（60m×0.25mm×0.25 μm）、DB-Wax UI色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦科技有限公司；AR2130/C电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；Aquaplore3S超纯水系统：美国艾科浦公司。
1.3 方法
1.3.1 酱香型白酒真假酒定性定量方法
（1）骨架成分
采用直接进样（direct injection，DI）结合GC-FID检测样品中含量较高的骨架成分。
前处理条件：取10mL样品置于容量瓶中，加入100μL的混合内标溶液（叔戊醇297.46mg/L，乙酸正戊酯297.59 mg/L，2-乙基丁酸302.37 mg/L），混匀待测[18]。
GC条件：DB-Wax UI 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样量1 μL，流速0.7 mL/min，分流比30∶1，程序升温为初始温度35 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至100 ℃，再以7 ℃/min升至200 ℃，保持16 min。
定性定量分析：采用标准品保留时间进行定性；采用内标法定量。
（2）微量成分
采用液液微萃取（liquid-liquid microextraction，LLME）结合GC-MS检测样品中含量较低的微量成分。 其中GC条件1用于吡嗪类和酚类物质测定，GC条件2用于其他含量较低的酯类、醇类、含硫类物质等测定。
前处理条件：取2 mL白酒样品，加入饱和NaCl溶液使其酒精度稀释至10%vol，加入10 μL的2-辛醇（质量浓度为19.82 mg/L）和2-甲氧基-3-甲基吡嗪（质量浓度为20.23 mg/L）内标物，之后加入2 mL的萃取液（乙醚∶正己烷=1∶1）充分振荡，取上清液待测[18]。
GC条件1：DB-FFAP色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25μm），不分流进样，进样体积2μL，载气为高纯氦气（纯度≥99.999%），流速1 mL/min，程序升温条件为初始温度40 ℃，保持1 min；以8 ℃/min升至80 ℃，以2.5 ℃/min升至115 ℃，以8 ℃/min升至155 ℃，以5 ℃/min升至220 ℃，以5 ℃/min升至230 ℃。
GC条件2：DB-FFAP色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），不分流进样，进样体积2 μL，载气为高纯氦气（纯度≥99.999%），流速1 mL/min，程序升温条件为初始温度50 ℃；以2.5 ℃/min升至100 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至160 ℃，以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。
MS条件：采用电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，选择性离子检测（selected ion monitor，SIM）模式，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃。
定性定量分析：利用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）20谱库、标准品的保留时间进行比对；采用内标法定量。
1.3.2 判别模型的构建
将挥发性风味物质的含量输入判别模型作为模型构建和特征值筛选的基础，根据样品的个数随机将样品按6∶2∶2分为训练集、验证集和预测集，其中，训练集用于判别模型的构建，验证集用于模型的验证，预测集用于酱香型白酒真实性的预测。
若训练集中存在异常值，会使模型的判别能力下降，降低样本分类的准确率，PCA是一种在无监督模式下将高维数据映射到低维空间的数据降维技术，旨在保留数据中方差贡献最大的特征，减少冗余信息[12]。因此，在构建判别模型之前，对样品进行主成分分析（PCA），采用Hotelling's T2检验和DmodX排除异常值。Hotelling's T2检验是一种多变量检验方法，大于95%置信区间的值是可疑的，大于99%置信区间的值可视为严重异常；DmodX是训练集中观测值到主成分模型的观测距离，由f分布计算出DmodX的临界值（Dcrit），当DmodX观测值是Dcrit的2倍时属于中等离群值[19]，若样本值满足上述两者条件，则去掉。
