酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为首个完成全基因组测序的真核模式生物[1]，凭借其完善的遗传操作体系（同源重组效率＞80%）[2]与公认安全认证，已成为工业应用和基础研究中使用最广泛的底盘细胞之一[3]。酿酒酵母具有生长迅速、遗传背景清晰、操作简单、安全性高、遗传操作性强、发酵能力好等优点[4]，被广泛应用在食品、生物制药、能源和化工等领域[5]。因此，改造酿酒酵母以提高其生产性能仍然是世界各国科学家的研究热点之一。
自1978年HINNEN A等首次实现酵母转化以来[6]，其改造技术经历了三次革命：①随机诱变主导期：通过紫外/化学诱变（如甲基磺酸乙酯处理）获得乙醇耐受性提高菌株（存活率提高3倍）[7]，但存在突变不可控、筛选效率低（＜0.1%）等局限；②定向编辑突破期：重组酶系统（Cre-loxP）与合成染色体的突破[8]，使β-胡萝卜素合成途径的染色体整合效率达67%。③精准智能改造期：成簇的规律间隔的短回文重复序列/失活型Cas9蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/inactivated Cas9，CRISPR/Cas9）技术实现；动态代谢分流；③全基因组代谢模型指导的理性设计。最新进展显示，机器学习辅助用于改造酿酒酵母[9]。酿酒酵母作为研究最深入的工业微生物，凭借其丰富的遗传工具库、成熟的代谢模型开发能力及高度可操作性，成为异源蛋白表达与复杂代谢途径解析的理想底盘，已广泛应用于蛋白质、化学品及代谢物的微生物工业化生产。与其他微生物相比，酿酒酵母的遗传操作相对容易，研究最为深入，也被用作生化生产和异源蛋白表达的工业微生物[10]。对于酿酒酵母的实验室菌株，已开发出一套广泛而多样的基因工程和基因组定向修饰工具，广泛用于功能基因组学、合成生物学、生物技术和代谢工程领域的研究[11]。
1 酵母改造的前沿技术与应用
1.1 基因工程
1.1.1 基因工程技术
基因工程（genetic engineering，GE）又称基因拼接技术和脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）重组技术，是体外人工“剪切粘贴”DNA引入活细胞的技术，包括基因重组、克隆和表达的设计与构建等上游技术以及基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化等下游技术[12]。基因工程作为底层技术平台，为其他技术提供了基本的基因操作手段，如将外源基因导入酿酒酵母中表达特定蛋白[13]。1996年酿酒酵母全基因组测序工作的完成，为利用基因工程技术构建酿酒酵母基因工程菌奠定了基础。此后，科学家们构建了多种有效的质粒载体，并探索出相应的基因转化方法，将各种外源基因导入酿酒酵母，使其能够表达特定的蛋白质或具有新的代谢能力，用于生产药物、酶等多种产物[14]。
1.1.2 基因工程技术在酿酒酵母中的应用
在酿酒酵母借助基因工程进行改造的研究领域，SILVA P C等[15]成功克隆出一种全新的D-木糖异构酶（D-xylose isomerase，XI），该酶源自食木甲虫Odontotaenius disconnectus肠道微生物。经深入鉴定，其虽与厌氧真菌Pirmomyces sp.E2的XI存在同源性，然而其起源为细菌，宿主为副杆菌属。新XI活性比改造前高2.6倍，对D-木糖的米氏常数（Km）比改造前低37%，在更宽温度范围内活性更高，在30 ℃环境下，该酶可维持51%的最大活性，高于Piromyces XI的29%。木糖醇产量相同，浓度增加且仍不抑制D-木糖消耗，展现出优异的工业应用潜力。另外，KHATTAB S M R等[16]通过对酿酒酵母D452-2开展基因改造工作，构建了高效甘油转化菌株，该工程菌株甘油转化效率达0.49 g乙醇/g甘油，达到理论值的98%，单次补料分批发酵生产率＞1 g/（L·h），混合甘油-葡萄糖底物下乙醇产量＞86 g/L，转化效率达92.8%。
