酱油在中国已有3 000多年的历史，作为日常食品调味品在东南亚很受欢迎。酱油的风味将直接影响酱油的品质和消费者的喜好。酱油中已鉴定出近300种香气化合物，包括4-乙基-2-甲氧基苯酚、苯乙醛、2,3-二乙基吡嗪、2-苯乙醇、糠醇、2,3-丁二醇、麦芽酚等多种风味成分，可呈焦糖/甜味、烤味、坚果味、熟土豆味和辛辣/烧焦味[1]。关键风味成分来自发酵阶段微生物群的新陈代谢过程所产生的物质[2]。因此，微生物群的构建对于提高酱油的品质至关重要。
酵母抽提物被归类为安全的“食品添加剂”，广泛应用于食品和调味品中。酵母抽提物中的氨基酸作为有机氮的来源，可直接被细菌利用，是影响生物量形成的主要成分，且微生物对氨基酸的利用具有选择性。如丝氨酸促进瑞士乳杆菌的生长，并增加乳酸乳球菌的生物量，但对植物乳植杆菌的生长没有影响，同时增加其产酸能力[3]。此外，细菌在发酵过程中会遇到各种环境胁迫，包括渗透压胁迫、酸胁迫和氧胁迫[4]。在这些条件下，氨基酸有助于特定菌株的抗逆性，例如脯氨酸可以提高嗜盐四球菌的耐盐性[5]。酵母抽提物通常会被直接添加到最终酱油中以增强酱油的风味，然而，其在酱油中的过量添加往往会引入“酵母味”（酸味、刺激性和药味），这可能会对酱油独特风味造成负面影响[6]。使用酵母抽提物氨基酸作为发酵微生物群的调节剂，通过发酵作用自然地改善酱油风味可能是一个更好的酿制方法。
本实验研究了在发酵开始时添加酵母抽提物对发酵微生物群的塑造，微生物群塑造后，核心风味成分和感官品质得到改善，最后从微生物群的代谢途径角度描述了微生物群塑造后风味改善的机制。旨在为发酵优势菌群构建及酱油品质改良技术开发提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
大豆、炒小麦：市售；种曲：广州致美斋食品有限公司；酵母抽提物（Y1、Y2、Y3、Y4、Y5）：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 化学试剂
混合氨基酸标准溶液（纯度≥99.5%），包含17种氨基酸（除Asn、Gln和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）外）：北京索莱宝科技有限公司；338F_806R引物：北京诺禾致源科技股份有限公司；E.Z.N.A® Soil脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Kit：美国奥美嘉生物技术公司；4-羟基-2-甲基-5-乙基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2-methyl-5-ethyl-3（2H）-furanone，HEMF）、2-甲基丁酸乙酯、苯乙醇、3-甲基丁醛、异丁酸丁酯、4-乙基-2-甲氧基苯酚、乙偶姻、乙醇（均为色谱纯）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Illumina NovaSeq 6000高通量测序仪：上海鲸舟基因科技有限公司；LDZM-80KCS-II立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SupelcoA 300氨基酸分析仪：德国membraPure GmbH公司；ZA220R4分析天平：上海赞维衡器有限公司；UV-1800紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；Varioskan LUX多功能酶标仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；PHS-25型实验室pH计：上海电科学仪器股份有限公司；DVB/CAR/PDMS固相微萃取头、萃取手柄：美国Supelco公司；QP-2010 Ultra气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：日本岛津仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酱油样品制备
大豆用水浸润4 h后，在0.1 MPa、110 ℃条件下高压灭菌10 min，冷却至室温后，接种0.3%种曲。将大豆与炒制小麦按照质量比3∶1混合，在发酵箱中30 ℃条件下孵育，8 h后待大曲表面形成白色絮状物，进行第一轮搅拌；14 h后大曲表面被白色均匀覆盖，进行第二轮搅拌；36 h后观察大曲表面完全变为绿色，则制成大曲。将大曲与18 g/100 mL盐水以1∶2的质量比混合，24 h后分别接入大豆质量1%的5种酵母抽提物（Y1、Y2、Y3、Y4、Y5），自然环境[（28±5）℃]下发酵90 d，前10 d每2 d搅拌一次，以后每10 d搅拌一次，直至发酵结束。对应添加的酵母抽提物，酱油样品分别命名为SY1、SY2、SY3、SY4和SY5，不含酵母抽提物的酱油样品为对照（CK）。
