白酒是中国传统的蒸馏酒,主要原料为粮谷[1],拥有2 000多年的历史,是世界六大蒸馏酒之一。浓香型白酒是中国四大基本香型白酒之一,以其独特的酿造工艺和绵甜甘冽、窖香浓郁的特点而深受消费者的喜爱[2]。除了窖香外,浓香型白酒还具有粮香、糟香、曲香和陈香等多种香气。 这些香气相互交织,共同构成了浓香型白酒丰富而复杂的香气体系,香气浓烈且持久。 浓香型白酒还可以分为两大流派,即江淮派淡雅浓香型和四川浓香型[3]。由于地理环境和生产工艺等差异,这两个流派的浓香型白酒在香气和口感上存在明显差异,主要由白酒中的微量成分导致[4]。这种风味密码的破译,高度依赖检测技术对复杂组分的捕获能力。
随着检测技术的发展,白酒中有报道的挥发性成分已有1 800多种[5]。 固相微萃取-气相色谱质谱联用技术(solidphase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)是食品挥发性化合物检测中最常用的技术,适用于挥发性、半挥发性和热稳定性较好的化合物分析[6]。 但是一些低沸点极性挥发性化合物难以通过GC-MS技术进行检测[7]。 气相色谱-离子迁移谱技术(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)结合了GC保留时间和IMS的迁移率差异,实现了对复杂样品中各成分的双重分离,具有响应速度快、灵敏度高、操作方便和成本低等优点[8],但其定量准确性受离子化条件、化合物聚合状态等因素影响较大,对于部分化合物(如短链酯、醛类)与其他检测技术的定量一致性较差。
挥发性化合物检测技术的选择直接决定数据完整性与分析可靠性,尤其对于成分复杂、香气层次丰富的浓香型白酒而言,技术适配性更是精准剖析风味物质的关键。SPME-GC-MS和GC-IMS虽已广泛应用于浓香型白酒挥发性指纹图谱构建[9-14],但现有研究多聚焦单一技术的应用效果,对于两种技术在不同挥发性化合物检测中的选择性差异仍缺乏系统性探究。因此,本研究比较了SPME-GCMS和GC-IMS对浓香型白酒挥发性风味物质的检测效果,旨在为浓香型白酒挥发性化合物分析以及全面解析浓香型白酒样品间挥发性风味物质差异提供一定的理论基础。
1.1.1 酒样
10种浓香型白酒:市售,编号YB1~YB6酒样来源于四川省宜宾市、编号MZ1酒样来源于四川省绵竹市、编号LZ1酒样来源于四川省泸州市、编号HZ1酒样来源于安徽省亳州市、编号SQ1酒样来源于江苏省宿迁市,酒样酒精度均为52%vol。
1.1.2 试剂
氯化钠(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;乙醇(色谱纯):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;C7~C30的正构烷烃标准品(均为色谱纯)、4-辛醇(纯度为99%):美国Sigma-Aldrich股份有限公司。
8890-7000D GC-MS仪:美国Agilent公司;50/30 μm DVB/CWR/PDMS固相微萃取头:美国Supelco公司;G.A.S.FlavourSpecRGC-IMS:德国Odournet公司。
1.3.1 SPME-GC-MS分析
用超纯水将每种酒液稀释至乙醇含量为10%。取5 mL的稀释样品放入20 mL顶空瓶中,再加入100 μL的内标物(1 101mg/L的4-辛醇),加入1.5 gNaCl混合均匀,用于SPMEGC-MS分析。
顶空固相微萃取条件:50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头在气相色谱进样口270 ℃老化1 h。装有样品的顶空瓶,在50 ℃摇床内平衡10 min,用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头萃取45 min,然后将萃取头置于GC进样口中,250 ℃下解吸5 min后进样。