OPLS-DA是一种有监督的模型，可以去除自变量中与分类变量无关的数据变异，使分类信息主要集中在一个主成分中，从而使模型变得简单和易于解释，其判别效果和主成分得分图的可视化效果更加明显[20]。将构建判别模型的所有数据进行自标度化（auto-scaling，UV）预处理，通过原始数据减去每个列变量的均值，并用该数据除以列变量的方差得到新数据，从而消除不同组分的量纲差异，使得所有变量处于同一水平，保证含量低但变化显著的重要标志物不被遗[21]；基于特征值算法进行特征重要性排序，筛选出潜在的差异化合物，将这些代表性特征值代入到预测模型中，以训练集估计均方根误差（root mean square error of estimation，RMSEE）、交叉验证均方根误差（root mean square error of cross validation，RMSECV）、预测均方根误差（root mean square error of prediction，RMSEP）和预测集相关系数R2评估模型的性能，通常R2值越接近1，且RMSEE和RMSEP值越接近0，说明模型准确性和精确度越高，效果越理想。
1.3.3 统计分析
采用Excel 2019对数据进行处理后，Origin 2022绘制柱状堆积图；SPSS 23进行方差分析；SIMCA 14.1软件用于主成分分析、正交偏最小二乘-判别分析。
2 结果与分析
2.1 真假酒挥发性风味成分分析
真假酒样品中共检出101种挥发性风味物质，其中酯类33种、酸类9种、醇类19种、醛酮类16种、含氮类11种、呋喃类5种、含硫类2种、酚类6种；真酒、假酒样品分别检出100种和92种挥发性风味物质，共有91种挥发性风味物质，真酒、假酒样品中酸类、呋喃类、含氮类物质和酚类物质检出种类数相同，其余4种挥发性风味物质数量在真酒样品中检出较多。
真假酒样品各类别挥发性风味物质平均含量测定结果见图1。 由图1可知，各类挥发性风味物质中酯类含量最高，其次是醇类、酸类、醛酮类、呋喃类等。 除酚类外，真实酒样中各类别挥发性风味物质平均含量均远高于假酒酒样，真假酒样品中酯类物质平均含量分别为4 951.35 mg/L和3 098.40 mg/L，酯类物质主要来源于原料、自发的酯化反应及微生物[22]，由于白酒在发酵过程中乙醇含量较高，可与酸类物质发生酯化，这可能是真酒中酯类物质种类多、浓度高的原因[23]，酯类是白酒中重要的香气化合物，可以赋予酒体浓郁的果香及酯香[24-25]。其次，真假酒样品中醇类物质平均含量分别为3 465.81 mg/L和1 054.62 mg/L，醇类是形成酯类物质的前体物质，可以在酱香型白酒中起到助香的作用[26]，真假酒样品中酸类物质平均含量分别为2 385.68 mg/L和1 958.08 mg/L，酸类物质主要影响白酒的口感和后味，含量过高会使白酒出现异杂味，含量过低则会导致后味寡淡[20，27]，酸类物质主要来源于堆积发酵过程，微生物利用蛋白质、淀粉等经过一系列复杂的生化反应产生[28]，导致假酒样品中酸类物质含量低于真酒；真假酒样品中呋喃类物质含量分别为315.74 mg/L和93.37 mg/L，呋喃类物质是在高温条件下碳水化合物分解及美拉德反应产生的[27]。 因此，真酒样品中挥发性风味物质含量高于假酒样品。
图1 真假酒样品各类别挥发性风味物质平均含量柱状图
Fig.1 Bar chart of average content of various categories of volatile flavor compounds in true and fake Baijiu
2.2 真假酒挥发性风味物质判别模型构建
2.2.1 主成分分析
真假酒主成分分析得分图及异常值排除结果见图2。 由图2可知，除酒样F42以外，其余真假酒沿t1轴分开，且各假酒样本之间十分分散，说明假酒样品组内差异较大，而真酒样品组内差异较小，酒体较稳定。 利用Hotelling's T2检验和DModX排除异常值，Hotelling's T2检验中F40和F42为可疑值，而DModX中未发现可疑值，因此，将全部观测值用于建立有监督的模型。
图2 真假酒主成分分析得分图（a）及异常值排除结果（b）
Fig.2 Principal component analysis score plot (a) and the results of outlier exclusion (b)
2.2.2 正交偏最小二乘判别分析
