苦荞（Fagopyrum tataricum），又称荞叶七，是一种谷类作物，因其丰富的营养成分被誉为五谷之王[1]。作为兼具食用和药用价值的特色杂粮，苦荞富含多种生物活性物质[2]、可溶性膳食纤维[3]、脂肪、矿物质和维生素[4]，以及18种氨基酸和多种微量元素[5-8]。苦荞在糖尿病[9-10]、高血压[11]、冠心病[12]等方面具有辅助治疗效果，因此成为健康食品领域的研究热点。目前苦荞的加工产品，如苦荞茶、苦荞饼干和苦荞高浓度白酒等已有报道[13]，但苦荞啤酒还鲜有上市。
啤酒是一种酒精饮料，主要以麦芽为原料，加入啤酒花，在液态糊化和糖化的过程中，经过液态发酵酿制而成[13-14]。啤酒中富含氨基酸、维生素、有机酸、酚、酮类物质，可以促进人体的消化和吸收。功能性啤酒是指在啤酒的生产过程中添加了各种具有保健、抗疲劳、降血脂、抗氧化等功效的辅料酿制而成[15-16]。 苦荞啤酒以麦芽为主料，苦荞为辅料，一起经过糊化、糖化、发酵和陈酿而成[16]，它既保持了传统啤酒的风味特点，又融入了苦荞的功能成分，具有独特的口感和健康价值，符合功能性啤酒的特性。 据报道苦荞的添加量为20%～40%时，不仅能提升啤酒中多酚含量和抗氧化能力，还改善了风味特征[17]。 DABIJA A等[18]研究表明，苦荞的添加增加了啤酒中酯类物质的种类和含量，减少了醇类物质种类和含量。LIU Y等[19]研究表明，荞麦啤酒中有着丰富的黄酮和多酚类物质，表现出良好的抗氧化活性。
本研究将不同添加量（10%～50%）的苦荞加入麦芽中制备苦荞啤酒，通过感官评价、理化指标及挥发性风味物质分析确定最佳苦荞添加量，并结合气味活性值（odor activity value，OAV）及变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值确定苦荞啤酒中关键差异挥发性风味物质（OAV≥1，VIP值＞1）。以期拓展苦荞用途和丰富啤酒种类，为苦荞深加工及功能性啤酒开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
麦芽、苦荞：永顺泰（昌乐）麦芽有限公司；啤酒花：淮坊蓝乔精酿啤酒原料有限公司；安琪干酵母CN36：安琪酵母股份有限公司；碘液（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；2-辛醇标准品（纯度＞99.5%）：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
KOGV328A高精度恒温糖化锅：杭州正久机械制造股份有限公司；6890-MS 5973 N型气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC）联用仪：美国Agilent公司；DVB/CAR/PDMS固相微萃取头（50/30 μm）、DB-5色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）：美国J&W Sci.公司。
1.3 方法
1.3.1 苦荞啤酒加工工艺流程及操作要点
苦荞、麦芽按比例混合→破碎→糊化、糖化→洗糟→过滤→煮沸→冷却→过滤→发酵→装瓶→灭菌→成品
操作要点：
粉碎：选取质量合格的麦芽、苦荞（质量比为3∶7）进行粉碎，粉碎达到30目到50目之间，便于麦汁过滤[20]。
糊化、糖化：苦荞添加量为麦芽与苦荞总投料量计算，按料液比为1∶4加水，先将水加热至50 ℃，投入粉碎的麦芽和苦荞，恒温保持20 min，再加热至65 ℃，保温40 min，升温至68 ℃，保温30 min，升温到72 ℃，保温10 min，使其充分进行糖化。糖化结束后取一小滴在白瓷盘上，滴入碘液，碘液不变色即证明分解完全，若出现蓝色，紫色，红色等其他颜色，证明溶液中淀粉未糖化完全，则升温至68 ℃继续糖化直至糖化完全，过滤，备用。
洗糟：使用60 ℃左右的热水清洗麦芽、苦荞残渣，以提取残渣中的余糖，过滤后保留滤液。
煮沸：将过滤后的麦汁煮沸，并持续60～90 min。在达到沸点的同时分3次添加啤酒花（30 g/L）。
冷却发酵：灭菌过滤掉底部的凝固物，上清液冷却至室温，加入0.5‰啤酒酵母粉，12 ℃保温发酵7 d，前发酵（Q）结束后进入后发酵（H）阶段，于5 ℃条件下发酵21 d结束发酵后装瓶，于65 ℃条件下灭菌30 min即得苦荞啤酒成品。