GC条件:HP-5毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序:起始温度50 ℃,保持5 min;以4 ℃/min升至230 ℃,保持5min。不分流进样模式下,载气(氦气)为恒流1.0mL/min(纯度不小于99.999%);进样口温度250 ℃。
MS条件:电子电离(electron ionization,EI)离子源、电子能量为70 eV、离子源温度230 ℃、四极杆温度150 ℃、传输线温度280 ℃、质量扫描范围35~350 m/z。 扫描方式为全扫描模式。
定性定量分析:对各化合物的保留指数(retention index,RI)进行计算,根据美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology,NIST)17.L标准谱库检索,以匹配度≥80%进行定性,同时采用内标法对酒样中各物质的含量进行半定量分析。
1.3.2 GC-IMS分析
取0.1 mL酒样加0.9 mL水稀释,置于20 mL顶空瓶中,每个样品做3个平行实验。
样品孵化条件:孵化温度60 ℃;孵化时间10 min;孵化转速500 r/min;顶空进样针温度65 ℃;进样量100 μL。 GC条件:MXT-WAX色谱柱(30 m×0.53 mm,1 μm);色谱柱温度60 ℃;载气N2(纯度≥99.99%);初始流速2.0 mL/min,保持10 min;在2~10 min内线性增至10 mL/min,10~20 min内线性增至100 mL/min,保持10 min。 IMS条件:漂移管长度9.8 cm,管内线性电压400 V/cm,漂移管温度45 ℃,漂移气为N2(纯度≥99.99%),漂移气流速150 mL/min。
通过VOCAL应用软件内置的NIST 17.L数据库和IMS数据库对样品中的挥发性物质进行定性定量分析。
1.3.3 数据处理
GC-IMS指纹图谱通过VOCAL应用软件生成;热图、韦恩图和主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)分析通过OmicShare在线分析制图。
通过SPME-GC-MS检测到10种浓香型白酒中的各挥发性风味化合物相对含量见图1。 由图1a可知,利用SPMEGC-MS技术在10个浓香型白酒样品中共检测到59种挥发性风味成分,其中包括酯类43种、醛类5种、醇类3种、酮类2种、酸类3种、萜烯类1种、含苯化合物2种。 不同样品之间挥发性化合物具有较大差异。
图1 SPME-GC-MS测定的浓香型白酒挥发性风味化合物聚类分析热图(a)及不同种类挥发性风味化合物含量(b)
Fig.1 Cluster analysis heatmap of volatile flavor compounds in strongflavor Baijiu determined by SPME-GC-MS (a) and contents of different categories of volatile flavor compounds (b)
总体来说宜宾的6个样品的挥发性化合物含量较其他地区更高。四川宜宾YB6样品中的酯类化合物种类最为丰富,以己酸酯、庚酸酯和戊酸酯等直链脂肪酸酯为主。江淮地区的SQ1和HZ1样品中的酯类含量也很丰富,但是以长链的脂肪酸酯和支链脂肪酸酯为主。酯类化合物在白酒中能够赋予其果香、花香、甜味和奶味等风味物质,不同浓度与类别的酯类化合物赋予白酒独特的香气特征[15],对白酒香气影响较大。 从SPME-GC-MS的检测结果来看,戊酸乙酯、己酸丁酯、辛酸乙酯、己酸己酯在10种浓香型白酒中有较高的相对含量,这与其他关于浓香型白酒的报道是一致的[4]。 不同地区浓香型白酒酯类化合物种类分布的差异可能与生产过程中使用的不同蒸馏工艺有关[16]。
