1,2-丙二醇，无色粘稠液体，具有吸湿性，几乎无色无味，广泛应用于食品[1-3]、化妆品[4-5]、制药[6-7]和烟草等行业[8-11]，在兽药生产和饲料工业[12]中，常被用作溶剂或稳定剂。在食品行业，根据国家明确规定，1,2-丙二醇在糕点和生湿面制品中允许作为添加剂使用，也可以用作香精香料的溶剂，并限定了使用范围[13-14]。 纯牛乳以生牛乳为原料，不添加任何辅料及食品添加剂[15-16]。 随着人们生活水平的不断提高，牛乳已经成为人们日常饮食中的重要组成部分，因此，对其质量安全性的关注度也越来越高。市场监管部门在食品抽检中发现，某品牌生产的纯牛奶中检出丙二醇[17]，引起人们和相关部门的高度关注。因1,2-丙二醇在人体内大约有45%会经过肾脏排出体外，其余的则在体内代谢为乳酸，如果长期大量食用含有1,2-丙二醇的牛奶，产生的乳酸不能及时排出，就会在血液和肾脏累积，从而导致中毒，影响神经系统，造成呼吸变缓、心率降低、失去意识等[18-20]。因此，为保障人们的身体健康，对牛乳中1,2-丙二醇的含量进行监控有着重要意义。
目前，1,2-丙二醇的检测方法有核磁共振波谱法（nuclear magnetic resonance，NMR）[21]、气相色谱法（gas chromatography，GC）[22-24]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[25]、气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）[26-28]。 其中核磁共振仪成本比较高，该仪器的普及率较低，导致核磁共振波谱法不易推广；气相色谱法和高效液相色谱法抗干扰能力差，尤其是牛乳基质比较复杂，存在较多的干扰物质，影响目标物的分析灵敏度；气相色谱-串联质谱法抗基质干扰能力较强，灵敏度较高。本研究在SN/T 5112—2019《进出口食用动物、饲料丙二醇含量测定气相色谱法和气相色谱-质谱法》基础上，通过对不同前处理方法和仪器条件进行优化，旨在建立一种简单高效、准确性高的测定牛乳中1,2-丙二醇的GC-MS方法，以期为乳品质量控制提供一定的技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
巴氏杀菌乳、灭菌乳：市售。
1,2-丙二醇标准品（纯度≥98.0%）：德国Dr.Ehrenstorfe公司；乙腈、乙醇（均为色谱纯）、0.22 μm有机针式滤膜：上海安谱公司；无水硫酸钠（分析纯）：天津博迪化工有限公司；无水硫酸镁（分析纯）：天津鼎盛鑫化工有限公司；分散固相萃取试剂盒[含150 mg乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（ethylenediamine-N-propylsilane silica gel，PSA）、150 mg十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、900 mg无水硫酸镁（MgSO4）]：美国安捷伦科技有限公司。
1.2 仪器与设备
8890-5977C气相色谱-质谱联用仪、VF-1701毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-200毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦科技有限公司；3-20R高速台式冷冻离心机：湖南可成仪器设备有限公司；MS3 basic涡旋振荡器：德国IKA公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
1,2-丙二醇标准储备液（10 mg/mL）：准确称量0.25 g（精确到0.000 01 g）1,2-丙二醇标准品到25 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度。
1,2-丙二醇标准工作液（100 μg/mL）：准确吸取0.1 mL 1,2-丙二醇标准储备液（10 mg/mL）于10 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度。
1.3.2 牛乳中1,2-丙二醇含量的测定
（1）样品前处理
取牛乳试样2 g（精确到0.1 mg），加入8 mL提取试剂乙腈，涡旋振荡5 min，超声提取5 min，15 000 r/min、0～4 ℃离心5 min，移取4 mL上清液到15 mL的分散固相萃取试剂盒中，振荡5 min，10 000 r/min、0～4 ℃离心5 min，移取1.0 mL上清液过0.22 μm滤膜，供GC-MS分析。
（2）气相色谱条件