WU R等[17]针对当前生物乙醇行业的发酵水平低、环境污染等问题，利用制糖副产物甘蔗糖蜜，另外团队使用新策略通过同源重组将PHO4基因从酿酒酵母菌株MC15转移到工业酿酒酵母菌株MF01，得到工业工程菌株MF01-PHO4（当时甘蔗糖蜜发酵中乙醇产量最高的菌株），且PHO4基因表现出基因组稳定性，与原菌株MF01相比，乙醇产量提高5.30%，发酵时间缩短12.5%。这些结果有助于深入研究PHO4基因与乙醇代谢相关机制，并为工业酿酒酵母菌株的改良提供技术支撑。
1.2 基因编辑
1.2.1 基因编辑技术
基因编辑（gene editing）是对生物体目标基因及其转录产物进行编辑，实现特定DNA片段的加入、删除，特定DNA碱基的缺失、替换等[18]。基因编辑在基因工程基础上的精准化突破，以CRISPR-Cas系统为核心，实现多基因同步操作[19]，并衍生出先导编辑（Prime Editing）等无痕编辑技术[20]，它是一种更精确的基因工程技术，能够在基因组水平上进行定点修饰，为基因工程和代谢工程提供了更精准的改造手段。早期基于重组酶和同源重组的基因编辑技术在酿酒酵母中得到应用，随着技术发展，这些早期技术逐渐被新型基因编辑系统所替代。如基于归巢核酸内切酶（meganucleases，MegNs）、锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）等基因组编辑系统以及近年来热门的CRISPR/Cas系统被广泛用于酿酒酵母的基因编辑[21]。这些技术能够更精确地对酿酒酵母的基因组进行修饰，实现基因的敲除、插入、替换等操作，为酿酒酵母的遗传改造提供了更强大的工具[22]。基因编辑工具的进步，从揭示基本的生物过程到推动医学、农业和生物技术的发展[23]。
1.2.2 基因编辑技术在酿酒酵母中的应用
纤维素乙醇作为重要的生物燃料，以木质纤维类生物质为原料，经预处理、酶水解糖化、微生物发酵和乙醇分离纯化等工艺环节得到的燃料产品[24]。基因编辑技术在提高酿酒酵母发酵性能、促进纤维素乙醇高效生产等方面发挥着关键作用。DZANAEVA L等[25]在酿酒酵母木糖发酵菌株的背景下分离了znf1Δ、adr1Δ、tup1Δ和hap4Δ突变体以及过表达SIP4、ADR1和HAP4基因的菌株。其中hap4Δ突变体展现出显著优势，其木糖产生的乙醇产量相较于亲本菌株增加了1.8倍。该突变体可积累10.38 g/L乙醇，其总乙醇得率达到了0.41 g/g木糖。而其他构建的菌株则呈现出戊糖产生乙醇量减少的情况。这一成果揭示了特定基因编辑对酿酒酵母木糖发酵产乙醇能力的重要影响。ZHANG Y等[26]利用诱导型SCRaMbLE系统在半合成酵母中构建了纤维二糖利用基因表达体系，通过该系统诱变获得改良菌株。此外，发现纤维二糖利用率的提高不仅源于目标基因拷贝数增加，还与MXR1（氧化还原胁迫相关）和ADK2（腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）代谢相关）基因的缺失有关。在稻草水解物发酵实验中，MXR1和ADK2缺失分别使乙醇产量提高4.4%和6.5%，归因于纤维二糖向乙醇转化效率的提高。LI S等[27]运用三元低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）预处理的玉米秸秆的酶解物在酵母菌株SFA1上发酵原厂乙醇收率高达0.488 g/g总还原糖，证明了多元醇辅助三元DES预处理在实现高效纤维素乙醇生产方面的有效性。ZHANG Y W等[28]开发了一株能高效利用秸秆糖的酵母并揭示其高产机制，已用于商业化生产纤维素乙醇。