1.3.2 酵母抽提物氨基酸组成分析
样品的制备与分离：将5种酵母抽提物（5 g）完全溶解于10 mL超纯水中并置于仪器中。将纱布剪成（2 m×1 m）大小，折叠成6层，将发酵90 d的醪液过滤，得到无悬浮物的液体。然后量取2 mL液体至50 mL离心管中，烘干水分，加入10 mL超纯水，完全溶解，过0.22 μm滤膜收集滤液，再经离子交换柱进行分离后即可制备得到样品。色谱条件：每次进样10 μL，采用荧光检测器，柱温60 ℃，柱后反应温度为135 ℃。
氨基酸含量测定：使用氨基酸分析仪按茚三酮法对游离氨基酸含量（free amino acids，FAA）进行定量分析[7]。脯氨酸（proline，Pro）的茚三酮衍生物在波长440 nm处检测，其他16种氨基酸衍生物在波长570 nm处检测。利用标准曲线计算样品中各氨基酸的含量，以超纯水作为空白对照。
1.3.3 酱油样品理化指标测定
还原糖含量测定：采用3,5-二硝基水杨酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）[8]。可滴定酸、氨基酸态氮、可溶性无盐固形物含量测定：按照GB/T 18186—2000《酿造酱油》。
1.3.4 酱醪样品微生物高通量测序
使用E.Z.N.A® Soil DNA Kit分别从发酵1 d、30 d、90 d的酱醪样品中提取微生物总DNA。以其为模板，使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区[9]。根据Majorbio Bio-Pharm Technology Co.Ltd.的标准方案，将纯化的扩增子在Illumina MiSeq平台上以等摩尔和配对末端测序（2×300）汇集。QIIME软件用于处理测序数据[10]。此外，使用FLASH软件组装成对末端读数。通过UCLUST算法将高质量序列聚类为具有97%序列同一性的操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。Greengenes数据库用于细菌分类。
1.3.5 酱油样品挥发性风味物质测定[11]
样品前处理：将发酵90 d的酱油醪液通过6层纱布过滤，取5 mL滤液于15 mL密闭玻璃瓶中，加入0.9 g NaCl和210 μL 2-辛醇（20 mg/L）（内标溶液），样品用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维在60 ℃条件下平衡15 min后进行连续萃取。
色谱条件：Rtx-5ms色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气（He），恒定流速1.0 mL/min，分流比10∶1。色谱柱初始温度40 ℃保持3 min，以4 ℃/min的速率升温至150 ℃保持1 min，然后以8 ℃/min的速率升温至250 ℃保持6 min。进样温度和离子源温度分别为250 ℃和220 ℃。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电离能量为70 eV，扫描范围为35～500 m/z，扫描速率为3.00 scan/s。通过比较美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）17谱库中的质谱并根据保留指数对各化合物进行定性分析。采用内标法进行定量分析。
1.3.6 酱油样品香气感官评价
招募10名成员（5名男性，5名女性，年龄20～30岁）组成感官评价小组，在专家指导下在符合国际标准测试要求的感官实验室中进行60 h的感官评价训练[12]。采用定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）对发酵90 d的酱油进行香气感官评价。根据感官评价小组的共识、辨别性和再现性，参考酱油中普遍存在的特征香气属性，讨论并确定了感官属性[13]。选择酱油8种传统感官术语（焦糖香、果香、花香、麦芽香、甜香、烟熏香、奶油香和醇香）。以HEMF、2-甲基丁酸乙酯、苯乙醇、3-甲基丁醛、异丁酸丁酯、4-乙基-2-甲氧基苯酚、乙偶姻、乙醇的10倍阈值浓度作为香气属性标准[14]进行评分。评分标准为0（无强度）、1～3（弱）、4～6（中）、7～9（强）和10（非常强）。
根据各酱油样品整体香气的优良情况进行整体香气评分，评分为0～10分，整体香气越佳则分值越高。
1.3.7 统计分析
所有实验样品均进行3次重复，数据采用“平均值±标准差”表示。使用SPSS 20.0软件评估显著性差异（单向方差分析）和斯皮尔曼相关系数，当P＜0.05时表示显著差异，当相关系数|r|＞0.6时表示强相关性。使用Origin2021绘制香气感官评价雷达图。
2 结果与分析
