葡萄果皮中的色素以花色素类为主,通常与糖苷结合以花色苷的形式存在,直接影响葡萄果实的色泽[1]。贺兰山东麓产区位于宁夏贺兰山东侧山脚下,属于典型的大陆性干旱半干旱气候,该区光能热量充足,干旱少雨,是我国优质的酿酒葡萄种植区和葡萄酒产区之一[2]。 美乐(Vitis vinifera L.)是贺兰山东麓产区主栽的酿酒葡萄品种之一,适应性强,耐寒抗旱,具有果香浓郁、单宁柔和、适酿性强等特点,适宜沙质土壤、温暖干燥的气候条件[3],但由于产区环境因素的影响,美乐在部分产区表现为花色苷及其衍生物积累不足,导致果实着色较差。 全龙萍等[4]在山东产区通过草炭+微生物菌剂复合处理使美乐果实花色苷含量提高了327.08%,有效改善了果实着色;赵芳芳等[5]在贺兰山东麓产区通过喷施油菜素内酯提高了美乐果实着色率和花色苷含量,其中0.6 mg/L油菜素内酯处理的果实着色率和花色苷分别提高了13.03%和21.07%。
乙烯是一种加速果实成熟以及衰老脱落等生理过程的激素,参与植株的整个生长发育过程[6]。在一定条件下,乙烯利不仅可以释放出乙烯,还能诱导植株产生乙烯。近年来有研究表明,乙烯利处理葡萄可以促进叶绿素降解和合成花色苷等酚类物质,从而提高果实着色[7-10]。 葡萄果实在转色期之前其内源乙烯的含量显著增加[7],乙烯利处理能诱导葡萄果实内源乙烯含量的增加,上调花色苷合成基因的表达,从而促进花色苷含量的增加和果实着色[11]。 刘美迎等[10]于转色期对‘赤霞珠’葡萄果实喷施400 mg/L乙烯利,结果发现有助于提高其葡萄酒中的酚类物质含量,并有效提高葡萄酒的饱和度及红黄色色调。在果树栽培管理中,叶面施肥是一种高效经济的根外施肥技术,其中磷酸二氢钾作为常用的叶面肥,在植物上使用十分安全,不易造成叶片的灼烧。磷和钾是果树生长发育过程中的重要营养元素,对调节植物生长发育、提高光合同化、产量与品质形成等均具有重要作用[12]。 赵婷等[13]于转色末期在‘赤霞珠’葡萄叶片上喷施3 g/L磷酸二氢钾,果实花色苷含量提高了30%。
本研究针对贺兰山东麓美乐葡萄果实着色不良、采收时粉果较多、葡萄酒颜色欠佳等问题,以喷施含0.01%(V/V)吐温20去离子水作为对照,于果实转色初期、转色完成期、转色完成后2周、果实转色初期+转色完成期、转色完成期+转色完成后2周、果实转色初期+转色完成期+转色完成后2周在叶背及果穗上分别喷施300 mg/L乙烯利和0.3%磷酸二氢钾,分别考察喷施乙烯利和磷酸二氢钾对宁夏贺兰山东麓产区酿酒葡萄美乐果实酚类物质及单体花色苷含量的影响,筛选出能够促进美乐果实着色的技术方案,为生产优质葡萄酒奠定理论和技术基础。
本试验在西夏小产区的张骞郡葡萄酒产业园进行,葡萄园为砾石土壤、质地疏松、通气性良好。葡萄供试品种为美乐(Vitis vinifera L.),2017年定植,株行距1.0 m×3.5 m,篱架、厂字形树形,南北行向。
乙腈、甲酸、甲醇(均为色谱纯):德国Merck公司;福林酚、氢氧化钠、无水硫酸铜、甲基纤维素、氯化铝、甲酸、盐酸、甲醇、乙酸乙酯、硫酸铵、氯化钾、醋酸钠、亚硝酸钠(均为分析纯):天津科密欧化学试剂有限公司;芦丁、(+)-儿茶素、干没食子酸等标准品(纯度均>98%):美国Sigma公司。
FD5-2.5E冷冻干燥机:美国SIM公司;KQ-300DE型数控超声波清洗器:昆山超声仪器有限公司;5804R离心机:德国Eppendorf公司;Centrivap离心浓缩仪:美国Labconco公司;UV-1800紫外/可见分光光度计、LC-2030高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪:日本岛津公司。
1.3.1 葡萄果实田间喷施处理