PARK S等[29]通过基因编辑技术开发了一种混合营养型CO2固定酿酒酵母在木糖厌氧发酵中，相对比原菌株该菌株乙醇产量提高16%，浓度增加17%，同时CO2排放减少7%。KONG M等[30]研究表明，在酿酒酵母中过表达CCW12基因能够从木质纤维素水解物中高效生产乙醇，且单独过表达CCW12表现出更好的抗逆性和更好的发酵性能。在LIU Y等[31]的研究中，通过基于CRISPR的胞嘧啶碱基编辑器与覆盖谷氨酸棒状杆菌98.1%基因的12 000条单导向核糖核酸（single guide ribonucleic acid，sgRNA）文库，构建了全基因组功能丧失筛选平台，结合自主开发的FSsgRNA-Analyzer云平台（基于sgRNA富集统计分析），系统性鉴定了5-氟尿嘧啶耐药、氧化应激耐受及糠醛耐受等表型相关基因（如新发现的purU和serA基因）。YUAN B等[32]最新研究发现，缺失INO80基因导致酿酒酵母菌株对乙酸敏感性增加。该工作首次揭示了染色质重塑机制可通过协调表观遗传调控与应激响应通路，进而增强酵母的抗逆性，为开发耐受性工业菌株及优化食品防腐策略提供了新靶点。
1.2.3 CRISPR/Cas系统的原理及CRISPR/Cas9技术优化应用
CRISPR/Cas系统是一种广泛分布于细菌和古菌中的适应性免疫机制，由CRISPR及Cas蛋白构成，精准识别并切割入侵的病毒、噬菌体或质粒等外源核酸分子，从而维持宿主基因组稳定性[33]。CRISPR/Cas系统在多种Cas蛋白的协同作用下，可特异性识别并切割靶向核酸，进而实现对外源基因的清除[34]。CRISPR/Cas基因编辑技术是2013年出现的，是一种由小分子RNA介导的一种靶向基因组编辑的新技术，已成为代替MegNs、ZFNs和TALENs技术诱导靶向基因编辑的一种潜在简便而有效的方案[35]。CRISPR/Cas系统具有靶标效率高、引物设计简单、应用广泛等特点，其开发者于2020年获得诺贝尔化学奖[36]。自该系统引入以来，它已被用于对各种模式物种进行基因工程改造，包括酿酒酵母、拟南芥、黑腹果蝇和小鼠[37]。
表1系统归纳了近五年CRISPR/Cas9技术改造酿酒酵母的三大突破方向——效率提升、精准性增强与工具革新，CRISPR技术已从“单一基因编辑工具”跃迁为“酵母全基因组工程平台”，为酿酒酵母的全基因组编辑及应用奠定基石。
表1 CRISPR/Cas9技术在酿酒酵母的应用
Table 1 Application of CRISPR/Cas9 technology in Saccharomyces cerevisiae
注：PAM：原间隔序列相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM），HDR：同源定向修复（homology-directed repair，HDR），CHASE：CRISPR-Cas9与同源修复辅助的饱和编辑（CRISPR-Cas9-and homology-directed repair-assisted saturation editing，CHASE）。
优化方向 技术策略/应用 应用效果 参考文献效率提升精准性增强工具革新Cas9-Brex27融合蛋白招募Rad51重组酶PolⅡ/PolⅢ双启动子驱动sgRNA SPY/SunTag支架募集多拷贝调控因子SCR7和RS-1处理酿酒酵母pCEC-red质粒（Golden Gate+红色筛选）sgRNA反选标记靶向多拷贝位点PAM识别放宽的Cas9 变体+HDR 100 bp四重整合效率78%，一步构建异源mogrol途径3对等位基因一次敲除效率达68%激活效率提高34.9倍，抑制效率95%显著提高CRISPR/Cas9系统基因编辑效率无标记大片段替换效率90%，周期缩短至3 d选效率85%（多倍体适用）开发CHASE技术MENG J等[38]徐康等[39]ZHAI H等[40]倪江萍等[41]MAESTRONI L 等[42]蔡倩茹等[43]DENG L等[44]
