白酒的酿造和饮用在中国已经有几千年的历史，是世界上最古老的蒸馏酒之一[1]，主要以小麦、高粱等为原料采用固态发酵制成，距今已有2 000多年的发展历史[2]。白酒作为我国的国酒，不仅承载着悠久的中华文明和厚重的酒文化，而且具有健康促进作用，现代医学表明饮酒可以降低冠心病的死亡率[3-4]，降低空腹血糖含量[5-6]，预防心血管疾病[7-8]，预防癌症[9-10]，增强人体免疫功能[11-14]。白酒中98%的成分是水和乙醇，其他约2%的微量成分决定了白酒的香型和风格，赋予白酒独特的风味特征和生物活性[15]。微量成分中主要包括挥发性成分醇类、酚类、酸类、酯类、含氮化合物、含硫化合物，其中不同香型白酒的挥发性成分的种类、香气阈值、相互作用等已经进行了系统的研究报道[16]，非挥发性成分包括游离氨基酸、矿物质、维生素、肽等[17]，近年来，随着“健康中国2030纲要”的实施，非挥发性成分作为白酒中重要的微量成分也逐渐成为学者们研究的热点[18]。
白酒中的健康因子在近些年得到了较为系统的研究。随着现代分析技术的发展，高效的前处理方法，以及液相色谱、液相色谱-质谱联用、气相色谱-质谱联用等检测技术[19-23]已经应用于白酒健康因子的鉴定中。据统计，白酒微量成分已多达1 874种[24]。 液相色谱-串联质谱结合组学技术是一种基于高通量检测技术，综合分析多种数据集特征量或者目标物的分析方法[25-26]。 被广泛应用于食品掺假鉴定[27]、品质鉴别[28-30]以及食品产地溯源[31-32]等方面。 非靶向代谢组学以无偏向的方式分析寻找尽可能多的组分，再通过统计学方法寻找能够反映组间差异的特征化合物，从而对不同个体之间的差异做出判别[33-35]。 超高效液相色谱串联质谱（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析技术与非代谢组学技术相结合，能够最大程度获取样品中化合物信息。通过数据库对化合物进行定性及相对定量，无需标准品进行定量分析。样品自动化分析结合数据统计学分析的集成应用，促进了质量定级的标准化。但鲜少有利用此技术对不同等级五粮液系列白酒差异性进行研究。白酒健康因子的鉴定和功能性验证，为白酒的健康作用提供了科学依据。
本研究以五粮液集团五粮系列白酒为研究对象，基于组学技术分析不同系列白酒的非挥发性成分液相色谱-质谱联用法测定结果，通过层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）确定不同系列白酒的非挥发性成分差异性，为不同系列白酒的界定提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
五粮液普五第八代（52%vol）（BJ1）、五粮醇红装（50%vol）（BJ2）、五粮春第二代（52%vol）（BJ3）、五粮特曲（52%vol）（BJ4）、五粮头曲醇品（52%vol）（BJ5）：宜宾五粮液股份有限公司，生产日期均为2022年，采购于京东商城，所有样品均保存在干燥避光室温环境中。
1.1.2 化学试剂
甲醇、乙腈（色谱纯）：德国默克公司；甲酸（色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
Sciex Qtrap 4500液质联用仪：美国AB SCIEX公司；Vortex2涡旋混合器：德国艾卡公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
分别取1.5 mL白酒样品加入20μL甲醇，涡旋混合3min，过0.22 μm有机系滤膜后进行测定。将5种五粮液白酒等体积混合作为质量控制样品，在相同处理条件下分析样品测定的重复性。
1.3.2 液相色谱条件
Agilent SB-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液，流速：0.35 mL/min；梯度洗脱程序：0～9.0 min，95%～5%A；9.0～10.0 min，5%A；10.0～11.0 min，95%～5%A；11.0～14.0 min，95%A。
1.3.3 质谱条件