本试验于2024年进行,晴天早晨8:00-9:00喷施叶片背面和果穗,如喷施24 h内出现降雨则进行补喷。每个处理30株,重复3次。 在不同时期喷施乙烯利和磷酸二氢钾,共设计13个处理。乙烯利质量浓度为300 mg/L(內加0.01%的吐温20),分别在葡萄果实成熟过程不同时期进行单一时期喷施处理和多个时期连续喷施处理,共设置6个处理:转色初期(编号为E1);转色完成期(编号为E2);转色完成后2周(编号为E3);浆果转色初期+转色完成期(编号为E4)、转色完成期+转色完成后2周(编号为E5);浆果转色初期+转色完成期+转色完成后2周(编号为E6)。磷酸二氢钾质量分数为0.3%(加0.01%的吐温20),分别在浆果成熟过程不同时期进行单一时期喷施处理和多个时期连续喷施处理,共设置6个处理:转色初期(编号为PK1)、转色完成期(编号为PK2)、转色完成后2周(编号为PK3)、浆果转色初期+转色完成期(编号为PK4)、转色完成期+转色完成后2周(编号为PK5)、浆果转色初期+转色完成期+转色完成后2周(编号为PK6)。以含0.01%(V/V)吐温20的去离子水为对照(CK)。
1.3.2 样品采集
在浆果成熟进程(糖酸变化)监控的基础上,参照《葡萄种质资源描述规范》,当种子完全变褐、果实可溶性固形物和总酸的含量在连续5 d内基本不再变化,即对试验处理进行取样。采样于早上8:00-10:00进行,每个处理随机采集30个果穗,立刻进行液氮速冻后置于干冰中运回实验室,置于-80 ℃的低温冰箱备用。
1.3.3 分析检测
总酚含量:采用福林-肖卡法[14]测定,结果以没食子酸当量(gallic acid equivalent,GAE)表示;总花色苷含量:采用pH示差法[15]测定,结果以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷当量(dimethicillin-3-O-glucoside equivalent,DGE)表示;总单宁含量:采用甲基纤维素沉淀法[16]测定,以儿茶素当量(catechin equivalent,CE)表示。以干基计。
各花色苷组分提取参照HE J J等[17]的方法进行,定性定量分析参照YANG P等[18]的方法进行,其含量以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷当量(DGE)表示。以干基计。
1.3.4 数据处理
所有数据结果以“平均值±标准差”表示。 采用Excel 2019进行数据整理及基本统计分析;采用PASW Statistics 18.0进行单因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),采用Duncan法进行处理间均值的多重比较(P<0.05表示差异显著)。
喷施300 mg/L乙烯利及0.3%磷酸二氢钾对美乐葡萄果皮总花色苷、总酚及总单宁含量的影响见图1。
图1 喷施乙烯利及磷酸二氢钾对美乐葡萄果皮中总花色苷(A)、总酚(B)及总单宁(C)含量的影响
Fig.1 Effect of spraying ethephon and potassium dihydrogen phosphate on the contents of total anthocyanins (A), total phenols (B) and total tannins (C) of Merlot grape pericarp
小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同。
2.1.1 喷施乙烯利及磷酸二氢钾对美乐葡萄果皮总花色苷含量的影响
花色苷是苯丙氨酸途径的最终产物,其含量高低直接影响了酿酒葡萄和葡萄酒的品质和经济价值[19]。 由图1A可知,喷施乙烯利所有处理均显著提高果皮总花色苷的含量(P<0.05),与刘美迎等[10,20-22]研究结果一致。浆果转色初期喷施乙烯利(E1)的效果最好,果皮总花色苷含量(12.31 mg/g)较对照显著提高了81.59%(P<0.05),浆果转色初期+转色完成期喷施乙烯利(E4)较对照(CK)显著提高了53.31%(P<0.05),其他乙烯利喷施处理(E2、E3、E5、E6)较对照(CK)显著提高了14.14%~33.43%(P<0.05)。花色苷的合成需要糖类物质的参与,因此花色苷的含量和糖的含量通常呈现正相关的关系[23],乙烯利处理可促进葡萄果实糖分的积累[10,21-22],从而提高花色苷的含量。