DB-WAX毛细管色谱柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度230 ℃；载气为高纯氦气（He）（纯度＞99.999%），流速1.0 mL/min；进样体积1 μL；进样方式为分流进样，分流比10∶1；升温程序为初始温度为50 ℃，保持1 min，然后以15 ℃/min升温至170 ℃，保持3 min，再以20 ℃/min升温至230 ℃，保持3 min。
（3）质谱条件
电子电离（electronionization，EI）源；离子源温度230℃；电离能量70 eV；接口温度240 ℃；扫描方式：选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）模式；其他质谱参数见表1。
表1 牛乳中1,2-丙二醇测定质谱参数
Table 1 Mass spectrometry parameters for the determination of 1,2-propanediol in milk
化合物保留时间/min定性离子（m/z）1,2-丙二醇7.8945*6131定量离子（m/z）定性离子（m/z）
（4）定性定量方法
根据目标物的保留时间和离子的相对丰度定性。外标法定量，即测得样液中目标物的峰面积，根据标准曲线计算目标物的质量浓度。
1.3.3 前处理条件优化
依次考察不同提取试剂（乙醇、乙腈）和不同净化方式（无水硫酸钠、无水硫酸镁、固相萃取试剂盒）对牛乳中1,2-丙二醇回收率的影响。
1.3.4 色谱条件优化
依次考察不同色谱柱[VF-1701（30m×0.25mm，0.25μm）、DB-200（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）]和不同分流比（5∶1、10∶1、20∶1、30∶1）对1,2-丙二醇检测结果的影响。
1.3.5 基质效应分析
选择无1,2-丙二醇的牛乳样品，按照1.3.2的方法对样品进行前处理，得到空白基质溶液。 分别使用空白基质溶液和乙腈为稀释液，移取适量的100 μg/mL的1,2-丙二醇标准工作溶液，配制成质量浓度为1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的系列标准工作液，按上述色谱条件进行测定，以1,2-丙二醇响应峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标分别绘制基质标准曲线和溶剂标准曲线。通过基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率，计算基质效应（matrix effect，ME）[29-30]，其计算公式如下：
1.3.6 方法学考察
检出限和定量限：以被测化合物定量离子3倍信噪比（S/N）计算检出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比（S/N）计算定量限（limit of quantitation，LOQ）。
回收率及精密度试验：称取无1,2-丙二醇牛乳试样，添加0.010 g/kg、0.020 g/kg、0.100 g/kg 3个水平质量浓度的1,2-丙二醇，每个水平重复试验6次，涡旋混匀后，采用1.3.2中的前处理方法，使用GC-MS测定样液中1,2-丙二醇含量，计算回收率和相对标准偏差（relative standard deviations，RSD），回收率计算公式如下：
式中：X1为试样中1，2-丙二醇检测含量，g/kg；X0为试样中1,2-丙二醇理论含量，g/kg。
1.3.7 实际样品测定
利用本研究建立的前处理方法和仪器方法对100批市售牛乳进行检测。
1.3.8 数据处理使用安捷伦MassHunter12.1软件采集数据，Microsoft Excel 2016软件对回收率及相对标准偏差等数据进行处理，采用Origin 8.0绘图。
2 结果与分析
2.1 前处理方法的选择
2.1.1 提取试剂的选择
1,2-丙二醇分子结构中1,2位上各有一个羟基，使得丙二醇具有显著的极性，能够与水、醇及多种有机试剂混溶，因此选择极性有机试剂更有利于1,2-丙二醇的提取。又因牛乳的基质成分中含有大量的蛋白质、脂肪、碳水化合物等，选用的提取试剂同时需要将这些复杂的基质成分去除，综合以上原因，研究乙醇和乙腈作为提取试剂的提取和净化效果差异，在同等条件下进行相同浓度加标回收率实验。乙醇和乙腈体系均能沉淀蛋白等杂质，离心分离得到澄清的上清液，上清液直接使用GC-MS检测。 结果显示，乙醇为提取试剂时，目标物的回收率为93%，乙腈为提取试剂时回收率为95%，回收率结果并无显著差异。 但是经过连续数日的检测，发现使用乙醇为提取试剂的样品，静置几小时后会有大量白色固体析出（图1），析出的白色固体物质导致仪器和色谱柱污染，尤其进样针污染较严重，甚至导致进样针无法正常抽取样品。与乙醇形成的沉淀相比，乙腈形成的沉淀更为致密，且静置后无任何固体物质析出，更适合日常监督检测。因此选用乙腈作为提取试剂。
