自然和酵母强化发酵酱油灭菌前后品质指标及挥发性风味物质比较

酱油作为我国主要传统发酵调味品之一，其风味与品质的形成离不开微生物菌群的代谢活动[1]。在自然发酵体系中，微生物群落呈动态变化，存在菌群稳定性欠佳、风味物质生成难以调控等问题[2]。为改善酱油品质，人工接种特定功能酵母菌已成为现代高盐稀态酱油酿造的核心工艺，其中鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和多变假丝酵母（Candida versatilis）应用广泛[3]。鲁氏接合酵母作为主发酵酵母，能产生乙醇、甘油及酯类等物质，是酱油独特风味的重要来源；多变假丝酵母作为后熟酵母，可代谢生成4-乙基愈创木酚、4-乙基酚等酚类化合物，赋予酱油丁香味与烟熏味[4]。这两种酵母通过协同代谢，有效提升了酱油风味的复杂性与协调性。

在酱油、食醋等传统调味品的生产中，灭菌是保障食品安全的关键环节，但高温处理可能导致风味物质挥发、美拉德反应加剧，影响产品品质[5]。GAO X等[6]结果表明，热处理的酱油在诸如烤焦、烟熏、焦糖化和蒸煮等气味方面更突出，而柔和、酸味、花香和麦芽味的气味强度则较低。MENG Q等[7]研究表明，日本酱油在80 ℃、30 min条件下处理后，具有果香味的5种关键酯类物质含量均有所降低。康文丽等[8]研究表明，高盐稀态酿造酱油在120 ℃条件下灭菌15 s后，5-乙基-4-羟基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮（d 5-ethyl-4-hydroxy-2-methyl-3（2H）-furanone，HEMF）、4-乙基愈创木酚及3-甲硫基丙醇等关键物质含量的变化导致灭菌前后酱油样品香气差异。目前，关于自然发酵酱油与酵母强化发酵酱油在灭菌前后品质指标及挥发性风味物质变化的对比研究鲜有报道。

基于此，该研究以自然发酵酱油及鲁氏接合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）及多变假丝酵母（Candidaversatilis）（1∶1）强化发酵酱油为研究对象，通过常规检测方法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）及顶空固相微萃取-气相质谱（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）分析灭菌（90 ℃、20 min）前后自然发酵酱油样品（N0、N1）及酵母强化发酵酱油样品（F0、F1）的理化指标、有机酸、游离氨基酸含量及挥发性风味成分，并对检测结果进行偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），旨在揭示酵母强化发酵及灭菌处理对酱油品质的影响，为酱油品质提升提供理论依据与技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与原料

鲁氏接合酵母（Zygsoaccharomyces rouxii）：高盐酱醪中分离获得；多变假丝酵母（Candida versatilis）（CGMCC3790）：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）。成熟酱油曲（由大豆和小麦质量比为6∶4制备而成）、食盐：千禾味业食品股份有限公司。

1.1.2 试剂

甲醇、乙腈、草酸、柠檬酸、酒石酸、L-苹果酸、乳酸、乙酸和焦谷氨酸标准品、辛酸甲酯（均为色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；氨基酸混标（100 nmol/mL）：德国曼默博尔公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪：美国Agilent公司；Trace 1300-TSQ9000气相色谱-质谱联用仪：美国Thermo Fisher Scientific公司；VF-WAX-MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）：美国Bellefonte公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头：美国Supelco公司；A300氨基酸分析仪：德国曼默博尔公司；TU-1901紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 自然发酵和酵母强化发酵酱油样品制备

成熟酱油曲与22%的盐水按照1∶1.8（g∶mL）的比例混合均匀，置于5 L的玻璃发酵罐中，装液量为总容积的90%，然后用纱布封口。强化酱醪在第1天添加Z.rouxii菌悬液，随后在第5天添加C.versatilis菌悬液（制备方法参考文献[9]），初始的菌体浓度均为2.5×106 CFU/mL，自然发酵组仅不接种微生物，其余条件相同。然后将发酵罐置于（30±2）℃恒温培养箱中发酵180 d，最初每两天搅拌一次，15 d后每五天搅拌一次。发酵结束后，粗样品经纱布过滤后取油，即得自然发酵和酵母强化发酵酱油样品。

