南果梨是辽宁特色水果，其汁多肉细，酒香浓郁，富含多种人体必需氨基酸和微量元素，深受广大消费者的喜爱[1-2]。由于南果梨采摘期较短，易褐变不易保存，且冷藏后香味损失较大影响其品质及价值[3-4]。因此，开发南果梨深加工技术，是南果梨产业发展的必然趋势。
近年来，发酵型果汁作为一种新兴的健康饮品深受消费者欢迎。果汁发酵不仅能够延长水果产品的保存期，还可以通过发酵过程赋予果汁更为独特的风味和更高的营养价值。植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）是乳杆菌属（Lactobacillus）的一种革兰氏阳性菌，因其发酵环境适应性强，能够改善果蔬风味、提高营养价值、增强抗氧化活性等功能，被广泛应用于发酵食品和饮品的生产中[5-7]。廖茂雯等[8]采用植物乳植杆菌b-1发酵蓝莓汁，结果显示发酵后蓝莓汁中活菌数较高且总酸含量增加，香樟醇和香叶醇相对含量上升，增强了果汁的柑橘香、花香和玫瑰香气。王晨曦等[9]研究了植物乳植杆菌67-25-2发酵对沙棘果汁涩味改善的效果，结果表明发酵显著减少了涩味物质异鼠李素糖苷含量，增加了总酚含量和抗氧化活性，提升了果汁的口感。杜晓仪等[10]研究了不同益生菌对三华李发酵果汁的影响，结果发现植物乳植杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵的三华李果汁能更好地保留活性成分、提高抗氧化水平及消化耐受性，适合作为高品质发酵剂。SHI F F等[11]研究了植物乳植杆菌JHT78发酵对西瓜汁的影响，结果发现发酵显著提升了西瓜汁的多酚和抗氧化活性，并增加了其挥发性与非挥发性物质含量。目前关于植物乳植杆菌发酵南果梨汁的研究尚鲜见报道，有关植物乳植杆菌发酵后南果梨汁中活性成分、抗氧化活性以及风味物质成分变化仍然有待深入研究。
本研究以南果梨汁为基质，采用植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）进行发酵，采用常规检测方法及顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）法测定南果梨汁发酵过程中理化性质及挥发性风味物质，通过测定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）及2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除率研究其抗氧化能力的变化规律，并对发酵南果梨汁进行感官评价。旨在构建发酵型南果梨汁的生产工艺，为南果梨产业化生产提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
南果梨：辽宁鞍山；植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）CICC 20022：中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 试剂
没食子酸标准品（纯度＞95%）；3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、福林酚、碳酸钠、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、柠檬酸、葡萄糖、DPPH、ABTS（均为分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司。
1.1.3 培养基
MRS液体培养基：湖南比克曼生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BM08S型糖度计：天津瞭望光电科技有限公司；JYLC022E榨汁搅拌机：济南九阳股份有限公司；PHS-3C型pH计：上海圣科仪器设备有限公司；7890B-5977B气相色谱质谱联用仪：美国安捷伦技术（中国）有限公司；DHG-9023A鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：常州天瑞仪器有限公司；UV-2600 UV/vis 分光光度计：日本岛津公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种的活化