酸类物质是影响白酒口感和后味的主要因素,对甜味也有一定的修饰作用[17]。SPME-GC-MS在10个样品种共检测到了3种挥发性酸类物质,即己酸、癸酸和顺-5-十二碳烯酸。浓香型白酒中常见的挥发酸主要为丁酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等[18]。但是本研究中只检测到了含量较高的己酸和少量癸酸,可能与所用的色谱柱有关。 挥发酸属于极性较强的化合物,在HP-5色谱柱上的保留时间短且峰型较宽,影响了挥发酸的检出率和灵敏度。
由图1b可知,SPME-GC-MS在10种浓香型白酒中检出的化合物以酯类为主,约占总量的82.3%~90.8%。 其次酸类物质约占总量的4.8%~10.2%,醇类物质约占总量的1.6%~9.3%。除酯类、酸类和醇类外还检出了少量的酮类、醛类和萜烯类等化合物,但是这些化合物占比很少,不超过总量的0.2%。
综上,SPME-GC-MS技术可高效检出大量酯类物质,能检出含量较高的醇类化合物,但对酮类、醛类、萜烯类等微量成分的检出率较低。
GC-IMS生成的图谱包含两个维度(GC保留时间和IMS漂移时间),差异谱图可以更直观地反映10种浓香型白酒挥发性化合物的差异,10种浓香型白酒的GC-IMS差异化合物图谱见图2。 由图2可知,10种浓香型白酒的挥发性化合物在俯视图中由于保留时间、漂移时间和离子峰强度的不同,导致所形成的点位置与颜色深浅不同。 大部分挥发性化合物的信号保留时间处于500~900 s之间,但是个别挥发性化合物信号保留时间处于300~500 s之间,可能是由于这些物质极性相对较高,导致这些挥发性化合物在极性柱上保留时间比非极性化合物短[20]。根据红色和蓝色出现的位置和深浅可以看出,YB2与YB5组成分最为相似,与LZ1和YB6的差异最为明显。
图2 10种浓香型白酒的挥发性风味物质GC-IMS二维差异图谱
Fig.2 Two-dimensional differential spectra of volatile flavor compounds in 10 kinds of strong flavor Baijiu by GC-IMS
以YB2样品作为参考,蓝色表示该物质浓度低于参考样品,红色表示该物质浓度高于参考样品,颜色越深表示差异越大[19]。
10种浓香型白酒中挥发性化合物的GC-IMS定性结果见表1。由表1可知,通过GC-IMS共鉴定出47种挥发性化合物(同一化合物的D和M型视为一种),其中酯类21种、醛类7种、醇类6种、酮类6种、萜烯类4种、吡嗪类2种、含硫化合物1种。
表1 10种浓香型白酒中挥发性风味化合物的GC-IMS定性结果
Table 1 Qualitative results of volatile flavor compounds in 10 kinds of strong-flavor Baijiu by GC-IMS
序号化合物CAS保留指数保留时间/s漂移时间/ms 1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 123-29-5 123-29-5 106-32-1 626-82-4 141-78-6 105-37-3 110-19-0 105-54-4 7452-79-1 106-30-9 123-66-0 539-82-2 142-92-7 106-30-9 823-22-3 868-57-5 628-63-7 109-21-7 626-77-7 109-60-4 109-94-4 2198-61-0 2639-63-6 1 518.1 1 516.5 1 444.7 1 423.3 898.5 969.4 1 028.1 1 050.7 1 077.9 1 353.2 1 247.6 1 146.8 1 287.4 1 309.1 1 158.5 1 023.8 1 184.1 1 230.5 1 337.8 987.8 848.8 1 463.1 1 423.7 991.81 988.36 846.53 808.30 182.07 216.35 254.36 272.30 295.67 694.69 523.19 371.91 597.34 631.63 387.27 251.01 