电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源；正离子模式：喷雾电压3.5 kV；鞘气40 psi；辅助气体流10 arb；离子源温度550 ℃；电子能量30 eV。
1.3.4 定性定量条件
采用多反应监测（multi-reaction monitoring，MRM）模式由四极杆筛选目标化合物母离子，经碰撞室诱导电离后断裂形成碎片离子，由得到的目标化合物特征碎片离子信息与自建数据库进行比对（分析时去除同位素信号，K+、Na+、
离子重复信号等），结合保留时间对目标化合物进行定性。
由三重四极杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度，用MultiQuant软件进行色谱峰的积分处理和校正工作，每个色谱峰的相对峰面积代表对应物质的相对含量。
1.3.5 数据分析
质谱数据采用Analyst 1.6.3进行处理，用MassHunter定量软件处理样本下机质谱文件，选择定量离子进行色谱峰的积分和校正工作。 通过统计函数prcomp在R软件（www.r-project.org）内进行无监督主成分分析，在无监督主成分分析前对数据进行单位方差缩放。
代谢物含量数据采用UV归一化（unit variance scaling）处理，通过R软件ComplexHeatmap包绘制热图，对代谢物在不同样本间的积累模式进行层次聚类分析，并采用R包ComplexHeatmap计算皮尔逊相关系数r。 样品和化合物的HCA结果以带有树状图的热图表示，而样品之间的皮尔逊相关系数（pearson correlation coefficient，PCC）则通过R包中的相关函数计算。
差异化合物筛选：根据差异倍数（fold change，FC）值进行差异化合物筛选，选取fold change≥2和fold change≤0.5的组分，化合物在两组中的差异为2倍以上或0.5以下，判定为差异显著。
2 结果与分析
2.1 白酒中非挥发性化合物分析
采用液相色谱-质谱联用法，5个系列5款白酒共检出317种非挥发性化合物，其中31种生物碱类、37种氨基酸及衍生物类、15种黄酮类、3种木脂素和香豆素、70种脂类、12种核苷酸及衍生物类、48种有机酸类、43种酚酸类、5种萜类、39种糖和醇类、7种维生素类和7种其他类化合物。5个系列白酒检出非挥发性化合物分布见图1，各类别非挥发性化合物鉴定结果见表1。
表1 五种系列白酒中各类别非挥发性化合物成分鉴定结果
Table 1 Identification results of various categories non-volatile compounds in five series of Baijiu
白酒名称 生物碱类/种氨基酸及衍生物类/种黄酮类/种木脂素和香豆素/种脂类/种核苷酸及衍生物类/种有机酸类/种酚酸类/种萜类/种糖和醇类/种维生素类/种其他类化合物/种合计/种五粮液五粮醇五粮春五粮特曲五粮头曲29 29 31 28 27 35 32 35 37 37 13 9 12 10 13 33333 70 59 70 56 58 12 12 11 12 12 39 41 38 39 42 39 38 38 32 36 53533 37 38 38 37 37 77677 74657 296 275 293 269 282
图1 五种系列白酒中各类别非挥发性化合物分布
Fig.1 Distribution of various categories non-volatile compounds in five series of Baijiu
由表1可知，五粮液白酒中鉴定出296种非挥发性化合物，五粮醇白酒中鉴定出275种，五粮春白酒中鉴定出293种，五粮特曲白酒中鉴定出269种，五粮头曲白酒中鉴定出282种，不同五粮液白酒检出化合物的数量和组成存在差别，五粮液和五粮春两款白酒非挥发性化合物种类显著高于五粮醇、五粮特曲和五粮头曲三款白酒。 五种白酒中检出的脂类种类最多，木脂素和香豆素种类最少。五粮液和五粮春中脂类的含量明显高于其他系列白酒，五粮液和五粮春中非挥发性化合物种类较五粮醇、五粮特曲和五粮头曲丰富。
2.2 主成分分析