1.3.2 不同苦荞添加量对苦荞啤酒品质的影响
在上述苦荞啤酒加工工艺流程基础上，分别考察苦荞添加量（10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、40%、50%）对苦荞啤酒感官评分的影响，确定苦荞的较优添加量后，将其添加到麦芽中制备苦荞啤酒，并对后发酵后苦荞啤酒的理化指标进行分析，并对比了前发酵、后发酵苦荞啤酒挥发性风味物质差异。
1.3.3 感官评价
感官评价参照邓涵玉等[21]的方法稍作修改执行。由10名经过专业培训且具备啤酒感官评估经验的评审人员对苦荞啤酒进行了感官测试。 评分总分100分，主要包括外观（20分）、持泡性（15分）、香气（25分）、口感（40分）。
表1 苦荞啤酒感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation criteria of tartary buckwheat beer
项目 评分标准 感官评分/分外观（20分）持泡性（15分）香气（25分）口感（40分）酒体清澈澄亮，色泽棕黄明亮鲜艳酒体较为清澈澄亮，色泽比较明亮，少许悬浮物酒体不清亮，有悬浮物泡沫洁白细腻厚实，挂壁持久泡沫较洁白细腻，挂壁较持久泡沫松散不洁白，挂壁时间较短或不起泡沫具有明显的酒花香、麦芽香、苦荞香味，香味协调酒花香气、麦芽香气、苦荞香味不明显，香味比较协调酒香一般，其他香气较淡，香味不协调酒体柔和，苦荞味明显，较爽口、有杀口力，口感协调酒体粗糙淡薄、苦荞味不明显，略有杂味，过苦或过甜杂味明显，无杀口感，口味杂乱16～20 11～15≤10 12～15 9～11≤8 21～25 16～20≤15 31～40 21～30≤20
1.3.4 理化指标测定
色度的测定：采用GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》比色计法；酒精度的测定：采用GB 5009.225—2023《食品安全国家标准酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》的酒精计法；总酸的测定：采用GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中酸碱指示剂滴定法。
1.3.5 挥发性风味物质测定
采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对苦荞啤酒中挥发性风味物质进行检测[22]，稍作修改。
HS-SPME条件：萃取头在GC进样口温度为240 ℃的条件下老化1 h，备用；取样品1 mL于25 mL顶空进样瓶中，加入40 μL 200 μg/mL 2-辛醇标准品和4 mL超纯水，顶空瓶密封；在70 ℃条件下平衡30 min，将已活化的萃取头穿过密封垫插入顶空瓶吸附40 min，插入GC进样口解吸5 min。
气相色谱条件：载气为高纯氦气（He），流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；不分流进样。升温程序为初始柱温60 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至140 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至210 ℃，保持10 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保持3 min。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，温度200 ℃；发射电流150 μA；倍增器电压1 037 V；萃取头接口温度220 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围45～500 amu。
定性分析：参考文献[23-24]中的方法，采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2014 s标准质谱库检索进行定性，挥发性风味化合物含量计算方式如下：