422.92 494.16 672.00 226.26 161.35 880.72 809.00 1.56 2.15 2.03 2.04 1.34 1.45 1.61 1.56 1.65 1.92 1.80 1.68 1.90 1.40 1.52 1.54 1.76 1.82 1.91 1.47 1.22 2.14 1.48 24 25 26 27 28 29 30 116-09-6 107-87-9 108-10-1 108-10-1 591-78-6 821-55-6 110-43-0 705.9 999.5 1 027.8 1 003.4 1 097.6 1 384.2 1 192.8 113.99 233.24 254.09 235.98 313.86 742.77 435.73 1.23 1.37 1.47 1.48 1.50 1.41 1.63 31 32 33 34 35酯类壬酸乙酯-D壬酸乙酯-M辛酸乙酯己酸丁酯乙酸乙酯丙酸乙酯乙酸异丁酯丁酸乙酯2-甲基丁酸乙酯庚酸乙酯-D己酸乙酯戊酸乙酯乙酸己酯庚酸乙酯-M δ-己内酯2-甲基丁酸甲酯乙酸戊酯丁酸丁酯己酸丙酯乙酸丙酯甲酸乙酯己酸异戊酯丁酸己酯酮类羟基丙酮2-戊酮4-甲基-2-戊酮-D 4-甲基-2-戊酮-M 2-己酮2-壬酮2-庚酮醛类2-甲基丙醛戊醛丁醛辛醛苯乙醛78-84-2 110-62-3 123-72-8 124-13-0 122-78-1 808.9 994.2 858.2 1 287.2 1 035.3 146.44 229.81 165.10 597.01 259.90 1.28 1.43 1.27 1.82 1.26
续表
序号化合物CAS保留指数漂移时间/ms 36 37保留时间/s糠醛庚醛醇类2-丁醇(Z)-3-壬烯-1-醇2-丙醇1-丙醇4-甲基戊醇1-戊烯-3-醇萜烯类α-蒎烯柠檬烯β-蒎烯(Z)-β-法尼烯吡嗪类2,5-二甲基吡嗪2-乙基-3-甲基吡嗪硫化物二甲基二硫醚1998/1/1 111-71-7 1 473.3 1 215.6 900.40 470.26 1.33 1.34 38 39 40 41 42 43 78-92-2 10340-23-5 67-63-0 71-23-8 626-89-1 616-25-1 1 015.4 1 158.9 945.7 1 014.8 1 309.6 1 112.2 244.71 387.70 204.21 244.30 632.33 330.09 1.16 1.42 1.22 1.24 1.65 1.35 44 45 46 47 80-56-8 138-86-3 127-91-3 28973-97-9 1 013.5 1 196.2 1 131.2 1 451.8 243.36 440.70 352.40 859.50 1.21 1.72 1.71 1.49 48 49 123-32-0 15707-23-0 1 310.1 1 004.9 633.02 237.10 1.51 1.59 50 624-92-0 1 120.9 340.18 1.14
10种浓香型白酒挥发性风味化合物GC-IMS指纹图谱见图3。对所有峰的指纹图谱进行对比可以看出,宜宾产地的YB6样品中所含挥发性化合物种类和含量最为丰富。四川绵竹的样品MZ1和四川泸州的样品LZ1所含挥发性化合物种类最少。但是LZ1的辛酸乙酯、δ-己内酯和糠醛含量较其他样品更高。辛酸乙酯具有类似菠萝的甜香,δ-己内酯具有椰子的香气,而糠醛具有类似杏仁和焦糖样香气,表明LZ1样品可能具有更高的焦甜香气,符合泸州浓香型白酒“绵甜甘冽”的风味特征。MZ1的异丁醛、辛醛、庚酸乙酯和二甲基二硫醚的含量较其他样品更高。白酒中低碳链醛类,沸点低,易挥发,在浓香型白酒中有助于丰富酒香的层次感[21]。
图3 10种浓香型白酒挥发性风味化合物GC-IMS指纹图谱
Fig.3 Fingerprints of volatile flavor compounds 10 kinds of strongflavor Baijiu by GC-IMS