将植物乳植杆菌接入无菌MRS液体培养基中，于37 ℃培养12 h。在波长600 nm条件下测得菌液吸光度值（OD600nm值）为0.8，得到处于对数生长期的菌悬液，用于接种发酵。
1.3.2 南果梨汁的发酵
使用榨汁机将洗净南果梨打浆后使用纱布过滤，通过添加蔗糖和柠檬酸将果汁糖度和pH值分别调整为13°Bx和pH 5.0[10]。经过调整的南果梨汁经巴氏杀菌（85 ℃、15 min）后，将植物乳植杆菌悬液按照3%（V/V）接种量接种于南果梨汁中，于37 ℃培养36 h。
1.3.3 分析检测
植物乳植杆菌活菌数测定：依据国家标准GB 4789.2—2022《食品微生物学检验菌落总数测定》中的平板计数法；pH值测定：采用pH计；总酸含量（以乳酸计）测定：依据国标GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》酸碱指示剂滴定法；总糖、还原糖（以葡萄糖计）含量的测定：采用3,5-二硝基水杨酸比色（DNS）法；总黄酮含量测定：采用分光光度法[13]；总酚含量测定：采用福林酚比色法[14]。
1.3.4 抗氧化能力测定
（1）DPPH自由基清除能力
参考CHEN Q等[15]的方法并稍作修改，将不同发酵时间南果梨汁样品加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL和甲醇2 mL，振荡混匀后，在室温下避光反应15 min。于波长517 nm条件下测量样品溶液的吸光度值。根据公式（1）计算样品DPPH自由基清除能力。
式中：A0表示空白对照样品吸光度值；AS表示样品吸光度值。
（2）ABTS自由基清除能力的测定
参考TONG X等[16]的方法稍作修改，将7 mmol/L的ABTS与2.45 mmol/L过硫酸钾混合而成得到ABTS储备液，黑暗中放置16 h后用体积分数70%的乙醇进行稀释至吸光度值0.7以制备ABTS工作液。将1 mL工作液与1 mL发酵南果梨汁样品混合，黑暗处放置30 min，以不添加发酵液为空白对照，在波长734 nm处测定吸光度值。根据公式（2）计算样品ABTS自由基清除能力。
式中：A0表示空白样品的吸光度值；AS表示样品的吸光度值。
1.3.5 挥发性风味成分的测定
挥发性风味成分的测定采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（HS-SPME-GC-MS）法[17]，稍作修改。取南果梨发酵汁5 mL，氯化钠1.0 g于顶空瓶中，于60 ℃下平衡15 min。将预先老化的萃取头（50/30 μm PDMS/DVB）插入顶空瓶中，60 ℃下萃取20 min，再将萃取头插入GC 进样口，250 ℃下解吸7 min。
GC条件：HP-5MS石英毛细管柱（60m×250μm×0.25μm）；进样口温度250 ℃；升温程序为初始温度为40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升至240 ℃，保持4 min；载气为高纯氦气（He）；流量为1.0 mL/min；采用无分流模式进样；进样口温度为250 ℃。
MS条件：采用电子电离（electronic ionization，EI）源，离子源温度230 ℃，电子能量为70 eV，四极杆温度150 ℃，传输线温度为250 ℃；采集为全扫描模式，m/z采集范围为30～550 amu。
定性定量方法：通过对总离子流图中各峰的质谱数据进行计算机系统检索，并与美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）20标准质谱图进行比对，以匹配度＞80%作为筛选标准确定挥发性风味成分，并采用峰面积归一化法计算其相对含量。
1.3.6 感官评价
参考李虹甫等[18]的方法，选择10名经过感官评价训练的人员，分别从滋味、口感、香气、质地状态和色泽五个方面对不同发酵时间的南国梨果汁进行感官评分，满分为100分，发酵南果梨汁感官评分标准见表1。
表1 发酵南果梨汁感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of fermented Nanguo pear juice