图1 不同溶剂提取牛乳基质的析出状态
Fig.1 Precipitation state of milk matrix after extraction with different solvents
乙醇体系（左）；乙腈体系（右）。
2.1.2 净化方式的选择
分析对比了无水硫酸钠、无水硫酸镁、固相萃取试剂盒3种常用净化方式对牛乳中1,2-丙二醇回收率结果的影响，结果见图2。 由图2可知，采用无水硫酸钠、无水硫酸镁的净化方式，1,2-丙二醇回收率分别为113.6%和110.0%，其原因可能是无水硫酸钠、无水硫酸镁可以除去共萃取物中的水分及水溶性物质等杂质，但是对于糖类及脂肪酸等净化效果不佳。采用分散固相萃取试剂盒净化方式回收率为100.6%，净化效果最优，分散固相萃取试剂盒包含无水硫酸镁、PSA、C18，可以有效地除去上清液共萃取物中水分、糖类、脂肪酸等杂质，对上清液共萃取物中存在的杂质净化相对比较全面。 因此，选择最优的净化方式为分散固相萃取试剂盒。
图2 不同净化方式对1,2-丙二醇回收率的影响
Fig.2 Effects of different purification methods on recovery rates of 1,2-propanediol
2.2 色谱柱的选择
1,2-丙二醇为极性化合物，在弱极性HP-1和DB-5色谱柱上基本不出峰，无法保留。 本研究主要考察了VF-1701（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-200（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）三种极性色谱柱。VF-1701是由14%氰丙基/苯基和86%聚二甲基硅氧烷固定相组成，主要用于分析农药、除草剂以及芳氯物等。DB-200是一款（35%-三氟丙基）-甲基聚硅氧烷色谱柱，该色谱柱是分析难以分离的位置异构体的理想选择，恒温操作温度上限和程序升温温度上限分别为300 ℃和320 ℃，更有利于高沸点干扰物的去除。 DB-WAX是一款强极性聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）色谱柱，是分析食物、香料以及风味剂的理想选择，高柱间重现性，在柱流失、灵敏度和柱效方面都经过了最严格的行业指标测试。比较3种色谱柱对1,2-丙二醇峰型的影响，结果见图3。 由图3可得，1,2-丙二醇的极性较强，3款色谱柱中极性相对较弱的VF-1701色谱柱可以出峰，但是存在峰型差且灵敏度较低等缺点；中等极性的DB-200色谱柱峰型较VF-1701色谱柱有明显改善，但是色谱峰拖尾严重；耐溶剂冲洗，极性最强的DBWAX色谱柱，可获得尖锐且对称的色谱峰。 因此，选择最适色谱柱为DB-WAX色谱柱。
图3 1,2-丙二醇在不同色谱柱条件下的色谱图
Fig.3 Chromatograms of 1,2-propanediol on different columns
A为VF-1701色谱柱；B为DB-200色谱柱；C为DB-WAX色谱柱。
2.3 分流比优化
在检测中获得合适的分流比，需要综合考虑多个因素，包括样品性质、目标物的分离效果和灵敏度、杂质影响等，合适的分流比可以提高分析效率，获得可靠的分析结果。对于高浓度或者高灵敏度的样品，若分流比过小，会出现色谱峰过宽或者重叠的现象，甚至会导致进入色谱柱和质谱检测器的样品量过载。反之，若分流比过大，进入色谱柱的样品量过少，虽然可以获得比较好的分离度，但目标物灵敏度过低，从而影响分析结果的准确性。因此，本研究主要考察了1 μg/mL和50 μg/mL质量浓度下分流比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1对1,2-丙二醇检测效果的影响，结果见图4。
图4 1,2-丙二醇在不同分流比条件下的色谱图
Fig.4 Chromatograms of 1,2-propanediol on different split ratios
A为分流比5∶1；B为分流比10∶1；C为分流比20∶1；D为分流比30∶1。
由图4可知，采用分流比5∶1时，高浓度的1,2-丙二醇色谱峰峰宽较大，峰型对称性较差；采用分流比20∶1时，低浓度的定性离子的色谱峰响应值较小，影响定性判断的准确性；采用分流比30∶1时，不仅定量离子色谱峰响应值太小，而且可能增加分流歧视效应，从而影响定量分析的准确性。当采用分流比10∶1时，质量浓度为1 μg/mL和50 μg/mL的1,2-丙二醇均可以获得尖锐且对称的定量和定性离子色谱峰。因此，确定最优分流比为10∶1。
