苹果（Malus pumila Mill.）含有丰富的游离酸、钙、铁、维生素C（vitamin C，VC）、类黄酮、膳食纤维和多酚等多种营养物质，以苹果作为原料可生产果汁、果酒和果醋等产品[1]。由于苹果具有酸甜的口感和浓郁的香气，深受果汁加工行业的喜爱。 随着果蔬汁加工技术的快速发展，微生物发酵技术更多运用于果蔬汁生产，微生物在发酵过程中可利用果蔬富含的糖类和有机酸，改变挥发性风味物质的组成及含量，丰富果蔬汁风味[2]。
乳酸菌作为益生菌包括链球菌属、双歧杆菌属和乳杆菌属等，具有改善胃肠环境、助消化、防腹泻、降血压和提升人体免疫力等多种生理功能而被广泛使用[3-6]。已有相关研究证明乳酸菌发酵能够丰富果蔬汁的营养和改善果蔬汁活性功能[7]。LI H C等[8]研究发现，嗜酸乳杆菌发酵苹果汁能够降低尿酸和肌酐水平并且可以调节肠道微生物菌群失调。LI H C等[9]研究表明，运用酿酒酵母和植物乳杆菌混合发酵苹果汁可提升其抗氧化活性。吴小敏等[10]优化植物乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵苹果汁工艺发现，益生菌能够增加苹果汁中香气成分含量。酒类酒球菌是一类可进行苹果酸-乳酸发酵的重要乳酸菌，常应用于葡萄酒酿造在发酵过程中产生β-葡萄糖苷酶，该酶可降解糖苷并释放香气物质，同时可以降低苹果酸含量，提升发酵液环境稳定性和改善产品口感[11-13]。当前研究更多集中于单类菌种发酵苹果汁，对混合菌种发酵苹果汁研究报道较少。
本研究以云南昭通苹果为实验对象，利用酒类酒球菌（Oenococcus oeni）和双歧杆菌（Bifidobacterium）混合发酵苹果汁，以感官评分为响应值，采用单因素试验和响应面试验优化其发酵工艺条件，对其理化指标、微生物指标及感官品质进行分析。 采用气相色谱-质谱联用法（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）测定发酵苹果汁的香气成分，探究混合菌种发酵苹果汁风味特征，旨在为开发健康营养的发酵苹果汁饮品提供理论依据，促进苹果深加工产业发展。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌株
苹果（产地云南昭通）、白砂糖：市售；酒类酒球菌（Oenococcus oeni）冻干粉：烟台帝伯仕自酿机有限公司；双歧杆菌（Bifidobacterium）冻干粉：丽珠集团丽珠制药厂。
1.1.2 化学试剂
柠檬酸、D-异抗坏血酸钠、氢氧化钠、酚酞指示剂、乙醇、浓盐酸、硫酸铜、亚甲蓝、酒石酸钾钠、硫酸铜、无水葡萄糖、亚铁氰化钾、氯化钠（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。
1.1.3 培养基
MRS培养基、VRBA培养基：杭州百思生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
SP185-1800型破壁机：苏泊尔生活电器有限公司；JY10002型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；MLS-3781L-PC型高压蒸汽灭菌锅：松下健康医疗器械株式会社；BSP-250型生化培养箱、BMJ-250C型霉菌培养箱：上海博讯实业有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；DZS-706-A型多参数分析仪：上海雷磁仪器厂；PH-100B型pH计：上海力辰仪器科技有限公司；TD-45型数显糖度计：温州韦度电子有限公司；TGL-16G型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司；FD-2型密封式恒温可调电加热器：嘉兴市欣欣仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵苹果汁加工工艺流程及操作要点
原料预处理→护色→榨汁、过滤、冷却→调配→菌种活化、接种发酵→低温熟化→成品