项目 评价标准 分数/分滋味（40分）口感（20分）香气（15分）质地（15分）色泽（10分）味道平衡，酸甜适中偏酸或偏甜，但无其他异味味道失衡，过酸或过甜，带有苦涩等异味质地细腻，口感柔滑，回味持久略带酸涩，有轻微异味酸涩感明显，且带有异味果香与发酵香气浓郁适宜，无杂味果香与发酵香气较淡，无异味缺乏果香，有刺激性气味或其他异味质地均匀一致，流动性良好质地较均匀，流动性较好质地不均匀，出现分层或结块色泽鲜艳均匀，呈淡黄色色泽不均匀，出现其他杂色30～40 15～29≤14 15～20 8～14≤7 10～15 5～9≤4 12～15 8～11≤7 8～10≤7
1.3.7 数据处理与分析
利用Excel 2021对数据进行收集处理，结果以“平均值±标准差”表示；所有数据均采用Origin 2021软件作图；使用IBM SPSS Statistics 21.0统计软件对数据进行差异显著性分析、相关性分析（P＜0.05为显著相关，P＜0.01为极显著相关）及聚类分析（clustering analysis，CA）。
2 结果与分析
2.1 南果梨汁发酵过程中植物乳植杆菌活菌数的变化
由图1可知，在发酵4～12 h内，菌株处于对数生长期，活菌数显著增加（P＜0.05），随后活菌数增长缓慢，原因可能是植物乳植杆菌发酵产生有机酸使得发酵液pH下降，较低pH的环境影响了乳酸菌的生长[19]。发酵至36 h时，活菌数对数值达到最大值，8.89 lg（CFU/mL）。结果表明，植物乳植杆菌在不补充其他营养物质的情况下，能够在南果梨汁基质中良好生长。
图1 南果梨汁发酵过程中植物乳植杆菌活菌数的变化
Fig.1 Changes of the viable count of Lactiplantibacillus plantarum during fermentation process of Nanguo pear juice
2.2 南果梨汁发酵过程中pH值和总酸含量的变化
南果梨汁发酵过程中pH值和总酸含量的变化结果见图2。
图2 南果梨汁发酵过程中pH值（a）及总酸含量（b）的变化
Fig.2 Changes of pH values (a) and total acid contents (b) in Nanguo pear juice during fermentation process
由图2a可知，随着发酵的进行，南果梨汁pH值逐渐下降，尤其是在发酵前12 h显著下降（P＜0.05），从初始的5.09下降至3.98，并在36 h达到3.50。由图2b可知，与pH变化趋势不同，发酵过程中南果梨汁的总酸含量呈现明显的上升趋势，从初始的1.41 mg/mL上升至36 h 的3.53 mg/mL。研究表明[20]，乳酸菌发酵过程中会产生乳酸、乙酸和苹果酸等有机酸，使得总酸含量增加和pH值降低。总酸含量的增加可以增强南果梨汁口感的层次感和浓郁度，且pH值的降低也有助于南果梨汁保质期的延长[21]。
2.3 南果梨汁发酵过程中总糖、还原糖的变化
糖类物质是微生物发酵的重要碳源，其含量是评估发酵型饮料的重要参数。南果梨汁发酵过程中总糖和还原糖含量变化结果见图3。由图3a可知，随着发酵时间的延长，发酵液中总糖含量从发酵初始时的29.07 mg/mL下降至12 h的22.19 mg/mL，随后呈现缓慢下降趋势（P＜0.05），发酵结束时（36 h）总糖含量为20.96 mg/mL，与发酵前相比下降了27.89%，这与植物乳植杆菌在前12 h大量增殖，分解代谢能力强有关[22-23]。由图3b可知，还原糖含量与总糖含量变化趋势基本一致，发酵前12 h，还原糖含量下降趋势较快，随着发酵的继续，在发酵24 h还原糖含量略有增加，这可能是果汁中的蔗糖等糖苷类物质被植物乳植杆菌代谢的蔗糖酶降解为还原糖所致[24]。发酵结束时（36 h），还原糖含量下降了30.57%。
图3 南果梨汁发酵过程中总糖（a）及还原糖（b）含量的变化
Fig.3 Changes of total sugar (a) and reducing sugar (b) contents in Nanguo pear juice during fermentation process
2.4 南果梨汁发酵过程中总酚、总黄酮含量的变化