查询各挥发性物质在水中的气味阈值[25]，并计算化合物的气味活性值（OAV），OAV为化合物在啤酒样中的含量与该组分在水中的气味阈值（mg/kg）的比值。当OAV≥1时，则认定该组分对啤酒香气具有重要贡献，为关键挥发性风味物质。
1.3.6 数据处理
采用Excel 2019软件、Origin 2018进行数据分析，IBM SPSSstatistics26.0等软件进行显著性分析，采用TBtools1.098软件作聚类分析热图。
2 结果与分析
2.1 不同苦荞啤酒感官评价分析
不同苦荞啤酒感官评价结果见表2。 由表2可知，随着苦荞添加量在10%～50%范围内增加时，外观及持泡性评分逐渐降低，香气评分逐渐增加并趋于平稳，口感评分及感官评分总分呈先增加后降低的趋势，当苦荞添加量为30%时，感官评分总分达最高值，为90.5分。当苦荞添加量较低时，苦荞特征风味不突出；当苦荞添加量超过35%时，啤酒会变得浑浊，色泽暗淡，甚至呈黑褐色，泡沫稀少且不稳定；酒花香和麦芽香减弱，可能出现异味，口感苦涩。同时，苦荞比例高发酵能力下降，酒味变淡，后期易被微生物污染，导致悬浮物和杂味，整体评分降低。欧美国家[27]苦荞啤酒中苦荞的添加量一般在10%～30%，非洲地区[28]的配方啤酒中也至少保证75%以上的大麦芽成分，因此本研究选择20%～35%的苦荞添加量制作苦荞啤酒继续后续研究。
表2 不同苦荞啤酒的感官评分结果
Table 2 Sensory evaluation results of different tartary buckwheat beer
不同苦荞添加量/%10 15 20 25 30 35 40 45 50感官评分外观/分 持泡性/分 香气/分 口感/分 总分/分18.4 17.1 16.8 16.5 16.5 16.2 13.6 8.2 7.5 14.3 14.0 13.5 12.8 11.5 10.3 8.2 7.3 5.5 20.3 21.5 22.5 23.0 24.0 23.3 24.5 24.5 24.5 27.2 30.4 35.3 36.1 38.5 39.3 34.5 26.4 21.7 80.2 83.0 88.1 88.4 90.5 89.1 80.8 66.4 59.2
2.2 理化指标分析
苦荞啤酒的理化指标检测结果见表3。 由表3可知，苦荞添加量在20%～35%范围内增加时，色度从10.70 EBC升至14.80 EBC，说明苦荞的添加使得啤酒色泽变深，可能苦荞中的天然色素，如黄酮和花青素，在糖化和发酵过程中释放到麦芽汁中，导致啤酒的色泽加深[29]。 不同苦荞添加量的苦荞啤酒发酵度均＜70%，属于低发酵度啤酒，但随着苦荞添加量在20%～35%范围内的增加，原麦汁浓度由12.15°P下降至10.00°P，总酸由1.83%下降至1.52%，酒精度从3.68%vol降低至3.10%vol，说明苦荞的加入使得麦芽汁中可发酵糖含量减少抑制了酵母的发酵能力，过高的酸度会使啤酒产生苦涩感，过低的酸度会使啤酒口感过于柔和，影响了苦荞啤酒的整体风味[30]。因此，苦荞添加量为25%～30%时，苦荞啤酒品质较优。
表3 苦荞啤酒理化指标检测结果
Table 3 Physiochemical indexes detection results of tartary buckwheat beer
注：同行小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
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2.3 前发酵及后发酵苦荞啤酒挥发性风味成分分析
对苦荞啤酒的挥发性风味物质进行检测，选取挥发性风味物质含量＞1 μg/g的化合物进行分析，结果见表4。 由表4可知，不同样品共检出80种挥发性风味物质，其中，酯类36种，烷烃类6种、醇类20种、醛类4种、酮类2种、有机酸类7种、其他类物质5种。 后发酵苦荞啤酒中总挥发性风味物质含量高于前发酵。适当添加苦荞能增加啤酒中的总挥发性成分的含量，其中，当苦荞添加量为30%时，挥发性风味物质含量均最高，其在前发酵、后发酵苦荞啤酒样品中含量分别达4 908.30 μg/g、5 630.10 μg/g。 挥发性风味物质中种类最丰富的是醇类，其次是酯类和有机酸。