1.3 代谢工程
1.3.1 代谢工程技术
代谢工程（metabolic engineering）是指利用多基因重组技术有目的的对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域[45]。基因工程和基因编辑技术是代谢工程的重要工具，用于对代谢途径中的关键基因进行调控[12]，代谢工程即整合前两者技术优势，通过动态调控代谢网络提高产物转化效率。近年来，由于菌株工程的进步，代谢工程的系统方法也加快了前进的步伐[46]。代谢工程的广泛研究导致了许多能够生产各种化学品的微生物的发展，包括燃料、材料、食品添加剂和药物[47]。
1.3.2 代谢工程在改造酿酒酵母的应用
表2凝练了近五年代谢工程改造酿酒酵母的核心突破，其技术策略与增效成果共同揭示：代谢工程已从“单基因靶向操作”跃迁至“系统级智能重编程”，通过空间重构、动态平衡及模块化通路设计，推动生物制造向“高产量-低成本-低碳排”三位一体目标加速进化。
表2 代谢工程在酿酒酵母中的应用
Table 2 Application of metabolic engineering in Saccharomyces cerevisiae
应用方向 技术策略 关键突破与效果 参考文献木糖利用强化萜类化合物合成木糖氧化途径与线粒体异丁醇合成耦合整合异源xylA基因到基因组中代谢路径重构+底物协同利用基因位点筛选+元件组合优化橘烯途径模块代谢工程过表达角鲨烯合成酶+NADH-HMGR+补料分批发酵异丁醇产量2.6 g/L（较传统路径提高3倍）木糖利用率近100%乙醇产量提高60%与84%，木糖醇产量降低12%橘烯产量提高100倍与9.53 g/L（3 L发酵罐）熊果酸产量8.59 g/L（5 L罐）角鲨烯产量9.472 g/L LANE S等[48]LI F等[49]PROCÓPIO D P等[50]陈东莹等[51]ZHU Y等[52]LI T等[53]
续表
注：NADH-HMGR：NADH依赖型HMG-CoA还原酶（NADH-dependent HMG-CoA Reductase）。
应用方向 技术策略 关键突破与效果 参考文献酯类/芳香物 构建Ehrlich通路融合蛋白引入WS2 基因构建脂肪酸乙酯途径2-苯乙醇产量达4.02 g/L脂肪酸乙酯产量1.35 g/L（提高480倍）ZHU L等[54]姜慧等[55]
1.4 合成生物
1.4.1 合成生物技术
合成生物学（synthetic biology）是一门通过工程化手段设计、构建或重构生物系统以实现特定功能的交叉学科，融合生物学、工程学、计算机科学等多领域理论与技术。其核心目标是通过标准化生物元件（如基因线路、代谢通路）的模块化组装，创造自然界中不存在的生物系统或优化现有系统，应用于医药、能源、材料等领域[56]。
合成生物技术的发展始于20世纪70年代基因工程技术的突破，自1973年Cohen和Boyer实现体外重组DNA[57]，ELOWITZ M B等[58]构建首个基因振荡子模型推动人工生物系统设计；2003年BioBricks元件库和2005年合成生物学工程化理念确立其标准化范式[59]，2010年Venter团队合成人工基因组JCVI-syn1.0为里程碑[60]；2018年SHAO Y等[61]成功构建单染色体酵母，近年人工智能（artificial intelligence，AI）合成生物学结合（如AlphaFold）进一步加速蛋白质设计[62]。如今合成生物技术已从实验室走向更为广泛的应用，形成“设计-构建-测试”的工程化研究范式。
4.2 合成生物技术在改造酿酒酵母的应用