1.3.2 自然发酵和酵母强化发酵酱油灭菌前后品质指标及挥发性风味物质比较

将上述发酵酱油样品装于250 mL具塞三角瓶中，装液量为100 mL，在温度90 ℃、时间20 min条件下对酱油样品进行灭菌[10]，并对灭菌前后自然发酵生酱油（N0、N1）和酵母强化发酵生酱油（F0、F1）的理化指标、有机酸、氨基酸和挥发性风味物质进行比较。

1.3.3 分析检测

（1）基础理化指标测定

氯化钠、氨基酸态氮和总酸的检测：参考国家标准GB 18186—2000《酿造酱油》；还原糖的检测：参考GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》。

（2）有机酸、游离氨基酸测定

有机酸：采用高效液相色谱法[11]，以标准品的保留时间定性分析，并通过外标法计算含量。

游离氨基酸：采用氨基酸自动分析仪检测[9]。称取0.200 g样品，加入50 mL 0.01 mol/L盐酸溶液超声（100 W、40 kHz）提取30 min后，滤纸过滤，收集滤液。准确吸取5 mL滤液，加入5 mL 8%的磺基水杨酸水溶液混匀，静置2 h以上。然后离心（10 000 r/min、4 ℃）10 min后取上清液，过0.22 μm水相滤膜后检测，外标法定量。

（3）挥发性风味物质分析

采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱法测定酱油挥发性风味物质的含量。

样品前处理：将1 mL酱油和10 μL内标溶液（辛酸甲酯，0.007 9 g/100 mL）加入20 mL顶空瓶中，在60 ℃、500 r/min条件下预平衡15 min。随后插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头，同条件下吸附45 min。萃取完成后，将萃取头插入气质进样口解吸5 min，进行检测。检测条件与参考文献[12]一致。

定性定量分析：在美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）17谱库对未知化合物进行检索并计算匹配度，选取正反匹配度均＞800（最大值为1 000）的物质进行定性。挥发性风味物质含量的计算公式如下：

式中：C为挥发性风味物质的质量浓度，μg/L；C0为内标化合物的质量浓度，μg/L；A1为挥发性化合物的峰面积；A0为内标化合物的峰面积；V0为内标化合物的体积，μL；V1为酱油样品体积，mL。

香气活度值（odor activity value，OAV）计算：挥发性化合物的相对含量与其气味阈值之比，OAV≥1的物质是能够被人感知的风味物质，定义为关键香气物质，OAV＞10定义为核心香气物质，OAV＞100定义为酱油特征香气物质。

1.3.4 风味轮廓分析

采用SIMCA 14.1软件进行偏最小二乘-判别分析（PLSDA）建模，解析自然和酵母强化发酵酱油灭菌前后挥发性风味物质差异；基于香气活度值（OAV）的对数值，采用Origin 2022绘制极坐标雷达图，对酱油的风味轮廓可视化。

1.3.5 数据处理

所有实验均重复进行3次，数据以“平均值±标准偏差”表示。使用SPSS26和Duncan方法，对数据进行方差分析和多重测试分析；采用Origin 2022进行可视化分析。

2 结果与分析

2.1 自然和酵母强化发酵酱油灭菌前后品质指标比较

2.1.1 基础理化指标

自然发酵酱油和酵母强化发酵酱油灭菌前后理化指标检测结果见表1。

由表1可知，2种酱油样品（N1、F1）的总酸、氨基酸态氮、还原糖含量均略有增加，而乙醇含量有所降低。结果表明，灭菌后可能会对酱油中部分理化指标有一定影响，但对自然和酵母强化发酵酱油的整体理化性质影响不大，与周朝辉[13]报道的研究结果一致。

