克氏原螯虾（Procambarus clarkii），俗称小龙虾[1-2]，在中国小龙虾产业发展蓬勃[3-4]，在加工中约60%～80%的虾头、虾壳常被转化为饲料或废弃，导致资源利用率低，还给环境带来压力[5-6]。克氏原螯虾的头部富含高浓度的粗蛋白、虾青素、脂质以及多种生物活性成分，是优质蛋白质的来源[7-8]，目前主要应用于饲料[9]、生物活性物质提取[10]、调味品加工[11]等方面，具有开发为海鲜调味品或食品添加剂的潜力，逐渐成为研究热点[12-13]。
克氏原螯虾的虾头酵素解析物往往土腥味重，改良口感以提升风味成为重要任务。目前，微生物发酵法常被用于品质改良[14]。微生物发酵法常用的菌种主要包括米曲霉[12]、黑曲霉[15]、芽孢杆菌[16]、乳酸菌和酵母菌[13]。乳酸菌作为一种益生菌，应用在食品中能提高食品风味，延长保存期[17]。鲁氏酵母则因其耐高渗透压特性[18]，在食品发酵中能高效转化糖类，生成乙醇、高级醇（如异戊醇和苯乙醇）以及芳香杂醇类化合物，提升食品香气，此外，鲁氏酵母菌体产生的谷氨酸等增香物质，具有改善品质，增加香气的作用[19-21]。解万翠等[15]利用植物乳杆菌、季氏毕赤氏酵母、黑曲霉混合发酵南美白对虾虾头制备虾头酱，产品展现了极好的风味，但发酵周期相对较长。 冯明会等[11]以克氏原螯虾头和鲜辣椒为基料，添加复合发酵剂，开发出香辣克氏原螯虾头酱，感官品质佳且风味物质含量丰富。
本研究以克氏原螯虾头为原料，接种鲁氏酵母菌和乳酸菌（1∶1）进行混合发酵制备克氏原螯虾虾头调味料。以氨基酸态氮含量和感官评分为评价指标，采用单因素试验和响应面试验对其发酵条件进行优化，并对其品质指标进行分析。 以期开发一种克氏原螯虾虾头调味料，促进克氏原螯虾虾头的综合利用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜克氏原螯虾：湖北省武汉市中百超市；鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）CGMCC2180：沂源康源生物科技有限公司；乳酸杆菌（Lactobacillus）：青岛凯麦森食品科技有限公司；甲醛、氢氧化钠（分析纯）：国药集团（上海）化学试剂有限公司；食盐（食品级）：市售。
1.2 仪器与设备
EL104电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TGL-20B高速离心机：上海安亭科学仪器厂；H1850高速台式离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；RE-53系列旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；PJ-04A粉碎机：上海助邦贸易有限公司。
1.3 方法
1.3.1 克氏原螯虾虾头调味料的制备工艺
克氏原螯虾进行彻底清洗，去除虾尾、虾头口器以及大触角，将分离出的虾头进行漂洗，清洗后的虾头置于电热恒温鼓风干燥箱中80 ℃干燥8 h，粉碎成粉，经160目过筛，即得克氏原螯虾虾头粉，干燥保存待用。
在克氏原螯虾虾头粉中以料液比1∶2加入水，放入多功能料理机中，均匀搅拌5 min。 加入5%食盐，再接种12%鲁氏酵母和乳酸杆菌混合菌剂（1∶1），在33 ℃恒温箱中发酵22 h。 发酵完成后，制成克氏原螯虾虾头调味料，将其装袋并冷藏于4 ℃冰箱中保存。
1.3.2 发酵条件优化
单因素试验：称取2 g虾头粉，按照料液比1∶2加入水，在1.3.1基础上，只改变一个因素，分别考察鲁氏酵母菌与乳酸菌剂混合菌剂的接种量（3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%）、食盐添加量（2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%）、发酵温度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃、42 ℃）、发酵时间（16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h）对克氏原螯虾虾头调味料感官评分及氨基酸态氮含量的影响。
响应面试验：在单因素试验结果的基础上，选择对克氏原螯虾虾头调味料氨基酸态氮含量和感官评分影响较大的发酵温度（A）、发酵时间（B）和混菌（1∶1）接种量（C）3个因素，利用Design-Expert 8.0.6软件设计3因素3水平的响应面优化试验，确定混合发酵制备克氏原螯虾虾头调味料的最优工艺条件，响应面试验因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of the response surface tests for fermentation conditions optimization
水平 A 发酵温度/℃ B 发酵时间/h C 混菌（1∶1）接种量/%-1 9 01 24 33 42 16 20 24 15 21
1.3.3 感官评价
选取经过培训的人员15名从鲜味、苦味、香味及醇厚感4个方面对克氏原螯虾虾头调味料进行感官评价，满分为100分。收集所有评价员的评分数据后，计算各项属性评分的平均值[22]。克氏原螯虾虾头调味料感官评价标准见表2。
表2 克氏原螯虾虾头调味料感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Procambarus clarkii head seasoning