表3梳理了部分近五年利用合成生物技术改造酿酒酵母的代表性应用案例，其技术策略与突破性贡献印证：酵母已从传统“代谢载体”跃升为“智能生物工厂”，而模块化、动态化、系统化的工程范式正推动生物制造向“精准设计-高效转化-经济可行”三位一体目标加速演进。
表3 合成生物在酿酒酵母中的应用
Table 3 Application of synthetic biology in Saccharomyces cerevisiae
产物类别 技术策略 突破性贡献 参考文献药用化合物食品与香料高值化合物半乳糖途径重构+动态调控三重异源酶共表达+人工辅因子F0+催化路径简化P450酶系组合+还原型辅酶Ⅱ再生莽草酸途径动态调控三途径平衡+过氧化物酶体工程p-香豆酰辅酶A途径优化Ehrlich途径启动子工程异源途径+糖基化优化乙酰辅酶A全局调控还原型辅酶Ⅱ再生+P450酶共表达三重辅因子系统工程+空间重编程+动态回收设计首次实现大麻素全合成完成活性四环素生物转化染料木黄酮23.33 mg/L，同步合成糖苷衍生物3'-羟基染料木黄酮产量（1.40±0.02）mg/L，模块化平台前体去甲基黄腐酚提高83倍，产量142 μg/L（首例酵母合成）创二氢查耳酮产量纪录芳香醇浓度提高34.7%甘草甜素5.98 mg/L（首例酵母全合成）紫香苏醇产量11.4 g/L（二萜类全球最高）5L反应器产量11.3 mg/L（提高8.2倍）咖啡酸5.5 g/L，阿魏酸3.8 g/L LUO X等[63]HERBST E等[64]WANG Y T等[65]TAN X等[66]YANG S等[67]HAN Y等[68]LIU S等[69]XU K等[70]CAO X等[71]ZHANG M H等[72]CHEN R等[73]
2 酿酒酵母改造的挑战与展望
酿酒酵母作为经典模式微生物，其代谢网络的复杂性和天然调控机制为人工改造带来多重挑战如下：
在利用酵母合成脂肪酸衍生物时，内源的β-氧化途径（如POX1基因介导的脂肪酸降解）会与人工设计的脂质合成路径竞争底物，导致产物效率低下。尽管通过基因敲除可部分抑制竞争途径，但多基因协同调控（如磷脂酸磷酸酶PAP2的活性平衡）仍需精细操作，否则易引发细胞生长抑制或代谢失衡。
基因编辑工具在酵母中的实际应用也存在明显局限，以CRISPR/Cas9技术为例，它虽能实现高效敲除，但仍然存在一些技术缺陷需要完善。如脱靶效应，效率问题，运输问题，免疫排斥，副作用等。
在工业化场景中，酿酒酵母对木质纤维素水解液中抑制物（如糠醛、弱酸、呋喃、酚类化合物等）的耐受性不足，单萜类化合物（如柠檬烯）的毒性机制在酵母中具有普遍性，主要通过破坏细胞膜流动性和抑制能量代谢（如ATP合成）导致细胞死亡，这些因素进一步制约了纤维素乙醇等生物燃料的大规模生产。
因此研究人员们开发了先导编辑器、改进的Cas变体（如高保真Cas9变体）、优化的sgRNA和抗CRISPR蛋白来减少CRISPR-Cas9的脱靶效应。CRISPR-Cas9的高保真变体（如HypaCas9）虽能减少脱靶，但其编辑效率可能下降，如何平衡精准性与效率仍需探索仍是科研人员需要深入探索的难题。
3 展望
随着基因工程、基因编辑、代谢工程以及生物合成等前沿技术的不断发展，酿酒酵母的改造前景依旧十分广阔。未来，酿酒酵母的智能化升级正通过AI驱动的跨尺度精准调控实现革命性突破：基于多组学数据训练的机器学习模型，结合CRISPR-Cas12a多基因并行编辑系统，可同步优化代谢网络，显著提高木质纤维素乙醇转化效率；依托合成生物学数字孪生平台，AI赋能的“设计-构建-测试-学习”闭环将菌株开发周期缩短，降低纤维素生成乙醇成本。这些技术突破不仅使酿酒酵母有望成为碳中和技术核心载体，更有望在生物医药、食品、能源等领域加速智造，最终构建起“智能设计-绿色生产-产业赋能”的全链条生物制造体系，为全球碳中和目标提供底层技术支撑。
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