喷施磷酸二氢钾所有处理亦显著提高了果皮总花色苷的含量(P<0.05),与前人在赤霞珠和Rasha葡萄上的研究结果一致[13,24-25]。浆果转色初期+转色完成期+转色完成后2周连续喷施磷酸二氢钾(PK6)的效果最好,果皮总花色苷含量(9.90 mg/g)较对照(CK)显著提高了45.80%(P<0.05),浆果转色完成2周(PK3)、浆果转色初期+转色完成期喷施磷酸二氢钾(PK4)较对照(CK)分别显著提高了24.45%和21.65%(P<0.05),其他磷酸二氢钾喷施处理(PK1、PK2、PK5)较对照(CK)显著提高了8.84%~16.49%(P<0.05),与钾肥能促进着色相关基因DFR、LDOX、UFGT的表达有关[26]。同时,钾可以通过提高糖代谢相关酶活性,促进淀粉向糖的转化,进而提高葡萄果实中的总糖含量[27],间接促进花色苷的积累。
2.1.2 喷施乙烯利及磷酸二氢钾对美乐葡萄果皮总酚含量的影响
酚类物质是一类重要的次生代谢产物,不仅对葡萄酒的感官特性(颜色、香气、口感等)有重要贡献,而且对人体健康也有许多潜在益处[28]。 由图1B可知,浆果完成期喷施乙烯利(E2)果皮总酚含量(69.39 mg/g)最高,较对照(CK)显著提高了56.74%(P<0.05),浆果转色初期+转色完成期连续喷施乙烯利(E4)较对照(CK)显著提高了32.03%(P<0.05),与前人在美乐和赤霞珠果实上的研究结果一致[21,29]。浆果转色初期+转色完成期+转色完成后2周连续喷施乙烯利(E6)较对照(CK)显著降低了22.39%,其他乙烯利喷施处理(E1、E3、E5)果皮总酚含量与对照(CK)没有显著差异(P>0.05)。
浆果转色初期+转色完成期+转色完成后2周连续喷施磷酸二氢钾(PK6)果皮总酚含量(60.33 mg/g)最高,较对照(CK)显著提高了36.28%(P<0.05),浆果转色初期喷施磷酸二氢钾(PK1)较对照(CK)显著提高了21.21%(P<0.05),浆果转色初期+转色完成期喷施磷酸二氢钾(PK4)、转色完成期+转色完成后2周连续喷施磷酸二氢钾(PK5)较对照(CK)分别显著提高了11.27%和11.36%(P<0.05),其他磷酸二氢钾喷施处理(PK2、PK3)与对照(CK)没有显著差异(P>0.05)。 磷能够通过提高三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)活性影响醇酯的合成,钾能提高叶片的光合作用、CO2同化、叶片与果实间糖分的转移,从而间接有益于果实成熟过程中酚类物质的合成[30]。
2.1.3 喷施乙烯利及磷酸二氢钾对美乐葡萄果皮总单宁含量的影响
单宁对葡萄酒的颜色具有积极作用[31],如减缓花色苷的降解、与花色苷结合形成稳定的单宁-花色苷复合物等。由图1C可知,浆果转色初期(E1)、转色完成后2周(E3)、转色初期+转色完成期(E4)喷施乙烯利果皮总单宁含量与对照(CK)没有显著差异(P>0.05),但浆果转色初期喷施乙烯利果皮总单宁含量(25.59 mg/g)较对照(CK)提高了9.73%,与LIU M Y等[29]在赤霞珠果实上的研究结果一致。其他乙烯利处理(E2、E5、E6)较对照(CK)却显著降低了果皮总单宁含量(P<0.05)。
除浆果转色完成期(PK2)、转色完成后2周(PK3)喷施磷酸二氢钾果皮总单宁含量显著低于对照(CK)外(P<0.05),其他磷酸二氢钾喷施处理与对照(CK)没有显著差异(P>0.05),与赵婷等[13]研究结果一致。