表4 苦荞啤酒挥发性风味化合物含量检测结果
Table 4 Detection results of volatile aroma components of tartary buckwheat beer
种类 序号 保留时间/min 化合物含量/（μg·g-1）20%前发酵25%前发酵30%前发酵后发酵 后发酵 后发酵35%前发酵 后发酵酯类1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 6.8 8.2 10.7 11.1 20.8 13.8 14.3 17.1 18.5 22.1 19.2 23.7 24.7 26.3乙酸乙酯丙酸乙酯乙酸异丁酯丁酸乙酯乳酸乙酯乙酸异戊酯2-甲基丁基乙酸酯正己酸乙酯己醇醋酸酯DL-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯庚酸乙酯苯甲酸乙酯辛酸乙酯苯乙酸乙酯55.58 1.14 5.44 2.54 10.34 35.16 11.82 16.38 0.11 0.72 0.92 1.60 69.53 2.77 70.88 0.55 3.04 0.71 0.56 42.43 16.88 17.34 0.91 0.18 1.49 0.44 78.5 1.51 46.79 1.67 5.87 3.61 0.50 38.88 12.89 17.12 0.28 0.08 0.86 0.68 71.46 1.46 70.71 0.63 2.34 0.95 0.20 79.93 29.56 18.14 1.53 0.21 2.18 0.51 161.85 1.86 72.95 1.19 10.2 1.24 0.40 61.86 22.55 46.43 0.97 0.23 1.13 0.48 138.83 1.96 92.88 2.55 1.2 4.09 0.01 258.36 51.46 47.14 0.47 0.11 1.44 2.26 335.93 2.24 21.36 0.25 3.35 0.32 7.72 7.91 2.76 18.69 1.50 0.19 0.64 0.39 180.10 0.99 77.29 1.50 0.78 1.01 1.09 43.79 14.70 19.64 1.12 1.37 2.07 0.86 129.35 1.62
续表
种类 序号 保留时间/min 化合物含量/（μg·g-1）20%前发酵25%前发酵30%前发酵后发酵 后发酵 后发酵35%前发酵 后发酵15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36乙酸苯乙酯壬酸乙酯3-苯丙酸乙酯α-甲基苯甲醇丙酸酯γ-壬内酯3-羟基-2,2,4-三甲基戊基异丁酸酯癸酸乙酯辛酸异戊酯γ-癸内酯3-羟基-十三烷酸乙酯月桂酸乙酯2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯己酸-2-苯乙酯辛酸-2-苯乙酯邻苯二甲酸二异丁酯对苯二甲酸二丁酯棕榈酸乙酯癸酸苯乙酯十八酸乙酯十四酸乙酯丁酸苯乙酯邻苯二甲酸二甲酯醇类1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 27.6 28.9 29.7 15.0 35.1 19.9 32.5 18.1 37.4 30.2 18.4 21.2 16.8 19.4 22.4 25.2 23.4 21.9 45.8 39.7 13.5 40.2小计9.1 12.6 13.0 8.5 16.2 18.3 21.7 24.0 27.1 10.4 31.9 16.4 29.4 17.8 19.0 15.7 34.2 38.6 22.9 24.4小计异丁醇异戊醇2-甲基丁醇2,3-丁二醇4-甲基-1-戊醇正己醇正庚醇3-甲硫基丙醇1-辛烯-3-醇2-乙基己醇芳樟醇2-壬基醇苯乙醇1-壬醇2-癸醇香茅醇香叶醇正癸醇十二醇雪松醇165.47 0.45 0.70 0.19 3.58 1.77 5.60 0.27 0.30 0.16 2.30 0.87 0.24 0.42 7.74 3.07 1.76 0.08 0.12 0.55 0.18 0.18 410.10 109.40 321.60 200.93 