操作要点：选择新鲜昭通苹果去皮、去核、切块。以料液比为1.0∶1.5（g∶mL）加入护色液（0.5%柠檬酸和0.03%异抗坏血酸）浸泡15 min，置于95 ℃热烫5 min，抑制苹果褐变[14]。将经过护色处理的苹果榨汁，按苹果汁与水料液比为7∶3（g∶mL）制备苹果汁，分别使用100目和200目纱布进行两次过滤，将过滤完成的苹果汁迅速冷却至室温，添加白砂糖将苹果汁糖度调整为15°Bx。以3%接种量（V/V）接入种子液（按1%接种量将酒类酒球菌和双歧杆菌（1∶1）接种至灭菌（121 ℃、15 min）后的苹果汁（200 mL）中，于25 ℃条件下培养活化24 h作为种子液），置于28 ℃培养箱进行恒温发酵，发酵时间为48 h。发酵结束后将样品冷藏（4 ℃）后熟6 h，得到发酵苹果汁成品。
1.3.2 发酵工艺条件优化
单因素试验：以感官评分和pH值作为评价指标，分别考察白砂糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、混菌（1∶1）接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵时间（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）和发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）对苹果汁发酵效果的影响。
响应面试验：根据单因素试验结果，以感官评分（Y）为响应值，以白砂糖添加量（A）、混菌（1∶1）接种量（B）、发酵时间（C）和发酵温度（D）为自变量，进行4因素3水平响应面试验。
1.3.3 发酵苹果汁感官评价
采用评分检验法，选择10名感官性能良好的评价员从口感、香味与滋味、组织状态及色泽方面对发酵苹果汁进行感官评价，满分为100分[15]。 发酵苹果汁感官评分标准见表1。
表1 发酵苹果汁感官评分标准
Table 1 Sensory score standards for fermented apple juice
因素 评分标准 分数/分口感（30分）香味与滋味（20分）组织状态（30分）色泽（20分）酸甜适宜，细腻爽滑，口感好酸味或甜味过度或不足，口感一般酸味较浅，口感差，无特有风味具有苹果果香和浓郁发酵香味，无异味苹果果香和发酵香味较淡，无异味基本没有苹果的香味和发酵香味，有异味质地均匀，无杂质，无分层质地较均匀，液体有轻微分层质地不均匀，液体有明显分层颜色协调具有光泽，呈淡黄色色泽过暗，呈暗黄色颜色不协调，呈黄褐色26～30 18～25 0～17 16～20 10～15 0～9 26～30 18～25 0～17 16～20 10～15 0～9
1.3.4 理化指标
总糖测定：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[16-17]；总酸（以乳酸计）测定：参照GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》[18]；可溶性固形物测定：糖度计法[19]；pH值测定：pH计；乳酸菌总数测定：参考GB 4789.35—2023《乳酸菌检验》[20]，大肠杆菌测定：参考GB 4789.3—2016《大肠菌群计数》[21]。
1.3.5 发酵苹果汁挥发性风味物质分析
利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法分析发酵苹果汁挥发性风味成分。
样品制备：将100 mL发酵苹果汁置于烧瓶中，加热得到馏出液，冷却，使用0.22 μm滤膜过滤，待上机。
GC条件：HP-5MS弹性石英毛细管柱（300mm×0.25 mm×0.25 μm）；载气为高纯氦气（He）；初始柱温40 ℃，保持3 min；以3 ℃/min速率升温至100 ℃，保持3 min；以5 ℃/min速率升温至170 ℃，保持5 min；以10 ℃/min速率升温至240 ℃，保持5 min；进样温度240 ℃；不分流进样。
MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，离子源温度240 ℃；接口温度230 ℃；电子能量70 eV，质量扫描范围m/z：30～500 amu。
定性定量分析：与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11.L质谱数据库进行对比定性，筛选出相似度＞70%的成分作为有效香气物质。利用峰面积归一化法进行定量。
1.3.6 数据处理
采用Design Expert 13.0及Excel 2024进行数据分析，采用Origin Pro 2021绘图。
2 结果与分析
2.1 苹果汁发酵工艺优化单因素试验结果
不同因素对发酵苹果汁感官评分及pH值的影响见图1。