通过HPLC对果实花色苷物质进行分析,共检测出9种单体花色苷,其中包括非酰化花色苷5种、酰化花色苷4种(2种乙酰化花色苷和2种对香豆酰化花色苷)。
2.2.1 喷施乙烯利对美乐葡萄果皮花色苷组分的影响喷施乙烯利对美乐葡萄果皮花色苷组分的影响见表1。由表1可知,浆果转色初期(E1)、转色初期+转色完成期(E4)喷施乙烯利对果皮单体花色苷总量的提升效果最佳,分别较对照(CK)显著提高了90.47%和71.71%(P<0.05)。转色完成期(E2)、浆果转色完成后2周(E3)、转色初期+转色完成期+转色完成后2周(E6)连续喷施乙烯利较对照(CK)分别显著提高了44.87%、38.52%和17.86%(P<0.05)。结果与本研究中总花色苷含量的结果基本一致。
表1 喷施乙烯利对美乐葡萄果皮花色苷组分及含量的影响
Table 1 Effect of spraying ethylene on anthocyanin composition and contents of Merlot grape pericarp mg/g
注:同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 下同。
花色苷组分E1E2E3E4E5E6CK非酰化花色苷花翠素-3-O-葡萄糖苷花青素-3-O-葡萄糖苷甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷甲基花青素-3-O-葡萄糖苷二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷合计比例/%酰化花色苷甲基花青素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷甲基花青素-3-O-(反式-6-O-对香豆酰化)-葡萄糖苷2.60±0.08b 1.39±0.04b 2.53±0.05a 5.92±0.13b 17.92±0.30a 30.36±0.60a 65.73 2.19±0.11c 1.07±0.00cd 2.13±0.02b 5.32±0.12c 13.38±0.25b 24.09±0.28b 68.53 2.03±0.02c 1.43±0.04b 1.94±0.05c 5.72±0.05b 11.85±0.07c 22.97±0.05b 68.36 3.03±0.11a 2.04±0.12a 2.58±0.12a 8.23±0.02a 13.73±0.02b 29.61±0.35a 71.11 1.80±0.00d 1.15±0.00c 1.65±0.01d 4.21±0.00d 9.82±0.01d 18.63±0.00c 69.10 1.24±0.06e 1.02±0.03d 1.31±0.01e 5.40±0.10c 9.98±0.10d 18.95±0.16c 66.31 1.26±0.05e 0.77±0.03e 1.38±0.05e 2.94±0.22e 8.81±0.88e 15.16±1.03d 62.52 1.01±0.04bc 5.88±0.19a 1.58±0.13b 1.17±0.16b 4.47±0.20b 1.53±0.03b 1.11±0.05bc 4.25±0.19bc 1.48±0.01b 1.61±0.01a 4.40±0.01bc 2.05±0.21a 0.87±0.00c 3.34±0.02d 1.16±0.01c 1.07±0.00bc 3.47±0.04d 1.45±0.03b 0.57±0.21d 3.73±0.68cd 0.94±0.02c二甲花翠素-3-O-(反式-6-O-对香豆酰化)-3.85±0.00b 9.09±0.86ef 37.48 24.25±1.88e葡萄糖苷合计比例/%总含量7.36±0.32a 15.83±0.22a 34.27 46.19±0.38a 3.87±0.01b 11.04±0.31bc 31.43 35.13±0.59c 3.78±0.15b 10.62±0.29cd 31.62 33.59±0.34c 3.97±0.37b 12.03±0.58b 28.89 41.64±0.93b 2.96±0.01c 8.33±0.03f 30.90 26.96±0.03d 3.64±0.02b 9.63±0.06de 33.69 28.58±0.21d