3.41 0.27 1.17 1.92 0.79 2.36 0.60 1.53 1.90 2 591.90 3.57 1.96 3.38 3.84 1.36 1.58 0.69 3 254.20 354.02 1.30 0.32 0.54 11.05 2.55 11.32 0.60 0.69 0.34 2.45 1.44 0.96 0.67 9.45 3.41 0.71 0.15 0.10 0.40 0.37 0.36 638.60 68.75 560.63 271.05 5.13 1.03 3.03 1.96 0.41 0.71 3.20 1.51 1.56 2 587.50 5.42 3.10 3.95 2.29 1.98 2.30 1.14 3 526.70 175.65 0.78 0.49 0.31 2.82 1.61 9.43 0.20 0.25 0.13 1.55 0.82 0.65 0.58 17.27 3.15 1.82 0.15 0.07 0.60 0.26 0.15 420.90 171.42 424.32 212.85 4.77 0.41 1.57 2.65 1.87 1.34 0.70 1.55 0.41 2 301.70 1.34 1.16 1.79 2.26 1.64 1.32 0.81 3 135.90 293.44 1.96 0.44 0.66 11.26 2.98 17.58 1.30 1.05 0.53 1.82 1.36 0.96 0.63 9.47 3.33 0.87 0.12 0.11 0.19 0.47 0.43 721.60 52.17 487.80 289.31 4.19 1.69 1.86 1.99 0.47 0.61 2.58 1.76 1.84 2 585.90 7.63 2.50 5.02 2.52 2.00 2.73 1.01 3 455.60 285.40 1.80 0.55 1.32 5.54 2.05 15.95 1.50 1.17 0.67 2.24 1.67 1.14 0.98 9.20 3.65 1.17 0.14 1.22 1.43 1.52 1.36 702.10 197.94 537.13 280.28 2.47 1.44 1.86 2.71 0.99 1.05 1.05 0.87 0.81 2 245.30 2.82 1.55 4.24 2.16 1.47 3.12 1.50 3 290.80 398.85 1.78 2.20 0.33 11.68 2.20 20.61 1.91 0.32 0.13 2.61 0.99 1.41 0.80 4.58 3.97 1.02 0.13 0.15 0.18 0.34 0.21 1 256.50 65.59 618.26 383.4 4.51 0.52 1.59 4.54 2.52 1.89 0.75 0.94 0.48 2 381.00 2.55 1.51 2.93 3.79 3.28 2.13 0.86 3 483.00 125.51 1.39 0.25 0.42 5.06 1.50 8.70 0.62 0.84 3.27 0.87 0.78 0.98 0.75 12.14 3.78 0.50 0.12 0.10 0.61 0.23 0.26 414.90 210.75 491.91 253.92 2.39 1.40 1.27 3.24 0.72 1.12 2.94 1.23 1.15 1 742.50 4.16 0.93 8.16 2.99 0.55 1.95 0.80 2 734.10 309.46 1.33 0.26 0.50 6.77 1.73 16.4 0.87 0.55 0.27 1.07 0.83 1.04 1.02 6.72 3.21 1.71 0.35 0.26 0.29 0.43 0.23 651.50 43.88 586.97 282.09 3.71 0.61 1.67 1.78 0.27 0.54 1.85 1.23 2.21 2 344.90 5.10 2.02 3.02 1.44 1.22 1.32 0.69 3 286.50
续表