图1 不同因素对发酵苹果汁感官评分及pH值的影响
Fig.1 Effects of different factors on sensory scores and pH values of fermented apple juice
由图1（A）可知，当白砂糖添加量为2%～6%时，pH值和感官评分呈上升趋势；添加量为6%时，感官评分最高，为85.3分，此时，pH值为4.15；白砂糖添加量＞6%时，感官评分下降，pH值持续上升。 这可能因为糖含量可调节糖酸比，适当糖含量可以促进苹果酸-乳酸发酵，导致苹果酸含量降低，pH值上升；同时pH值过低不利于菌种生长[22-24]。因此，确定最佳白砂糖添加量为6%。
由图1（B）可知，当混菌（1∶1）接种量为1%～3%时，发酵苹果汁感官评分呈上升趋势，pH值呈下降趋势，混菌（1∶1）接种量为3%时，感官评分最高，为85.10分，此时，pH值为4.3；混菌（1∶1）接种量＞3%时，感官评分和pH值下降。这可能是因为菌种量过少导致发酵不彻底，接种量过多，菌种生长消耗过多营养，菌种降酸能力减弱，导致pH值下降，影响发酵苹果汁口感[25]。因此，确定最佳混菌（1∶1）接种量为3%。
由图1（C）可知，当发酵时间为24～48 h时，感官评分呈上升趋势，pH值呈下降趋势，发酵时间在48 h时感官评分最高，为87.00分，此时，pH值为3.99；发酵时间＞48 h时，感官评分开始下降。这可能是由于随着发酵时间延长，营养物质不断消耗，导致微生物生长受到限制，苹果酸-乳酸发酵受到抑制，pH值下降[10]。因此，确定最佳发酵时间为48 h。
由图1（D）可知，当发酵温度为24～26 ℃时，感官评分上升，pH值下降；发酵温度为26 ℃时，感官评分最高，为87.33分，此时，pH值为4.05；发酵温度＞26 ℃时感官评分下降，pH值持续上升。 这可能是因为一定温度条件下促进菌种生长，酒类酒球菌降酸能力增强，导致pH值上升；过高的发酵温度抑制菌种生长，影响发酵苹果汁风味形成[10]。因此，确定最佳发酵温度为26 ℃。
2.2 发酵条件优化响应面试验
2.2.1 响应面试验设计与结果
在单因素试验结果的基础上，以感官评分（Y）为响应值，以白砂糖添加量（A）、混菌（1∶1）接种量（B）、发酵时间（C）、发酵温度（D）为自变量，采用Design 13.0设计4因素3水平响应面试验，响应面试验设计及结果见表2，方差分析见表3。
表2 发酵工艺条件优化响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface tests for fermentation process conditions optimization
试验号 A B C D Y 感官评分/分1234567891 0 0（6%）1（8%）1（60 h）0（48 h）0（26 ℃）0 001-1（2%）-1 0（3%）0 1（4%）00 1（28 ℃）-1（4%）0 0 -00 1101 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 0 0 1 -1 0 --1（24 ℃）1 0 0 0 1 -1 0 0 00 -1 1 0 -011100000000 0 0 1 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0-1 1010 0001 --1（36 h）-1 0 0.0 0 -1-1 1 0 0 0 1 0 0 --1 0 01 -000 100011 1 1 0 -1 1 0 0 -1-1 0 76.5 79.0 89.5 84.5 85.8 78.2 86.9 85.2 88.2 84.9 86.5 90.9 84.2 85.4 86.4 86.8 84.9 83.9 89.8 89.1 87.9 87.6 84.5 84.8 85.2 86.4 83.5 85.9 87.9
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