乙烯利处理对于果皮非酰化花色苷含量的提升幅度大于酰化花色苷。 所有乙烯利处理均提高了果皮非酰化花色苷含量,浆果转色初期(E1)、转色初期+转色完成期(E4)喷施乙烯利较对照(CK)显著提高了100.26%和95.32%(P<0.05),转色完成期(E2)、转色完成后2周(E3)、转色完成期+转色完成后2周(E5)、转色初期+转色完成期+转色完成后2周(E6)喷施乙烯利分别较对照显著提高了58.91%、51.52%、22.89%和25.00%(P<0.05)。 除转色完成期+转色完成后2周(E5)、转色初期+转色完成期+转色完成后2周(E6)喷施乙烯利处理的果皮酰化花色苷含量较对照(CK)没有显著差异外(P>0.05),其他处理较对照显著提高了16.83%~74.15%(P<0.05),而酰基化修饰能促进花色苷颜色加深,增强花色苷的稳定性[32],故乙烯利处理的果实花色苷颜色更深且稳定性更高,与马文婷等[20]研究结果一致。
浆果转色初期(E1)、转色完成期(E2)、转色完成后2周(E3)、转色初期+转色完成期(E4)、转色完成期+转色完成后2周(E5)、转色初期+转色完成期+转色完成后2周(E6)喷施乙烯利处理及对照(CK)的果皮非酰化花色苷含量占单体花色苷总量的比例分别为65.73%、68.53%、68.36%、71.11%、69.10%、66.31%和62.52%,果皮酰化花色苷含量占单体花色苷总量的比例分别为34.27%、31.43%、31.62%、28.89%、30.90%、33.69%和37.48%。
2.2.2 喷施磷酸二氢钾对美乐葡萄果皮花色苷组分的影响喷施磷酸二氢钾对美乐葡萄果皮花色苷组分的影响结果见表2。 由表2可知,喷施磷酸二氢钾所有处理均显著提高了果皮单体花色苷总量(P<0.05)。 浆果转色完成后2周(PK3)喷施磷酸二氢钾处理使果皮单体花色苷总量(32.32 mg/g)提升幅度最大,较对照(CK)显著提高33.28%(P<0.05),其次为浆果转色初期+转色完成期(PK4)喷施磷酸二氢钾处理较对照(CK)显著提高了23.51%(P<0.05),浆果转色完成期(PK2)、转色完成期+转色完成后2周(PK5)、转色初期+转色完成期+转色完成后2周(PK6)喷施磷酸二氢钾处理分别较对照(CK)显著提高了19.13%、19.42%和17.86%(P<0.05),浆果转色初期(PK1)喷施磷酸二氢钾处理较对照(CK)显著提高了13.11%(P<0.05)。
表2 喷施磷酸二氢钾对美乐葡萄果皮花色苷组分及含量的影响
Table 2 Effect of spraying potassium dihydrogen phosphate on anthocyanin composition and contents of Merlot grape pericarp mg/g
花色苷组分PK1PK2PK3PK4PK5PK6CK非酰化花色苷花翠素-3-O-葡萄糖苷花青素-3-O-葡萄糖苷甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷甲基花青素-3-O-葡萄糖苷二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷合计比例/%酰化花色苷甲基花青素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷甲基花青素-3-O-(反式-6-O-对香豆酰化)-葡萄糖苷1.83±0.01b 1.66±0.02a 1.55±0.04cd 