种类 序号 保留时间/min 化合物含量/（μg·g-1）20%前发酵25%前发酵30%前发酵后发酵 后发酵 后发酵35%前发酵 后发酵醛类苯乙醛壬醛癸醛金合欢基乙醛酮类6,10-二甲基-5,9-十一双烯-2-酮植酮烷烃类苯乙烯3,4,5-三甲基甲苯萘2-甲基萘1,1-二乙氧基乙烷4-羟基苯乙烯有机酸异丁酸异戊酸2-甲基丁酸己酸壬酸9-癸烯酸正癸酸其他类1234 12 123456 1234567 12345 14.8 19.6 22.8 26.8小计36.7 41.3小计15.3 11.6 25.8 18.8 20.2 13.3小计12.1 9.6 9.9 17.5 28.4 19.8 20.5小计30.5 33.9 21.5 39.1 23.2小计总计4-乙基苯酚4-乙烯基-2-甲氧基苯酚4-乙基苯磷二酚2,6-二叔丁基苯醌2,4-二叔丁基苯酚9.85 10.67 13.5 0.73 34.80 1.82 0.35 2.20 47.45 1.04 3.45 0.65 0.51 3.05 56.20 0.75 321.60 1.45 23.94 0.97 3.48 9.47 361.70 0.17 5.52 0.75 0.98 99.18 106.60 4 225.50 9.60 4.69 14.08 0.58 28.90 1.44 1.52 3.00 0.75 0.97 3.51 0.97 1.21 5.04 12.50 1.37 560.63 3.13 36.28 2.12 5.03 13.51 622.1 0.16 65.52 1.02 1.06 105.61 173.40 5 005.10 6.66 3.16 9.02 1.24 20.10 3.76 0.45 4.20 76.93 0.82 4.25 0.76 5.02 2.80 90.60 1.04 424.32 2.33 41.54 0.85 3.26 8.79 482.10 0.07 8.45 0.50 0.90 83.98 93.90 4 247.70 6.78 4.99 13.70 0.77 26.20 4.94 1.54 6.50 1.42 1.13 4.21 1.02 0.29 4.61 12.70 1.26 487.80 3.37 34.11 2.69 6.94 17.36 553.50 0.96 53.28 1.25 1.47 149.29 206.30 4 982.30 8.05 1.79 7.14 2.06 19.00 7.56 1.06 8.60 70.99 0.84 2.93 1.15 10.7 3.37 90.00 1.73 537.13 2.63 15.21 1.94 8.40 12.64 579.70 10.00 25.86 1.26 1.68 179.29 218.10 4 908.30 8.01 3.41 12.08 1.68 25.20 5.97 0.27 6.20 1.68 0.95 2.90 0.98 0.24 5.59 12.30 0.94 618.26 2.13 52.23 1.14 5.21 8.49 688.40 0.20 46.9 0.81 1.16 109.33 158.40 5 630.10 6.39 1.69 1.84 1.12 11.00 2.54 1.21 3.80 0.96 0.75 3.85 0.65 5.32 1.28 12.80 1.36 591.91 3.17 15.33 2.76 5.35 13.73 633.60 22.34 10.68 0.88 0.91 131.35 166.20 3 976.30 6.78 7.23 13.41 1.36 28.80 3.44 0.69 4.10 0.67 0.82 3.81 0.80 0.52 3.87 10.50 1.29 586.97 2.17 37.13 1.30 4.57 10.85 644.30 0.12 56.04 0.65 0.71 57.09 114.60 4 740.30