来源 偏方平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14 ABCDA B*********AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总和271.02 16.33 23.80 71.54 0.65 8.41 16.81 0.040 16.81 0.20 0.062 55.50 66.94 36.20 7.85 23.50 19.60 3.90 294.52 111111111111111 4 11.53 9.73 14.18 42.62 0.39 5.01 10.01 0.024 10.01 0.12 0.037 33.06 39.88 21.57 4.68＜0.000 1 0.007 5 0.002 1＜0.000 1 0.542 7 0.042 0 0.006 9 0.879 5 0.006 9 0.733 5 0.849 8＜0.000 1＜0.000 1 0.000 4 0.048 4***********10 4 28 19.36 16.33 23.80 71.54 0.65 8.41 16.81 0.040 16.81 0.20 0.062 55.50 66.94 36.20 7.85 1.68 1.96 0.98 2.01 0.261 5
对表2结果进行二次多项回归拟合，得到发酵苹果汁感官评分与各因素间的回归方程为：Y=89.50-1.17A+1.41B-2.44C+0.23D+1.45AB-2.05AC-0.10AD+2.05BC-0.23BD-0.13CD-2.92A2-3.21B2-2.36C 2-1.10D2。
由表3可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＞0.005），表明此模型可行，误差较小。 决定系数R2为0.920 2，调整决定系数R2adj=0.840 4，说明方程拟合度较好，模型建立有效。由P值可知，一次项A、B、C，交互项AC、BC，二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AB，二次项D2对结果影响显著（P＜0.05）。由F值可知，各因素对发酵苹果汁感官评分的影响顺序为发酵时间（C）＞混菌（1∶1）接种量（B）＞白砂糖添加量（A）＞发酵温度（D）。
响应面和等高线能够更好反映出各因素对感官评分影响的程度强弱和变化范围，响应曲面越陡，等高线越趋近椭圆形，说明两因素之间的交互作用越显著；反之，响应曲面越平缓，等高线越接近圆形，说明两因素之间的交互作用不显著[26]。各因素间交互作用对发酵苹果汁感官评分影响的响应曲面和等高线见图2。
图2 不同因素间交互作用对发酵苹果汁感官评分影响的响应曲面和等高线
Fig.2 Response surface plots and contour lines of effect of interaction of various factors on sensory score of fermented apple juice
由图2可知，白砂糖添加量（A）和菌种接种量（B）的交互作用响应曲面坡度较陡，等高线接近椭圆，对感官评分影响显著。白砂糖添加量（A）和发酵时间（C）、菌种接种量（B）和发酵时间（C）的交互作用响应曲面坡度陡峭，等高线趋近椭圆，对感官评分影响极显著，与方差分析结果一致。
2.2.2 验证试验
经过Design 13.0响应面分析，由回归模型可知，发酵苹果汁的最佳工艺条件为白砂糖添加量5.97%、接种量3.05%、发酵温度26.26 ℃、发酵时间42.13 h。在此优化条件下，发酵苹果汁感官评分预测值为90.16分，考虑实际操作可行性，将发酵工艺条件修正为白砂糖添加量6%、接种量3%、发酵温度26 ℃、发酵时间42 h，进行3次平行验证试验，其感官评分实际值为90.45分，与模型预测值接近，发酵苹果汁在色泽、香气、口感、组织状态等感官品质方面表现良好，说明该模型可用于混合菌种发酵苹果汁的工艺优化。
2.3 发酵苹果汁理化及微生物指标检测结果
发酵苹果汁理化及微生物指标检测结果表明，其pH值为3.82，可溶性固形物含量为10.4%，总酸含量（以乳酸计）为3.38 g/100 mL，总糖含量为3.85 g/100 mL，乳酸菌总数为7.4×108 CFU/mL，铅含量未检出，未检出大肠杆菌。 符合Q/JJL 0001S—2023《发酵果汁饮料》中可溶性固形物含量≥2%、铅含量≤0.02 mg/kg和乳酸菌数≥1×106 CFU/mL的要求[27]。
2.4 发酵苹果汁香气成分分析