采用有监督的多元统计方法OPLS-DA对其进行判别，酱香型白酒真假酒挥发性风味物质OPLS-DA得分图及200次置换检验结果见图3。由图3a可知，两组酒样沿着t1轴能明显区分，该模型的解释变异量R2Y和预测能力Q2分别为0.991和0.989，两者都比较接近1，说明该模型效果良好，为了检验该模型是否可靠，将该模型经过200次置换检验，由图3b可知，置换检验的R2和Q2的截距分别为0.113和-0.344，说明模型不存在过拟合，模型验证可靠。
图3 酱香型白酒真假酒挥发性风味物质正交偏最小二乘-判别分析得分图（a）及200次置换检验结果（b）
Fig.3 Orthogonal partial least squares discriminant analysis score plot (a) and 200 permutation test results (b) of volatile flavor compounds in true and fake sauce-flavor Baijiu
2.3 真假酒挥发性风味物质判别模型验证
将随机选取的16个未知真实性的酱香型白酒作为测试集代入模型中进行验证，测试集用X表示，通过计算其与原模型间的距离进行判别，得出预测能力正确率，从而达到评估模型鉴别能力的目的。验证集真假酒挥发性物质OPLS-DA得分图及VIP值见图4。 由图4a可知，未知酒样X1～X8与真实酒样聚为一类，酒样X9～X16与假酒聚为一类，所有样品均被正确分类，模型准确率达100%，表明该模型可以很好的对酱香型真假酒进行分类。
图4 验证集真假酒挥发性风味物质正交偏最小二乘-判别分析得分图（a）及变量重要性投影值（b）
Fig.4 Orthogonal partial least squares discriminant analysis score plot (a) and variable importance in the projection values (b)of volatile flavor compounds in true and fake Baijiu in validation sets
变量重要性投影（VIP）值可以量化每个变量对样品分类的贡献，VIP值越大，变量在不同组别差异越显著，当VIP值＞1时，可认为是样品差异的潜在标志化合物[29]。 由图4b可知，本研究已建立的模型中VIP值＞1的挥发性风味化合物共有58种，包括2-壬酮、3-辛醇、2-十三烷酮、异戊醛、2-甲基吡嗪等，这些化合物是实现酱香型白酒真假酒鉴别分析的潜在差异性化合物。
2.4 真假酒挥发性风味物质判别模型性能
进一步对58种潜在差异物质进行方差分析发现，其含量在真假酒样品中均具有显著差异（P＜0.05），以这58种显著差异化合物建立预测模型，真假白酒训练集和预测集判别模型评估结果见图5。
图5 真假白酒显著差异化合物训练集（a）和预测集（b）判别模型评估结果
Fig.5 Discriminant model evaluation results of the training set (a)and prediction set(b)of the significantly differential compound for true and fake Baijiu
由图5可知，预测集与训练集中真假酒样品的分布顺序由下往上保持一致，且模型的决定系数R2达0.998，RMSEE、RMSECV和RMSEP分别为0.049、0.064和0.023，该结果说明该模型稳定可靠，具有预测白酒真实性的能力。
3 结论
本研究以真、假酱香型白酒样品对研究对象，对其挥发性风味成分进行分析，结果表明，真酒和假酒样品中分别检出100种和92种挥发性风味物质，其中真酒和假酒中酯类物质平均含量分别为4 951.35 mg/L和3 098.40 mg/L、醇类物质平均含量分别为3 465.81 mg/L和1 054.62 mg/L、酸类物质平均含量分别为2 385.68 mg/L和1 958.08 mg/L；PCA及OPLS-DA分类模型判别准确率达100%，筛选出58种显著差异挥发性风味化合物（VIP值＞1，P＜0.05）建立预测模型，结果表明，预测集相关系数R2为0.998，RMSEE、RMSECV和RMSEP分别为0.049、0.064和0.023，说明该判别模型稳定可靠，可以有效实现酱香型白酒真假酒的区分，本研究结果可为预测白酒真实性鉴别提供新思路。
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