综上,GC-IMS具有可视化优势,尤其适合检测低沸点极性物质和酯类化合物,并通过差异谱图直观呈现样品间的化学差异。 但其覆盖范围有限,需与其他技术联用实现更全面的风味物质鉴定。
SPME-GC-MS和GC-IMS两种方法对10种浓香型白酒的挥发性风味化合物检测效果比较结果见图4。
图4 SPME-GC-MS与GC-IMS的挥发性风味化合物测定结果比较
Fig.4 Comparison of detection results of volatile flavor compounds between SPME-GC-MS and GC-IMS
(a)两种方法测得的共有和独有的化合物;(b)两种方法测得的化合物数量比较;(c)两种方法测得的化合物类别数量比较。
由图4a和图4b可知,共检测出95种挥发性风味物质,其中SPME-GC-MS检出59种挥发性风味物质,GC-IMS检出47种挥发性风味物质。两种方法共同检出的化合物11种,为庚酸乙酯、壬酸乙酯、苯乙醛、己酸异戊酯、辛酸乙酯、己酸丁酯、丁酸乙酯、己酸丙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、乙酸己酯。 其中己酸己酯、丁酸异戊酯、辛酸丙酯、己酸异戊酯是白酒中含量最高的化合物[4],可见两种检测方法在主要化合物的检测上具有相似的效果。在对于一些含量较低的化合物的检测上SPME-GC-MS和GC-IMS对挥发性化合物具有不同的选择性。由图4c可知,从化合物的类别上来看,SPME-GC-MS检出的酯类化合物明显多于GC-IMS,但是GC-IMS在非酯类化合物的检出数量上高于SPME-GC-MS,且检测到了一些吡嗪类和含硫化合物,这些杂环类挥发性化合物对白酒的风味具有重要的贡献[21]。对于挥发酸来说,SPME-GC-MS和GC-IMS的检测效果均不佳。 GC-IMS未检测到任何挥发酸,SPME-GC-MS也仅检测到了3种。与已有文献比较,大多数针对白酒的GC-IMS分析结果中挥发酸也较少见,有检出的也多为乙酸等挥发性极强的酸类[22]。近期研究结果表明,挥发酸和挥发性酚类化合物对浓香型白酒的窖泥香气特征有重要贡献[23],但无论是SPME-GC-MS还是GC-IMS都无法有效检测这两类化合物。
对比SPME-GC-MS和GC-IMS检测到的化合物种类可以看出,SPME-GC-MS对分子质量较大的化合物(如长链脂肪酸酯和含苯化合物等)更为灵敏,但对于小分子高挥发性的化合物的检测效果不如GC-IMS。 这一方面可能是因为浓香型白酒中酯类含量较高,在SPME萃取头上具有竞争吸附效应,导致其他化合物的吸附率降低。 另一方面可能由于本实验所用的HP-5色谱柱对一些极性较强的化合物的保留不够;而GC-IMS技术由于采用的是顶空进样,不存在竞争吸附的问题。 GC-IMS的分离和检测温度不超过60 ℃,非高温条件可以尽可能减少副产物的生成,但也限制了高沸点化合物的检测效果,检测到的多为小分子质量且沸点低的化合物(C链大多在C2~C18之间)。并且目前GC-IMS数据库中挥发性化合物的种类相比GC-MS来说不够全面,数据库不完善可能导致部分化合物未被鉴定[24]。
共有化合物在两种检测方法下的定量结果相关性分析结果见表2,通过Pearson相关系数和显著性水平评估方法的一致性。 由表2可知,11种共有化合物中有7种化合物(乙酸己酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、己酸丁酯、辛酸乙酯、己酸异戊酯、壬酸乙酯)存在显著或极显著的相关性,表明两种方法对该化合物定量结果是较为一致的。这可能是因为这些化合物主要为中等链长脂肪酸酯,其结构相对稳定性且挥发性适中。壬酸乙酯在GC-IMS中无论以单体(M)或二聚体(D)形式,均与SPME-GC-MS检测结果有一定一致性。 但是对庚酸乙酯来说,GC-IMS检测到的单聚体(M)含量与SPME-GC-MS定量结果无显著相关性,表明GC-IMS检测结果中单聚体和二聚体的信号强度与含量的关系则相对复杂,需要结合具体化合物进行判断。 SPME-GC-MS和GC-IMS对短链酯(如丁酸乙酯、戊酸乙酯)和醛类(如苯乙醛)的响应缺乏一致性,说明两种方法在检测极性或小分子化合物时可能均存在一定局限性,在应用过程中需要进一步通过标准品加标实验验证其定量的准确性。