项目 评分标准 得分/分鲜味（40分）苦味（20分）香味（20分）醇厚感（20分）鲜味较好乐于接受，鲜味一般滋味协调，鲜味较淡没有鲜味滋味纯正无明显苦味有较淡的苦味难以接受浓郁的虾香味和发酵香味较淡虾香味和发酵香味有难闻的腥异味口感纯正口味清淡，无醇厚感难以接受31～40 21～30 11～20 0～10 16～20 11～15 6～10 0～5 15～20 7～14 0～6 15～20 7～14 0～6
1.3.4 理化指标测定
氨基酸态氮：参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》进行检测；蛋白质：参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》进行检测；脂肪：参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》进行检测；碳水化合物：参照GB/T 9695.31—2008《肉制品中碳水化合物的测定》进行检测；钠：参照GB 5009.91—2017《食品安全国家标准 食品中钠的测定》进行检测。
2 结果与分析
2.1 克氏原螯虾虾头调味料发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 混菌（1∶1）接种量的确定
菌剂的加入缩短了克氏原螯虾虾头调味料的发酵周期，促进风味物质的形成[23]。 混菌（1∶1）接种量对克氏原螯虾虾头调味料品质的影响见图1。由图1可知，随着混菌（1∶1）接种量在3%～15%范围内的增加，氨基酸态氮含量及感官评分逐渐增加；当混菌（1∶1）接种量达到15%时，氨基酸态氮含量和感官评分均达到最高，分别为2.03 mg/mL和84分；当混菌（1∶1）接种量＞15%时，氨基酸态氮含量和感官评分都呈现下降趋势。综上所述，确定混菌（1∶1）接种量为15%。
图1 混菌（1∶1）接种量对克氏原螯虾虾头调味料氨基酸态氮含量和感官评分的影响
Fig.1 Effect of mixed bacteria (1∶1) inculum on amino nitrogen contents and sensory evaluation of Procambarus clarkii head seasoning
2.1.2 食盐添加量的确定
盐浓度会影响微生物生长和蛋白酶活性。当盐浓度较高时，微生物的生长受到抑制，蛋白酶活性降低，导致蛋白质分解速率减慢；而在低盐条件下，微生物生长和蛋白酶活性的抑制程度减弱，蛋白质降解更为迅速[12]。食盐添加量对克氏原螯虾虾头调味料品质的影响见图2。 由图2可知，随着食盐添加量在2%～6%范围内的增加，氨基酸态氮含量及感官评分逐渐增加；当食盐添加量为6%时，氨基酸态氮含量和感官评分均达到最高，分别为1.96 mg/mL和84分；食盐添加量＞6%时，氨基酸态氮含量和感官评分都呈现下降趋势。综上所述，确定食盐最适添加量为6%。
图2 食盐添加量对克氏原螯虾虾头调味料氨基酸态氮含量和感官评分的影响
Fig.2 Effects of salt addition on amino nitrogen contents and sensory evaluation of Procambarus clarkii head seasoning
2.1.3 发酵温度的确定
微生物的生长和代谢活动受温度影响。在适宜温度条件下，微生物繁殖迅速，代谢旺盛，能够合成更多的风味物质；而温度不当时，其代谢活性会受到抑制，导致风味物质含量降低，从而影响产品品质[24]。发酵温度对克氏原螯虾虾头调味料品质的影响见图3。由图3可知，随着发酵温度在24～33 ℃范围内的增加，氨基酸态氮含量及感官评分逐渐增加；当发酵温度为33 ℃时，氨基酸态氮含量和感官评价分值均达到最高，分别为1.88 mg/mL和85分；当发酵温度＞33 ℃时，氨基酸态氮含量和感官评分都呈下降趋势。综上所述，确定最适发酵温度为33 ℃。
图3 发酵温度对克氏原螯虾虾头调味料氨基酸态氮含量和感官评分的影响
Fig.3 Effects of fermentation temperature on amino nitrogen contents and sensory evaluation of Procambarus clarkii head seasoning
2.1.4 发酵时间的确定
在发酵过程中，随着发酵时间延长，菌种次级代谢产物乙醇、醋酸等会影响克氏原螯虾虾头调味料品质[11]。 发酵时间对克氏原螯虾虾头调味料品质的影响见图4。由图4可知，随着发酵时间在16～20 h范围内的增加，氨基酸态氮含量及感官评分逐渐增加；当发酵时间达到20 h时，氨基酸态氮含量和感官评分均达到最高，分别为1.96 mg/mL和85分；当发酵时间＞20 h后，氨基酸态氮含量变化趋于稳定，感官评分明显降低。综上所述，确定最适发酵时间为20 h。
图4 发酵时间对克氏原螯虾虾头调味料氨基酸态氮含量和感官评分的影响
Fig.4 Effects of fermentation time on amino nitrogen contents and sensory evaluation of Procambarus clarkii head seasoning
2.2 响应面试验结果与分析
根据单因素试验结果，以发酵温度（A）、发酵时间（B）、菌剂接种量（C）3个因素为自变量，氨基酸态氮含量（Y）为响应值，采用响应面试验优化发酵工艺，响应面试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 发酵条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization
试验号A 发酵温度/℃B 发酵时间/h C 混菌（1∶1）接种量/%Y 氨基酸态氮含量/（mg·mL-1）1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 9 11 12 13 14 15 16 17 42 33 24 42 33 24 42 33 24 33 33 42 24 33 33 33 33 20 16 16 24 20 20 16 20 24 20 24 20 20 16 24 20 20 21 15 15 15 21 15 15 15 15 21 21 9 9 9 1 5 15 1.53 1.88 1.62 1.75 2.11 1.72 1.65 2.15 1.68 2.08 1.96 1.87 1.53 1.72 1.75 2.09 2.12
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
项目 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型**ABCA B** *AC BC A2 B2 C2残差失拟项净误差总离差0.72 7.81×10-3 9.11×10-3 0.1 4.00×10-4 5.63×10-3 6.25×10-4 0.38 0.077 0.092 6.83×10-3 3.83×10-3 3.00×10-3 0.73 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 0.081 7.81×10-3 9.11×10-3 0.1 4.00×10-4 5.63×10-3 6.25×10-4 0.38 0.077 0.092 9.75×10-4 1.28×10-3 7.50×10-4 82.57 8.01 9.35 103.85 0.41 5.77 0.64 388.66 78.7 93.95＜0.000 1 0.025 4 0.018 4＜0.000 1 0.542 2 0.047 3 0.449 7＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1** ******1.7 0.303 8
采用Design-Expert 8.0.6软件针对表3试验结果进行多元二次回归拟合，二次多项回归模型方程为：Y=2.11+0.031A+0.034B+0.11C+0.010AB+0.038AC+0.013BC-0.30A2-0.14B2-0.15C2。
由表4可知，该模型极显著（P值＜0.000 1），失拟项不显著（P值=0.303 8＞0.05），说明模型可靠、有效。由P值可知，一次项C，二次项A2、B2、C2对氨基酸态氮含量影响极显著（P＜0.01），一次项A、B，交互项AC对氨基酸态氮含量影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，对氨基酸态氮含量影响因素的主次顺序为：混菌（1∶1）接种量（C）＞发酵时间（B）＞发酵温度（A）。
当响应面越陡峭、等高线越趋于椭圆形时，表明两个因素之间的交互作用对响应值的影响越显著，即交互作用对结果的贡献越大[25]。因素间交互作用对克氏原螯虾虾头调味料氨基酸态氮含量的影响见图5。 由图5可知，交互项AB、BC等高线趋于圆形，响应曲面较平缓，表明AB、BC交互作用不显著（P＞0.05）；交互项AC等高线为椭圆形，响应曲面较陡峭，表明菌剂接种量及发酵温度交互作用显著（P＜0.05），这与方差分析结果一致。
图5 各因素间交互作用对克氏原螯虾虾头调味料氨基酸态氮含量影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the amino acid nitrogen contents of Procambarus clarkii head seasoning
2.3 验证试验
通过Design-Expert 8.0.6软件得出克氏原螯虾虾头调味料的最佳发酵条件为：发酵温度33.71 ℃、发酵时间20.59 h、菌种接种量17.39%，在此优化条件下，克氏原螯虾虾头调味料中氨基酸态氮含量预测值为2.14 mg/mL。为方便实际操作，将发酵条件修正为：发酵温度34 ℃，发酵时间20.6 h，菌剂接种量17.4%，在此条件下，经过3次验证试验，测得克氏原螯虾虾头调味料中氨基酸态氮含量实际值为2.21 mg/mL，感官评分为86分。
2.4 克氏原螯虾虾头调味料感官品质及理化指标检测结果
克氏原螯虾虾头调味料色泽呈红褐色，光泽鲜明，色泽均匀；气味虾香浓郁，加热后香气更加突出，无不良气味；鲜味突出，口感醇厚，咸甜适口，无异味；形态均匀分布，无明显悬浊物。感官品质符合GB 10133—2014《食品安全国家标准水产调味品》和NY/T 1710—2020《绿色食品水产调味品》的相关要求。本研究对克氏原螯虾虾头调味料的理化指标进行测定，蛋白质含量为4.58 g/100 mL，脂肪未检出，碳水化合物含量为6.2 g/100 mL，钠含量为2 650 mg/100 mL。
3 结论
本研究以氨基酸态氮含量和感官评分为主要评价指标，采用单因素试验及响应面法优化得出其最佳发酵条件为：混菌（1∶1）接种量17.4%，食盐添加量6%，发酵温度34 ℃，发酵时间20.6 h，在这些条件下，所制备的克氏原螯虾虾头调味料中氨基酸态氮质量浓度为2.21 mg/mL，感官评分为86分。 其蛋白质含量为4.58 g/100 mL，碳水化合物含量为6.2 g/100 mL，钠含量为2 650 mg/100 mL，显现较高的风味和品质。通过鲁氏酵母和乳酸杆菌的联合发酵，能够有效地提升克氏原螯虾虾头调味料的风味，使其成为一种具有丰富风味的增鲜调味料，提升了资源的高值化利用。
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