5.52±0.10a 8.51±0.15d 19.07±0.32bc 69.52 1.74±0.04b 1.19±0.00d 1.65±0.13bc 4.57±0.23b 10.36±0.57bc 19.51±0.70bc 67.53 2.35±0.02a 1.32±0.04bc 2.17±0.04a 4.60±0.08b 11.92±0.18a 22.36±0.07a 69.18 1.75±0.05b 1.31±0.05c 1.77±0.12b 4.41±0.05b 11.09±0.14ab 20.33±0.31b 67.88 1.82±0.06b 1.41±0.05b 1.80±0.05b 4.48±0.00b 10.32±0.23bc 19.83±0.26bc 67.96 1.24±0.06c 1.02±0.03e 1.31±0.01e 5.40±0.10a 9.98±0.10c 18.95±0.15c 66.31 1.26±0.05c 0.77±0.03f 1.38±0.05de 2.94±0.22c 8.81±0.88d 15.16±1.03d 62.52 0.95±0.14ab 3.05±0.50b 1.50±0.03a 0.99±0.04ab 3.87±0.05ab 1.16±0.02b 0.95±0.01ab 4.13±0.11a 1.24±0.07b 0.70±0.16bc 3.92±0.31ab 1.15±0.07b 0.86±0.06ab 3.88±0.15ab 1.24±0.03b 1.07±0.00a 3.47±0.04ab 1.45±0.03a 0.57±0.21c 3.73±0.68ab 0.94±0.02c二甲花翠素-3-O-(反式-6-O-对香豆酰化)-葡萄糖苷合计比例/%总含量2.86±0.15c 8.36±0.81b 30.48 27.43±1.13c 3.36±0.06b 9.38±0.07ab 32.47 28.89±0.77bc 3.64±0.15ab 9.96±0.34a 30.82 32.32±0.26a 3.85±0.20a 9.62±0.20a 32.12 29.95±0.12b 3.38±0.26b 9.36±0.08ab 32.08 29.18±0.19bc 3.64±0.02ab 9.63±0.06a 33.69 28.58±0.21bc 3.85±0.00a 9.09±0.86ab 37.48 24.25±1.89d
喷施磷酸二氢钾果皮酰化花色苷含量与对照(CK)没有显著差异(P>0.05),但所有处理均显著增加了果皮非酰化花色苷含量(P<0.05)。 浆果转色完成后2周(PK3)喷施磷酸二氢钾果皮非酰化花色苷含量(22.36 mg/g)较对照(CK)显著提高了47.49%(P<0.05),其次为浆果转色初期+转色完成期(PK4)喷施磷酸二氢钾较对照(CK)显著提高了34.10%(P<0.05),浆果转色初期(PK1)、转色完成期(PK2)、转色完成期+转色完成后2周(PK5)、浆果转色初期+转色完成期+转色完成后2周(PK6)喷施磷酸二氢钾分别较对照(CK)显著提高了25.79%、28.69%、30.80%和25.00%(P<0.05)。
喷施乙烯利和磷酸二氢钾的所有处理均显著提高了美乐果皮总花色苷含量,其中喷施乙烯利的效果略优于磷酸二氢钾。 不同时期喷施300 mg/L的乙烯利,浆果转色初期喷施提高果皮总花色苷含量和总单宁含量的效果最佳,浆果转色完成期喷施果皮总酚提升幅度最大。 不同时期喷施0.3%的磷酸二氢钾,浆果转色初期+转色完成期+转色完成后2周连续喷施对提升果皮总花色苷含量及总酚、总单宁含量的效果最好。
为了提高贺兰山东麓产区美乐果实着色度,建议在浆果转色初期喷施300 mg/L的乙烯利或在浆果成熟过程中分3次喷施0.3%的磷酸二氢钾。
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