2.1.2 有机酸

自然发酵酱油和酵母强化发酵酱油灭菌前后有机酸检测结果见表2。由表2可知，样品F0的总有机酸含量较样品N0增加26.68%，其中以琥珀酸含量增加明显（123.60%），其可由耐盐酵母代谢产生，而乳酸则未被检测到，推测其可能由于耐盐酵母与耐盐乳酸菌形成竞争性抑制，与Z.rouxii接种的三文鱼酱体系中研究结果一致[14]。与样品N0相比，样品N1的总有机酸含量增加0.98%，其中柠檬酸及焦谷氨酸有所增加，柠檬酸含量增加7.85%；与样品F0相比，样品F1总有机酸含量下降1.87%，琥珀酸含量减少2.14%。因此，接种发酵可以明显增加柠檬酸及琥珀酸含量，但需要优化灭菌工艺以减少热敏感成分的损失。

2.1.3 游离氨基酸

自然发酵酱油和酵母强化发酵酱油灭菌前后游离氨基酸检测结果见表3。由表3可知，灭菌处理前后酱油样品中游离氨基酸（free amino acids，FAA）的组成发生明显变化。不同酱油样品共检出16种FAA，根据呈味特性归为鲜味、甜味、甜苦味及苦味4类。强化发酵组（F0）较自然发酵组（N0）总FAA含量提升37.45%，16种单体FAA均呈正向积累，证实酵母代谢对FAA合成的促进作用。灭菌处理后，自然酱油（N1）与强化酱油（F1）总FAA分别较未灭菌组（N0、F0）下降2.24%和6.66%，推测与美拉德反应消耗及热敏性氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸）脱羧降解相关[15]。与样品N0相比，样品N1中的丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸含量增加范围为3.35%～10.98%，推测热灭菌可能促使残留肽链断裂释放游离氨基酸。而样品F1仅脯氨酸含量较样品F0升高9.40%，或归因于其环状结构的热稳定性及耐热肽酶活性。该“释放-消耗”动态与热处理对乳蛋白氨基酸迁移规律具有相似机制[16]。因此，灭菌处理通过美拉德反应和热敏性氨基酸脱羧降解降低酱油总FAA含量。

2.2 自然和酵母强化发酵酱油灭菌前后挥发性风味物质比较

2.2.1 挥发性风味物质含量分析

自然发酵酱油和酵母强化发酵酱油灭菌前后挥发性风味物质检测结果见表4。由表4可知，酱油样品共检出63种挥发性物质，包括醇类12种、酸类3种、酯类27种、酚类6种、酮类6种、醛类5种和其他类4种。与灭菌前样品相比，样品N1挥发性风味物质种类由49种降低至44种，总含量从3.88 mg/L增加至5.07 mg/L（增加30.75%）；样品F1挥发性风味物质种类从49种增至50种，总含量从6.22 mg/L增加至6.83 mg/L（增加9.84%）。

醇类物质赋予样品玫瑰花香、洋葱香和水果香等香味[17]。与样品N0相比，样品F0中2-甲基-1-丙醇、2-丁醇、3-甲基-1-丁醇和β-乙基苯乙醇等高级醇含量较高，尤其是苯乙醇含量（1 756.35 mg/L），可能由接种的酵母菌通过Ehrlich途径代谢亮氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸等前体物质生成[18]。此外，仅在强化酱油样品F中检出1-辛烯-3-醇，其因低阈值（1.0 μg/L）对产品风味影响显著，灭菌的热促作用使一些成分转化[19]，致使其含量变化。与样品N0、F0相比，样品N1、F1的3-呋喃甲醇分别增加25.99%和24.34%。与样品N0相比，样品N1的2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇和β-乙基苯乙醇含量略降，而2,3-丁二醇、苯乙醇和3-甲硫基丙醇有所增加；而样品F1的变化则相反。

酸类物质中，样品N0、N1中只检出乙酸，而样品F0、F1中只检出2-甲基丙酸、3-甲基丁酸。与样品N0和样品F0相比，样品N1和样品F1中酸类物质的总含量分别增加了24.67%和39.30%，类似牛乳巴氏灭菌观察到的结果[16]。

酱油中酯类物质是花果香与甜香的主要来源[17]。与样品N0相比，样品F0酯类物质数量少了2种，含量低42.73%。与N0相比，样品N1酯类物质总含量增加了24.65%，其中苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯和棕榈酸甲酯等13种物质含量降低，肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯和正丙基油酸等9种物质含量增加。与F0相比，样品F1的酯类物质总含量增加了28.30%，其中苯甲酸乙酯、肉桂酸乙酯、10-十八碳烯酸甲酯和亚油酸乙酯等9种物质含量降低，苯乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、十七酸乙酯和9,12,15-十八碳三烯酸丁酯等13种物质含量增加。