主成分分析的数据处理原理是将原始数据压缩成n个主成分来描述原始数据集的特征，对5款五粮液白酒样品进行主成分分析，结果见图2。质控样本由五个五粮系列白酒样品等体积混合制备而成，用于评价分析方法的稳定性。
图2 基于非挥发性化合物的五种系列白酒主成分分析结果
Fig.2 Principal component analysis results of five series Baijiu based on non-volatile compounds
BJ1是五粮液普五第八代（52%vol）白酒；BJ2是五粮醇红装（50%vol）白酒；BJ3是五粮春第二代（52%vol）白酒；BJ4是五粮特曲（52%vol）白酒；BJ5是五粮头曲醇品（52%vol）白酒，每个样品设置两个平行，下同。
由图2可知，质控样本集中分布在PCA分析图原点位置，表明该分析方法的稳定性较好。PC1和PC2累计方差贡献率之和为57.6%，表明所提取的主成分包含了样品的大部分数据，说明该方法具有全面性和可靠性。PC1方差贡献率达42.35%，不同系列的样品在横坐标轴上的距离越大，说明组间差异性越大，在第一主成分上，五粮液与五粮春的差异性最小，与五粮醇、五粮特曲和五粮头曲的差异性较大。 五粮液和五粮春样品虽在纵坐标方向上有一定的距离，但PC2对累计方差的方差贡献率仅有15.25%，说明组内之间的实际差异较小。PCA对5款五粮液系列白酒均具有较好的区分，质控样品的集中度较高，在第一主成分上，五粮液和五粮春两款白酒明显区别于五粮醇、五粮特曲和五粮头曲三款白酒。
2.3 层次聚类分析
层次聚类分析（HCA）是一种分类的多变量统计分析方法。 按照个体或样品的特征将它们分类，使同一类别内的个体具有尽可能高的同质性，而类别之间则应具有尽可能高的异质性。5款五粮液白酒中各类别非挥发性化合物聚类分析热图见图3，白酒样品聚类分析热图见图4。
图3 五种系列白酒中非挥发性化合物类别层次聚类分析热图
Fig.3 Hierarchical clustering analysis heatmap of non-volatile compounds category in five series Baijiu
聚类图中横向为样品名称，纵向为非挥发性化合物类别信息，Group为分组，不同颜色为不同相对含量标准化处理后得到的不同数值进行填充的颜色（红色代表高含量，绿色代表低含量），下同。
图4 基于非挥发性化合物的五种系列白酒层次聚类分析热图
Fig.4 Hierarchical cluster analysis heatmap of five series Baijiu based on non-volatile compounds
由图3可知，图中左侧的聚类线为非挥发性化合物类别聚类线，图中上方的聚类线为样品聚类线。 从化合物类别聚类分析热图可知，五粮液白酒在图中红色区域最多，绿色区域最少，其次为五粮春白酒，五粮特曲白酒在图中绿色区域最多，红色区域最少，说明五粮液白酒含有的化合物类别最丰富，其次是五粮春白酒，五粮特曲白酒含有的化合物类别最少，5款五粮液系列白酒中含有的化合物类别存在显著差异，五粮液和五粮春的脂类物质含量显著高于五粮醇、五粮特曲和五粮头曲三款白酒。 五粮醇的生物碱类，五粮特曲的酚酸类，五粮头曲的有机酸类含量比较多。白酒中非挥发性化合物类别与白酒品鉴所呈现出的口味具有一定的相关性，可以侧面反映白酒的品质。
由图4可知，五粮液白酒在图中的红色区域最多，其次为五粮春白酒和五粮头曲白酒，五粮醇白酒在图中绿色区域最多，其次为五粮特曲白酒，说明不同五粮系列化合物含量排序为五粮液＞五粮春＞五粮头曲＞五粮特曲＞五粮醇。 从聚类分析热图整体颜色角度判断可以将5种五粮液系列白酒明显区分开，五粮液和五粮春聚为一类，五粮醇、五粮特曲和五粮头曲聚为一类。
2.4 重复相关性评估
通过样品之间的相关性分析可以观察组内样品之间的生物学重复。同时组内样品相对组间样品的相关系数越高，获得的差异代谢物越可靠。将皮尔逊相关系数r作为生物学重复相关性的评估指标。皮尔逊相关系数利用R软件的内置cor函数计算，|r|越接近1，说明两个重复样品相关性越强。样品间相关性分析结果见图5。由图5可知，样品的生物学重复的皮尔逊相关系数均＞0.98，说明两个重复样品相关性强。
图5 样品间相关性分析结果
Fig.5 Correlation analysis results between samples