2.4 基质效应考察
基质效应是在检测分析过程中，除分析物以外的组分对分析过程的影响，使用质谱检测外标法定量，基质效应是一个重要的考察因素。基质效应通过基质抑制或基质增强影响目标化合物的准确性，基质效应越接近100%，则基质效应对检测结果的影响越小[31]。当ME＞100%称为基质增强效应，当ME＜100%时称为基质抑制效应，当ME在80%～120%之间称为弱基质效应，受基质效应影响不显著；ME在70%～80%之间和120%～130%之间称为较强基质效应，受基质效应影响较显著，在以上范围以外的称为强基质效应，受基质效应影响强显著[32]。 分别对巴氏杀菌乳基质和灭菌乳基质进行了基质效应评价，结果表明，巴氏杀菌乳的ME为92%，灭菌乳的ME为96%，ME均在80%～120%之间，受基质效应影响不显著。因此，可以采用溶剂标准曲线进行外标法定量。
2.5 方法的标准曲线回归方程、线性范围、检出限和定量限
采用乙腈配制质量浓度为1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的标准系列溶液，以峰面积（y）为纵坐标，1,2-丙二醇质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，标准曲线回归方程为y=4 394.03x+1 419.85，相关系数R2=0.999 85＞0.999，说明1,2-丙二醇在1～50 μg/mL范围内线性关系良好，满足GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》[33]中相关要求。方法的LOD为0.005 g/kg，LOQ为0.01 g/kg，可用于牛奶中1,2-丙二醇的定量检测。
2.6 方法的加标回收率和精密度实验
在无1,2-丙二醇的巴氏杀菌乳和灭菌乳样品中分别添加0.010 g/kg、0.020 g/kg、0.100 g/kg 3个水平质量浓度的1,2-丙二醇标准溶液，进行3个质量浓度水平的加标回收率实验，每个水平平行测定6次。计算每个质量浓度水平的平均回收率和精密度实验结果的RSD，结果见表2。
表2 牛乳中1,2-丙二醇的加标回收率和精密度实验结果
Table 2 Experimental results on the spiked recovery rate and precision of 1,2-propanediol in milk
基质添加质量浓度/（g·kg-1）平均回收率/%精密度实验结果RSD/%巴氏杀菌乳灭菌乳0.010 0.020 0.100 0.010 0.020 0.100 94.45 96.23 93.67 100.67 97.64 98.31 2.00 1.23 1.55 2.95 3.91 3.37
由表2可知，巴氏杀菌乳和灭菌乳的平均回收率在93.67%～100.67%，精密度实验结果RSD在1.23%～3.91%，回收率及精密度均满足GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》[33]相关要求，表明该方法具有良好的准确性及重复性。
2.7 实际样品测定
利用本研究建立的气相色谱-质谱法对100批市售巴氏杀菌乳和100批市售灭菌乳进行检测，结果发现，1,2-丙二醇均未检出。 虽然当前抽检的样品均没有检出，但是会持续对该项目进行监督检测，以降低食品安全风险。
3 结论
本研究通过对不同提取试剂、净化方式、色谱柱及分流比的优化，建立了GC-MS技术测定牛乳中1,2-丙二醇残留的检测方法。使用乙腈提取、分散固相萃取法净化作为最佳的前处理条件，选择DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25）分离，分流比为10∶1，GC-MS检测，外标法定量。 该方法条件下，牛乳中1,2-丙二醇在1～50 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（R2）＞0.999，检出限为0.005 g/kg，定量限为0.01 g/kg，在0.010 g/kg、0.02 g/kg、0.100 g/kg质量浓度水平下的加标回收率为93.67%～100.67%，精密度实验结果的相对标准偏差为1.23%～3.91%。说明该方法前处理简便、抗基质干扰能力强、准确度高、对仪器的污染损害小，适用于牛乳中1,2-丙二醇的日常检测，具有一定的推广价值。
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