所有样品中均检出6种酚类物质，但含量差异明显。与样品N0相比，样品F0酚类物质的总含量增加437.65%，4-乙基愈创木酚（4-EG）增加722.38%，其赋予酱油浓郁的烟熏味，主要由C.versatilis代谢生成[3]。灭菌后，样品N1和样品F1中麦芽酚、4-乙烯基愈创木酚（4-VG）和2,4-二叔丁基苯酚含量均增加明显，其主要是由热脱羧和美拉德反应生成[20-21]。尤其是4-VG，相比于样品N0和样品F0，样品N1和样品F1中分别增加了520.89%和401.67%。

酮类物质风味特征赋予赋予酱油明显的果香、烟草香和焦糖香[17]。样品F0的酮类物质含量较样品N0高46.49%，HEMF作为最主要酮类物质，其含量在样品F0中较样品N0高81.21%，且该差异与Z.rouxii的代谢活动密切相关[3]。相比于样品N0和样品F0，样品N1和样品F1中HEMF的含量分别增加了41.92%和2.71%。

醛类物质是酱油杏仁香、焦糖甜香和辛香的主要来源[17]。与样品N0相比，样品F0检出苯丁醛，且总醛类含量增加了27.08%。与样品N0和样品F0相比，样品N1和样品F1中醛类物质的总含量分别增加了166.06%和73.65%，其中样品N1和样品F1苯乙醛分别增加90.03%和17.50%。由此可见，灭菌将氨基酸通过Strecker途径，促进醛类化合物的形成[22]，改善了酱油的复合香气。此外，仅在样品F0、F1中检出的2-乙基-6-甲基吡嗪，灭菌后其含量增加19.09%。

2.2.2 风味轮廓

基于挥发性风味物质对自然发酵和酵母强化发酵酱油灭菌前后样品进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），结果见图1。由图1A可知，两个主要成分解释了86.90%的数据变异，有效区分了灭菌前后的酱油样本。强化酱油以醇类、酚类和酮类为主，主要包括苯乙醇、3-（甲硫基）-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、4-EG、4-乙基苯酚、麦芽酚和HEMF等；而自然发酵酱油则以酸类和酯类为主，包括乙酸、苯甲酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯和正丙基油酸等。

根据OAV≥1，从自然发酵酱油和强化酱油样品中均筛选出14种关键挥发性风味物质（2-甲基-1-丙醇、亚油酸乙酯、油酸乙酯、苯甲酸乙酯、己酸乙酯、苯乙醛、HEMF、4-VG、4-EG、乙酸、苯乙醇、3-（甲硫基）-1-丙醇、1-辛烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇），以OAV的对数值为极坐标构建风味轮廓分析（见图1B）。由图1B可知，油酸乙酯（阈值0.87 μg/L）和HEMF（阈值1.15 μg/L）[23]在自然发酵酱油和强化酱油样品中OAV均＞100，是酱油花果香和焦糖香的特征贡献者[17]。且灭菌处理可以明显提高这2种物质的香气强度，样品N0、F0油 酸 乙 酯 和HEMF的OAV分 别 为422.66、124.14，189.47、224.96，其在样品N1、F1中分别达595.73、176.18，234.84、231.06。

此外，3-甲基-1-丁醇、3-甲硫基-1-丙醇、1-辛烯-3-醇、乙酸、4-EG、4-VG、苯乙醛及亚油酸乙酯的OAV均＞10，构成酱油核心挥发性风味成分。样品N0中苯乙醛、乙酸和4-VG的OAV分别为17.96，12.83和3.94，在样品N1中的OAV有所增加，分别达34.13、16.00和24.47，显著增强了蜂蜜香、酸味及烟熏风味特征[24]；与样品F0中3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇、4-EG和4-VG的OAV（72.66、18.28、16.21和2.49）相比，其在样品F1中的OAV有所增加，分别为72.89、18.76、76.62和16.59，进一步强化了麦芽香、蘑菇香、烟熏香及焦糖香[25]。结果表明，灭菌工艺通过调控关键香气物质的OAV，显著优化了酱油风味的复杂性与层次性。