2.1 5种酵母抽提物的氨基酸组成及含量
5种典型市售酵母抽提物的氨基酸组成分析见表1。由表1可知，酵母抽提物Y1、Y2、Y3的碱性氨基酸（组氨酸、精氨酸、赖氨酸）含量显著高于Y4、Y5（P＜0.05）；酵母抽提物Y1的中性-极性氨基酸含量高于Y2和Y3。谷氨酸和丙氨酸其是最重要的两种氨基酸[15-16]，可作为肽聚糖生物合成的前体，故有助于维持细胞稳态和正常生理功能[17]。在所有酵母抽提物样品中，这两种氨基酸的含量都很高，其中酵母抽提物Y5的谷氨酸和丙氨酸含量均最高。
表1 5种酵母抽提物的氨基酸组成及含量
Table 1 Amino acid composition and contents of 5 kinds of yeast extracts
注：不同小写字母表示具有显著差异（P＜0.05）。
氨基酸 分类 Y1 Y2含量/（mg·g-1）Y3 Y4 Y5天冬氨酸谷氨酸丝氨酸组氨酸甘氨酸苏氨酸精氨酸赖氨酸酪氨酸半胱氨酸缬氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸异亮氨酸亮氨酸丙氨酸脯氨酸中性-非极性∶中性-极性∶酸性∶碱性氨基酸酸性酸性中性-极性碱性中性-极性中性-极性碱性碱性中性-极性中性-极性中性-非极性中性-非极性中性-非极性中性-非极性中性-非极性中性-非极性中性-非极性7.57±0.01e 12.37±0.10a 3.15±0.02d 1.47±0.01c 4.01±0.11d 2.71±0.02d 4.33±0.05d 5.31±0.12cd 2.15±0.04d 0.77±0.04cd 4.32±0.14d 1.04±0.02d 3.34±0.08c 3.70±0.08cd 5.79±0.21cd 8.53±0.31a 2.43±0.04c 40∶18∶27∶15 7.06±0.04c 13.58±0.12ab 2.99±0.01bc 1.42±0.01c 3.78±0.05bc 2.60±0.03c 4.15±0.13c 5.12±0.10c 1.98±0.02c 0.69±0.02c 4.19±0.08c 1.00±0.02d 3.27±0.14c 3.56±0.04c 5.38±0.17c 10.01±0.28b 2.20±0.05b 41∶16∶28∶15 7.26±0.05cd 14.37±0.08b 2.93±0.30bc 1.37±0.04b 3.52±0.02b 2.76±0.01d 4.28±0.06cd 4.83±0.09c 1.82±0.11c 0.18±0.02a 4.25±0.09cd 0.89±0.01c 3.29±0.12c 3.55±0.08c 5.38±0.23c 10.26±0.21b 2.03±0.07b 41∶15∶31∶14 5.75±0.01b 19.36±0.11c 2.26±0.04b 0.79±0.03a 2.94±0.05a 1.77±0.01b 3.90±0.07b 2.64±0.11b 1.13±0.04b 0.21±0.03a 2.93±0.11b 0.60±0.01b 1.86±0.03b 2.23±0.06b 2.98±0.12b 18.93±0.34c 2.41±0.04c 44∶11∶34∶11 4.32±0.07a 26.94±0.09d 1.36±0.01a 0.76±0.03a 2.80±0.04a 1.58±0.04a 3.72±0.05a 2.27±0.05a 0.41±0.08a 0.33±0.04ab 2.43±0.10a 0.45±0.02a 1.05±0.05a 1.49±0.02a 1.63±0.07a 19.63±0.33cd 1.82±0.04a 39∶9∶43∶9
2.2 发酵酱醪的微生物群落分析
为了揭示酵母抽提物对发酵酱醪微生物群落内部调控关系的影响，计算不同物种的聚类系数和模块化指数，通过系统发育门构建微生物共生模型，结果见图1。由图1可知，在对照组（CK）、SY1、SY2、SY3、SY4和SY5样品中，分别有54、54、49、52、52和54个菌属构成共生网络。选择连通性较高的节点作为关键物种，它们可影响整个群落的多样性和功能性。变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Frimicutes）在微生物群落中占据优势地位。Proteobacteria和Firmicutes中的魏斯氏菌属（Weissella）、片球菌属（Pediococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、链球菌属（Streptococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属（Enterococ-cus）和四联球菌属（Tetragenococcus）在所有样品中均具有较高的连接度，是影响酱油品质的核心菌属。