纵向和对角线上分别代表不同样品的样品名称，不同的颜色代表不同的皮尔逊相关系数大小，颜色越红代表正相关性越强，方格内数据表示两个样品之间的相关性系数大小。
2.5 差异化合物分析结果
对5款五粮液白酒两两之间的差异显著化合物进行统计，结果见表2。
表2 差异化合物数目统计结果
Table 2 Statistics results of the number of differential compounds
差异比较组信息差异显著化合物数目/种下调化合物数目/种上调化合物数目/种BJ1/BJ2 BJ1/BJ3 BJ1/BJ4 BJ1/BJ5 BJ2/BJ3 BJ2/BJ4 BJ2/BJ5 BJ3/BJ4 BJ3/BJ5 BJ4/BJ5 143 63 135 144 116 44 66 114 127 48 107 42 108 97 28 20 21 82 78 17 36 21 27 47 88 24 45 32 49 31
由表2可知，五粮液和五粮醇的差异显著化合物数目是143种，其中107种化合物在五粮液中的含量显著高于五粮醇（下调），36种化合物的含量显著低于五粮醇（上调）；五粮液和五粮春的差异显著化合物数目是63种，其中42种化合物在五粮液中的含量显著高于五粮春，21种化合物的含量显著低于五粮春；五粮液和五粮特曲的差异显著化合物数目是135种，其中108种化合物在五粮液中的含量显著高于五粮特曲，27种化合物的含量显著低于五粮特曲；五粮液和五粮头曲的差异显著化合物数目是144种，其中97种化合物在五粮液中的含量显著高于五粮头曲，47种化合物的含量显著低于五粮头曲；五粮醇和五粮春的差异显著化合物数目是116种，其中28种化合物在五粮醇中的含量显著高于五粮春，88种化合物的含量显著低于五粮春；五粮醇和五粮特曲的差异显著化合物数目是44种，其中20种化合物在五粮醇中的含量显著高于五粮特曲，24种化合物的含量显著低于五粮特曲；五粮醇和五粮头曲的差异显著化合物数目是66种，其中21种化合物在五粮醇中的含量显著高于五粮头曲，45种化合物的含量显著低于五粮头曲；五粮春和五粮特曲的差异显著化合物数目是114种，其中82种化合物在五粮春中的含量显著高于五粮特曲，32种化合物的含量显著低于五粮特曲；五粮春和五粮头曲的差异显著化合物数目是127种，其中78种化合物在五粮春中的含量显著高于五粮头曲，49种化合物的含量显著低于五粮头曲；五粮特曲和五粮头曲的差异显著化合物数目是48种，其中17种化合物在五粮特曲中的含量显著高于五粮头曲，31种化合物的含量显著低于五粮头曲。五粮液中差异显著化合物数目显著高于五粮醇、五粮特曲和五粮头曲，与五粮春的差异显著化合物数目较少；五粮春与五粮醇、五粮特曲和五粮头曲的差异显著化合物数目较多，与五粮液的差异显著化合物数目较少；五粮醇与五粮液和五粮春的差异显著化合物数目较多，与五粮特曲和五粮头曲的差异显著化合物数目较少；五粮特曲与五粮液和五粮春的差异显著化合物数目较多，与五粮醇和五粮头曲的差异显著化合物数目较少；五粮头曲与五粮液和五粮春的差异显著化合物数目较多，与五粮醇和五粮特曲的差异显著化合物数目较少。
3 结论
白酒酿造企业不同系列产品细分不仅是市场发展的趋势，同时也丰富了消费者的选择。 本研究利用非靶向代谢组学方法研究五粮液（五粮液、五粮醇、五粮春、五粮特曲和五粮头曲）5个系列白酒非挥发性组分的差异。结果表明，不同五粮液白酒检出非挥发性化合物的数量和组成存在差别，差异性分析结果表明，从总体看，五粮液白酒中差异显著化合物含量依次为五粮液＞五粮春＞五粮头曲＞五粮醇＞五粮特曲。在第一主成分上，五粮液和五粮春两款白酒明显区别于五粮醇、五粮特曲和五粮头曲三款白酒。由聚类分析可知，五粮液白酒含有的化合物类别最丰富，其次是五粮春白酒，五粮液和五粮春聚为一类，五粮醇、五粮特曲和五粮头曲聚为一类。白酒中的微量成分物质不仅赋予了白酒重要的特征风味与品质，同时也让白酒具有了一定的功能，因此关于白酒微量成分的深入研究将为中国白酒风味与健康双导向酿造提供重要的技术保证，提升白酒健康的科学内涵，对于白酒品质与安全的提升，以及传统白酒酿造产业的技术升级都具有重要的意义。
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