3 结论

本研究深入探究了自然发酵酱油及酵母强化发酵酱油样品灭菌前后的理化指标、有机酸、游离氨基酸及挥发性风味成分的变化。结果表明，灭菌后自然发酵及酵母强化发酵酱油样品（N1、F1）的总酸、氨基酸态氮及还原糖含量增加，乙醇含量降低；样品F0、F1有机酸、游离氨基酸含量均高于样品N0、N1中有机酸、游离氨基酸含量。样品N0、N1、F0、F1共检出63种挥发性风味成分，其中，灭菌前样品N0、F0均检出49种，灭菌后样品N1、F1分别检出44种、50种，且灭菌后样品N1和F1的总含量分别增加30.75%和9.84%。结合OAV分析发现，样品F1中油酸乙酯、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮等特征香气物质增加，可一定程度上强化酱油特征风味。本研究分析了自然发酵酱油及酵母强化发酵酱油灭菌前后的品质指标及挥发性风味物质，可为酱油品质提升提供理论依据与技术支持。

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Comparison of quality indexes and volatile flavor components of natural and yeast-fortified fermented soy sauce before and after sterilization

ZHANG Lin,ZHANG Yi,HUANG Jun,WU Chongde,ZHOU Rongqing*
(College of Light Industry Science and Engineering,Sichuan University,Chengdu 610056,China)

Abstract：To explore the effect of sterilization on the quality and flavor of soy sauce, using natural fermented soy sauce samples and yeast-fortified soy sauce fermented by Zygosaccharomyces and Candida versatilis(1∶1)as the research objects,the physicochemical indexes,organic acid,free amino acid contents and volatile flavor components of the naturally fermented soy sauce samples (N0, N1) and yeast-fortified fermented soy sauce samples(F0,F1)before and after sterilization(90 ℃、20 min)were analyzed by conventional detection methods,high performance liquid chromatography(HPLC),and headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME-GC-MS),and partial least squares-discriminant analysis(PLS-DA)was carried out based detection results.The results showed that the total acid,amino acid nitrogen,and reducing sugar contents of natural fermented and yeast-fortified fermented soy sauce samples(N1、F1)after sterilization increased,while ethanol content decreased.The contents of organic acid and free amino acid of samples F0 and F1 were 3 553.25 mg/100 ml, 3 486.67 mg/100 ml; 6 753.35 mg/100 ml, 6 306.76 mg/100 ml respectively, which were both higher than the contents of organic acid and free amino acid contents of samples N0 and N1 (2 804.97 mg/100 mL,2 832.39 mg/100 mL;4 913.20 mg/100 ml,4 802.95 mg/100 ml).A total of 63 volatile flavor components were detected in samples N0, N1, F0 and F1.Among them,the volatile flavor components of sample F1 was the most abundant(50),and the characteristic aroma substances such as ethyl oleate and 5-ethyl-4-hydroxy-2-methyl-3(2H)-furanone increased,the sterilization treatment of yeast-fortified fermented soy sauce could to a certain extent enhance the characteristic flavor of soy sauce.

Key words：high-salt liquid-state soy sauce;sterilization;yeast-fortified fermentation;quality analysis;volatile flavor component

中图分类号：TS264.2

文章编号：0254-5071（2025）08-0191-08

doi: 10.11882/j.issn.0254-5071.2025.08.028

引文格式：张林，张毅，黄钧，等.自然和酵母强化发酵酱油灭菌前后品质指标及挥发性风味物质比较[J].中国酿造，2025，44（8）：191-198.

收稿日期：2024-11-21

修回日期：2025-01-21

基金项目：中央在川高校院所“聚源兴川”项目（23JYXC0056）；国家重点研发计划项目（2018YFC1604105）

作者简介：张 林（1995-），男，博士研究生，研究方向为发酵工程。

*通讯作者：周荣清（1960-），男，教授，博士，研究方向为发酵工程和微生物群落代谢与调控。