发酵苹果汁香气成分GC-MS分析结果见表4。由表4可知，发酵苹果汁共检出21种香气成分，其中醇类6种、酮类4种、酚类3种、烯类2种、醛类1种、酸类1种和其他类4种，其相对含量分别为16.47%、11.19%、0.39%、1.38%、2.51%、59.46%、8.6%。 醇类成分最丰富，多菌混合发酵有助于苹果汁中醇类物质的生成[28]。醇类化合物中二甲基硅烷二醇（4.01%）和乙醇相对含量（3.92%）较高，醇类化合物是发酵苹果汁中重要的香气成分，主要来源于氨基酸和糖的降解，使发酵苹果汁具有淡雅的香气[29]。 酸类化合物是合成酯类化合物的前体物质，能够起到助香的作用[30]。 乙酸（59.46%）是唯一酸类化合物，也是相对含量最高的单体成分，是主要香气物质。 醛酮类化合物有5-羟甲基糠醛（2.51%）、丙酮（2.86%）、3-羟基-2-丁酮（6.82%）、羟基丙酮（0.63%）、2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮（0.88%），作为发酵苹果汁中重要香气化合物，与酸类化合物对发酵苹果汁香气起到协调的作用[10]。此外，发酵苹果汁还检测出酚类、萜类和其他类香气成分。 酚类化合物检出含量较少，2,4-二叔丁基苯酚（0.13%）具有焦糊味。萜类化合物中罗勒烯（0.69%）具有草香、花香和橙花油香气，蒎烯（0.69%）表现为松萜味，萜类化合物具有抗炎和抗氧化等生理作用[31]。 其他香气成分中2-乙酰基呋喃（0.18%）由氨基酸和还原糖通过美拉德反应生成，具有烘烤香，可对发酵苹果汁进行风味修饰[32]。这些成分的共同作用丰富了发酵苹果汁香气，对发酵苹果汁良好香气的形成具有积极作用。
表4 发酵苹果汁挥发性香气成分含量GC-MS分析结果
Table 4 GC-MS analysis results of volatile aroma components contents in fermented apple juice
类别 保留时间/min CAS编号 化合物 香气描述[32-36] 相对含量/%淡迷迭香醇类（6种）苦杏仁味具有特殊苦辣味酮类（4种）4-萜烯醇二甲基硅烷二醇乙醇糠醇3-呋喃甲醇3-氟苄醇丙酮3-羟基-2-丁酮羟基丙酮2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮酚类（3种）具有焦糊味萜类（2种）酸类（1种）醛类（1种）有草香、花香并伴有橙花油气息具有焦糊味其他（4种）20.703 22.652 3.525 22.81 23.034 41.124 2.588 13.025 13.319 36.925 37.909 38.159 38.251 23.511 23.533 16.909 40.914 1.953 18.085 18.122 27.459 562-74-3 1066-42-8 64-17-5 98-00-0 4412-91-3 456-47-3 67-64-1 513-86-0 116-09-6 28564-83-2 5875-45-6 96-76-4 1138-52-9 7785-70-8 13877-91-3 64-19-7 67-47-0 110-54-3 1192-62-7 25016-16-4 541-05-9 2,5-二叔丁基酚2,4-二叔丁基苯酚3,5-二叔丁基苯酚蒎烯罗勒烯乙酸5-羟甲基糠醛正己烷2-乙酰基呋喃4-乙酰氨基-1H-吡咯六甲基环三硅氧烷具有烘烤香0.25 4.01 3.92 2.89 2.89 2.51 2.86 6.82 0.63 0.88 0.13 0.13 0.13 0.69 0.69 59.46 2.51 7.95 0.18 0.18 0.30
3 结论
本研究以昭通高原苹果为原料，酒类酒球菌（Oenococcus oeni）和双歧杆菌（Bifidobacterium）为发酵菌种制备发酵苹果汁。以感官评分作为响应值，采用单因素试验和响应面试验优化苹果汁发酵工艺，并对其理化指标、微生物指标和感官品质进行分析。 混合菌种发酵苹果汁最优工艺条件为白砂糖添加量6%、接种量3%、发酵时间42 h、发酵温度26 ℃。 在此优化条件下，发酵苹果汁感官评分为90.45分，其pH值、总酸、总糖及可溶性固形物含量分别为3.82、3.38 g/100 g、3.85 g/100 mL和10.4%，乳酸菌总数为7.4×108 CFU/mL。发酵苹果汁成品中共检出21种挥发性风味成分，包括6种醇类、4种酮类、3种酚类、2种烯类、1种醛类、1种酸类和4种其他类。 本研究结果可为混合菌种发酵苹果汁产品的开发提供理论依据和技术支撑。
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