南果梨含有丰富的多酚、黄酮等抗氧化物质，能调节人体免疫力，对人体健康产生积极影响[3]。南果梨汁发酵过程中总酚、总黄酮含量的变化见图4。由图4a可知，随着发酵时间的延长，发酵南果梨汁中总酚含量增加较为迅速，发酵12 h后总酚含量从0.35 mg/mL增加至1.36 mg/mL，随后增加缓慢，发酵结束时（36 h）总酚含量达最大值，为1.64 mg/mL。与未发酵南果梨汁相比，总酚含量增加了78.65%。发酵过程中多酚含量的增加，可能是植物乳植杆菌产生的酶利用植物细胞物质合成了新的酚类化合物，以及大分子酚类物质的降解增加了游离形式的酚，使酚类总量增加[25]。
图4 南果梨汁发酵过程中总酚（a）和总黄酮（b）含量的变化
Fig.4 Changes of total phenolic (a) and total flavonoid (b) contents in Nanguo pear juice during fermentation process
由图4b可知，发酵南果梨汁中总黄酮的含量在发酵12 h内显著增加（P＜0.05），从最初的0.10 mg/mL增加至0.48 mg/mL，随后增加较为缓慢，发酵时间为24 h时达到最大值，为0.51 mg/mL。发酵后期（24～36 h），总黄酮含量略有下降，这是因为植物乳植杆菌发酵过程会产生包括β-葡萄糖苷酶在内的多种酶类，这些酶类能够将结合状态的黄酮糖苷水解成游离黄酮，随着发酵pH的降低，游离黄酮不稳定易被分解，导致了总黄酮含量的下降[26]。
2.5 南果梨汁发酵过程中抗氧化活性的变化
由图5可知，经植物乳植杆菌发酵后，南果梨汁中DPPH与ABTS自由基清除率显著提高（P＜0.05）。与未发酵的南果梨汁相比，DPPH和ABTS自由基清除率在0～8 h内显著升高（P＜0.05），并在发酵36 h时最高，分别为57.41%和65.06%，之后随发酵时间延长，DPPH和ABTS自由基清除率趋于稳定。研究表明，果汁发酵过程中，抗氧化能力与果汁中活性物质，特别是酚类物质含量密切相关[27]，这与本研究中，抗氧化活性的增加与总酚和总黄酮含量的增加趋势一致。结果表明，植物乳植杆菌发酵能够显著提高南果梨汁的抗氧化活性。
图5 南果梨汁发酵过程中DPPH（a）和ABTS（b）自由基清除率变化
Fig.5 Changes of DPPH (a) and ABTS (b) free radical scavenging rates of Nanguo pear juice during fermentation process
2.6 发酵南果梨果汁中活性物质与抗氧化能力相关性分析
发酵南果梨汁总酚、总黄酮与DPPH、ABTS自由基清除率相关性分析结果见表2。
表2 发酵南果梨汁活性物质与抗氧化能力的相关性分析
Table 2 Correlation analysis between active substances and antioxidant capacities of fermented Nanguo pear juice
注：“**”表示极显著相关（P＜0.01）。
指标 总酚 总黄酮 DPPH自由基清除率ABTS自由基清除率总酚总黄酮DPPH自由基清除率ABTS自由基清除率1 0.977**0.972**0.954**1 0.936**0.977**1 0.932** 1
由表2可知，总酚、总黄酮含量与DPPH、ABTS自由基清除率之间极显著正相关（P＜0.01）。表明随着总酚含量与总黄酮含量的增加，果汁的抗氧化能力也相应增强，发酵过程能够促进果汁中多酚类物质的释放和转化，进而提高其抗氧化能力。
2.7 发酵南果梨汁挥发性风味成分分析
南果梨汁植物乳植杆菌发酵前后、未接菌发酵南果梨汁（空白对照）样品中挥发性风味成分测定结果见图6，发酵南果梨汁各类别挥发性风味物质数量及含量结果见图7。
图6 植物乳植杆菌发酵南果梨汁中挥发性风味成分含量测定结果
Fig.6 Determination results of volatile flavor components contents in Nanguo pear juice fermented by Lactiplantibacillus plantarum
图7 发酵南果梨汁各类别挥发性风味物质数量（a）及占比（b）
Fig.7 Number (a) and proportion (b) of various categories volatile flavor components in fermented Nanguo pear juice