表2 两种方法对共有挥发性化合物的定量结果相关性分析
Table 2 Correlation analysis of quantitative results for the common volatile compounds by the two methods
注:“**”表示相关性极显著(P<0.01),“*”表示相关性显著(P<0.05),“ns”表示相关性不显著(P>0.05)。
化合物SPME-GC-MSGC-IMS Pearson相关系数(r)显著性乙酸己酯戊酸乙酯己酸丙酯庚酸乙酯庚酸乙酯己酸丁酯辛酸乙酯己酸异戊酯壬酸乙酯壬酸乙酯丁酸乙酯己酸乙酯苯乙醛乙酸己酯戊酸乙酯己酸丙酯庚酸乙酯-D庚酸乙酯-M己酸丁酯辛酸乙酯己酸异戊酯壬酸乙酯-D壬酸乙酯-M丁酸乙酯己酸乙酯苯乙醛0.861 0.396 0.691 0.836 0.615 0.862 0.790 0.939 0.724 0.706-0.224-0.401-0.065**ns***ns********n s ns ns
通过主坐标分析(PCoA)分别对SPME-GC-MS和GCIMS数据进行可视化,以分析样品间的相似性。 PCoA可以尽可能保持样品在高维度上的距离关系不发生改变[25],不同检测方法对不同浓香型白酒样品的PCoA分析结果见图5。
图5 不同检测方法对不同浓香型白酒样品的主坐标分析结果
Fig.5 Principal coordinate analysis results of different strong-flavor Baijiu samples by different detection methods
由图5可知,SPME-GC-MS和GC-IMS的主坐标分析结果均可以看出产地为四川宜宾的YB1、YB2和YB3的距离在两个PCoA图中都较为接近。YB6与其他的四川宜宾的样品差别较大。 但对于YB4两种分析方法的结果有较大不同。GC-MS技术的结果显示宜宾产地的YB4与YB5样品十分接近,与江苏宿迁的SQ1样品距离较远。 而GC-IMS分析结果显示,YB4与SQ1非常接近。可见两种方法对不同产地的浓香型白酒都具有一定的区分能力,但是并不能完全区分,由于对于化合物的选择性不同,两种分析方法在用作指纹图谱识别样品差异的时候有可能出现不一致的结果。
本研究通过SPME-GC-MS与GC-IMS两种技术,系统解析了10种浓香型白酒的挥发性风味成分差异,揭示了两种技术在检测能力上的互补性。SPME-GC-MS凭借其对非极性长链酯类(如己酸己酯、辛酸乙酯)和含苯化合物的高灵敏度,更适合解析浓香型白酒的主体香气框架;而GC-IMS对低沸点极性物质(如乙酸乙酯、吡嗪类)的快速响应能力,能有效捕捉易被忽略的特征风味组分。 两种方法共检测到95种化合物,其中只有11种为共有成分,表明其在核心风味物质检测上并不一致,对微量成分的选择性差异显著影响指纹图谱的构建。两种技术均未有效检测挥发性酸类,提示未来需优化前处理方法(如衍生化技术)以提升酸性物质的检出率。 GC-IMS在快速区分地域差异及捕捉特征微量成分方面具有独特优势,但对于浓度的响应容易受到多聚体信号的影响,而SPME-GC-MS更适合构建全面的风味物质数据库,对浓度的响应更为稳定。 二者联用不仅能扩大检测范围,还能通过交叉验证提高数据可靠性,为浓香型白酒风味指纹图谱的精准构建及质量控制提供了技术参考。 值得注意的是SPME-GC-MS与GC-IMS两种技术虽然有互补性,但是也存在对高沸点难挥发性化合物的检测盲区,未来研究可进一步结合感官评价与衍生化等方法,深入解析挥发性成分与酒体风格的关联性。
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