图1 添加不同酵母抽提物酱醪微生物菌属间的相关性
Fig.1 Correlation between microbial genera of soy sauce mash with different yeast addition
节点的颜色表示菌门的种类，大小代表该属的丰富程度；节点间的距离表示相关性的长度，距离越短相关性越强。
2.3 添加不同酵母抽提物对酿造酱油理化指标的影响
添加不同酵母抽提物对酿造酱油理化指标的影响见图2。由图2a可知，发酵90 d后，SY1～SY5的还原糖含量均高于CK，其中SY4样品的还原糖含量最高。还原糖和芽孢杆菌之间存在很强的相关性，这可能是由于芽孢杆菌分泌的内源酶可降解多糖[18]。
图2 添加不同酵母抽提物对酿造酱油理化指标的影响
Fig.2 Effect of different yeast extracts addition on the physicochemical indicators of brewed soy sauce
适当的酸度可以调节酱油的咸味，带来顺滑悠长的口感。由图2b可知，随着酵母抽提物的添加，SY1～SY5的总酸含量均增加，其中SY5比CK组增加了11.76%。可滴定酸与四联球菌、葡萄球菌属（Staphylococcus）和乳杆菌之间存在较强的正相关性，表明它们具有较强的耐酸性。此外，它们还与氨基酸态氮存在相关性，这与JIA Y等[19]的结果一致。
由图2c可知，与CK组相比，SY1～SY5的氨基酸态氮含量均增加，其中SY5的氨基酸态氮含量最高，增加了25.51%，表明酸性氨基酸可能更有利于产酸菌耐酸胁迫，并确保其酶的充分分解。
可溶性无盐固形物含量代表酱油中糖、氨基酸、有机酸等营养成分的含量。由图2d可知，与对照组相比，酵母抽提物的添加增加了可溶性无盐固体的含量，特别是在SY1中增加了3.76 g/100 mL。
中性-极性氨基酸可以通过平衡系统中优势菌的结构，加速大分子的分解，从而提高酱油的品质。与发酵产生的氨基酸相比，添加酵母抽提物对酱油中氨基酸的贡献并不明显。乳球菌属（Lactococcus）通过胞外蛋白酶水解产生肽和游离氨基酸是酱油生产中氨基酸的重要途径[20]。添加酵母抽提物后，酱油的理化指标整体无显著差异，但试验组的大部分氨基酸含量高于对照组。
2.4 添加不同酵母抽提物对发酵酱油挥发性风味物质的影响
添加不同酵母抽提物对发酵酱油挥发性风味物质含量的影响见图3。由图3可知，SY1～SY5挥发性风味物质含量较对照组均有提高。酯类是酱油中含量最丰富的化合物，也是造成样品差异的主要化合物[21]。酯类主要由脂肪酸和醇的酯化反应产生，酸性氨基酸有利于酯类的积累[22]。其中SY5中的酯类含量（52.96mg/100mL）比CK（37.08mg/100mL）高42.83%，对于丰富酱油的风味具有重要意义。
图3 添加不同酵母抽提物对发酵酱油挥发性风味物质含量的影响
Fig.3 Effect of different yeast extracts addition on the contents of volatile flavor substances in fermented soy sauce
2.5 酱油样品香气感官评价
不同酱油样品香气感官评价雷达图见图4。由图4可知，SY1的焦糖香、麦芽香、烟熏香强度最高，SY4的果香、花香、甜香、奶油香强度最高；CK的醇香强度最高，SY1的整体香气得分最高。α-二羰基化合物通过缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸脱羧分别转化为2-甲基丙醛、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛，进一步还原产物可提供麦芽样香气[18]，表明支链氨基酸的代谢在SY1中起着重要作用。
图4 添加不同酵母抽提物酱油香气评价雷达图
Fig.4 Radar chart for aroma evaluation of soy sauce with different yeast extracts addition
3 结论
本研究结果表明酵母抽提物可以塑造酱油微生物组成并促进代谢发酵过程。变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Frimicutes）在发酵酱油微生物群落中占据优势地位；添加5种酵母抽提物后，发酵90 d酱油的还原糖、总酸、氨基酸态氮、可溶性无盐固形物含量均增加；添加Y1（中性-非极性∶中性-极性∶酸性∶碱性氨基酸质量比为40∶18∶27∶15）的酱油（SY1）焦糖香、麦芽香、烟熏香强度最高，整体香气得分最高。本研究为优化酱油品质提供了新的理念，也为酵母抽提物在酱油生产中的应用提供了理论指导。
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