由图6可知，南果梨汁植物乳植杆菌发酵前后及未接菌发酵南果梨汁中共检出116种挥发性风味物质，其中酯类38种，醛类12种，烯烃类18种，醇类7种，酮类14种，烷烃类12种，其他类15种。南果梨汁植物乳植杆菌发酵前后、未接菌发酵南果梨汁分别共检出64种（酯类28种，醛类9种，烯烃类9种，醇类4种，酮类6种，烷烃类5种，其他类2种）、72种（酯类30种，醛类7种，烯烃类12种，醇类6种，酮类7种，烷烃类6种，其他类4种）、55种（酯类18种，醛类8种，烯烃类7种，醇类3种，酮类7种，烷烃类4种，其他类8种）挥发性风味物质。结果表明，南果梨汁植物乳植杆菌发酵前样品和未接菌发酵南果梨汁样品聚为一类，说明这两组样品中挥发性香味物质较为相似，而发酵后样品与其他两组样品的挥发性风味物质有差异。
由图7可知，与植物乳植杆菌发酵前南果梨汁的样品相比，植物乳植杆菌发酵后南果梨汁样品中酯类、醇类、酮类、烯烃类和烷烃类物质的种类和含量均有不同程度的增加。其中，酯类、醇类物质作为梨加工过程中重要的风味物质对香气的贡献程度较大[14]。酯类物质可以提供果汁果香与花香的香气特征[28]，与南果梨汁植物乳植杆菌发酵前样品相比，南果梨汁植物乳植杆菌发酵后样品中酯类物质相对含量增加了6.34%，新增加的丁酸乙酯、乙酸苯乙酯等酯类物质赋予了南果梨汁水果香和花香味；醇类物质具有明显的花香味特征，发酵后南果梨汁中醇类物质相对含量增加了62.22%，辛醇、苯乙醇、薄荷醇等新增加物质为南国梨汁提供了花香与甜味[29]；酮类物质同样对果汁香气特征有一定的改善作用，发酵后果汁中酮类物质相对含量增加了72.11%，新增加的甲基庚烯酮、异薄荷酮等酮类物质可以增强南果梨汁中水果味与花香味特征。此外，发酵后南果梨汁中醛类物质出现不同程度的下降，如苯甲醛、癸醛、反式-2-己烯醛等物质，醛类物质的降低会减少果汁中的草本味道，使香气更加柔和。
2.8 感官评价
不同发酵时间南果梨汁感官评价结果见图8。由图8可知，发酵开始时，果汁果香较淡，口感较为生涩，色泽也相对暗淡，整体风味层次不够丰富；在发酵时间为0～24 h时，南果梨汁的感官评分随发酵时间增加而逐步提升；在发酵时间为24 h时，发酵南果梨汁感官评分最高，为91.5分，果汁的果香味最为浓郁，口感细腻且醇厚，色泽更加明亮，显示出香气、口感和色泽的协调性，层次感丰富而细腻，整体风味达到了最佳平衡；在发酵时间＞24 h之后，发酵南果梨汁感官评分呈现下降趋势；发酵时间为24 h时，在发酵时间为36 h时，果汁的酸甜味趋于适中，澄清度有所提高，整体风味依然较好，但开始出现轻微涩感。由此可见，植物乳植杆菌发酵对南果梨汁感官品质的提升有积极的作用。
图8 不同发酵时间南果梨汁感官评价结果
Fig.8 Sensory evaluation results of Nanguo pear juice at different fermentation time
3 结论
本研究采用植物乳植杆菌发酵南果梨汁，系统分析了发酵过程中果汁理化性质、抗氧化活性、感官品质及挥发性香味成分的变化。植物乳植杆菌可有效利用南果梨汁进行发酵，活菌数在发酵36 h达到8.89 lg CFU/mL。发酵过程中南果梨汁pH值下降了1.59，总酸含量上升了60%，提升了果汁的层次感和稳定性；发酵显著提高了南果梨汁的抗氧化性能，发酵结束时总酚和总黄酮含量分别增加至1.64 mg/mL和0.51 mg/mL，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除率分别达到了57.41%和65.06%。植物乳植杆菌发酵南果梨汁前后及未接菌发酵南果梨汁样品中挥发性香味成分的分析结果表明，植物乳植杆菌的发酵使挥发性风味物质种类和含量提升，赋予果汁更加丰富和浓郁的香气，提升了其整体香气的复杂性和层次感。感官评价结果表明，植物乳植杆菌的发酵能够有效改善南果梨汁的风味，尤其是在发酵24 h时发酵南果梨汁感官评分最高，为91.5分，果汁香味浓郁，口感细腻醇厚，色泽明亮，整体风味明显提升。该研究揭示了植物乳植杆菌发酵南果梨汁过程中各理化指标和活性物质的变化规律，为南果梨发酵果汁的生产加工提供了重要的理论依据和技术支撑。
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