随着苦荞添加量在20%～35%范围内增加，前发酵、后发酵苦荞啤酒样品中酯类物质的含量均呈先增加后下降的趋势，当苦荞添加量为30%时，其含量分别为702.1 μg/g、1 256.5 μg/g。这表明适量的添加苦荞可以促进酯类物质生成，这与DABIJA A等[18]的结果相似。酯类化合物中乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯等含量较高。苦荞添加量为20%～30%时，前发酵和后发酵苦荞啤酒样品中乙酸异戊酯、2-甲基丁基乙酸酯、正己酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯的含量均有所上升。乙酸乙酯、乙酸异戊酯、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯乙酯、γ-壬内酯、癸酸乙酯的含量在后发酵阶段明显高于前发酵，正己酸乙酯、己醇醋酸酯、苯乙酸乙酯、月桂酸乙酯、对苯二甲酸二丁酯的含量在前发酵和后发酵过程中无明显变化。
随着苦荞添加量在20%～30%范围内增加，前发酵、后发酵苦荞啤酒样品中醇类物质的含量均相差不大；继续增加苦荞添加量，醇类物质含量有所下降，但后发酵苦荞啤酒样品中醇类物质的含量均高于前发酵。当苦荞添加量为30%时，醇类物质含量分别为3 290.8 μg/g、3 483.0 μg/g。其原因可能是，苦荞的添加抑制了酵母的发酵能力，导致醇类物质的生成量减少[19，31]。 醇类物质主要有苯乙醇、异戊醇、2-甲基丁醇，随着苦荞添加量在20%～30%范围内增加，前发酵和后发酵苦荞啤酒样品中异戊醇、2-甲基丁醇、正庚醇呈增加趋势，苦荞添加量＞30%时，含量有所下降可能因为酵母代谢活性受到抑制，导致醇类合成减少[19]。异戊醇、2-甲基丁醇、正癸醇在后发酵阶段明显高于前发酵，正癸醇、十二醇、雪松醇等含量在前发酵和后发酵过程中无明显变化。
随着苦荞添加量在20%～35%范围内增加，前发酵、后发酵苦荞啤酒样品中有机酸类物质的含量均呈先增加后平稳的趋势，当苦荞添加量为30%时，其含量分别为579.7 μg/g、688.4 μg/g。 有机酸的增加不仅可以增强啤酒的酸味，还能提升其整体的风味层次感，同时也可能对啤酒的保质期产生积极影响[9]。有机酸类物质中主要有异戊酸。苦荞添加量为20%～30%时，异戊酸在后发酵阶段明显高于前发酵，异丁酸、2-甲基丁酸等含量在前发酵和后发酵过程中无明显变化。
醛类物质主要有壬醛、癸醛、苯乙醛，金合欢基乙醛含量较低，癸醛在后发酵阶段明显高于前发酵。 醛类物质通常是发酵过程中产生的中间产物，其含量的降低可能表明酵母在发酵后期对醛类物质的进一步转化或利用，从而降低了其最终浓度[31-32]。
苦荞添加量为25%、30%时，烷烃类物质总含量在前发酵、后发酵苦荞啤酒中含量相差不大。随苦荞添加量继续增加，烷烃类物质在啤酒中的含量下降，可能是由于酵母对烷烃类的代谢能力受到抑制，导致积累减少[32]。
醇类和酯类物质是组成啤酒中香味成分的主要物质，其含量适宜，可增加啤酒酒香和酯香味，使酒体口感协调。 酯类主要是在高温的顶层发酵期间形成的，啤酒后发酵过程中由于醇和酸的酯化反应，酯的含量会有所增加[31]。 过高的酯含量也会破坏啤酒应有风味而产生异香，这也是导致了同一批啤酒在不同时间饮用时的风味有所不同[32-34]。
2.4 苦荞啤酒气味活性值分析
苦荞啤酒挥发性风味化合物香气活性值分析见表5。由表5可知，气味活性值（OAV）≥1的挥发性风味化合物共45种，包括酯类18种、醇类15种、烷烃类4种、醛类3种、有机酸类2种、芳香类3种。其中，OAV较高的挥发性风味物质有乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁醇、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、苯乙烯、芳樟醇、壬醛、苯乙醇、癸醛、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等，这些挥发性风味物质大多具有独特的香味特征，乙酸乙酯具有水果香味，丁酸乙酯具有菠萝芳香气味，乙酸异戊酯有愉快的香蕉香味，正己酸乙酯有水果香气味，癸酸乙酯带有椰子香味，2-甲基丁基乙酸酯、苯乙烯具有芳香气味，乙酸苯乙酯有甜蜜香味，辛酸乙酯具有白兰地的香气，芳樟醇具有佛手香味，壬醛拥有蜜蜡花香味，苯乙醇带有玫瑰香味，癸醛有甜橙油与柠檬油味，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚具有香辛料、丁香味。使得苦荞啤酒不仅具有独特的香气，还赋予了其丰富的层次感和复杂性。
表5 苦荞啤酒挥发性风味化合物气味活性值分析
Table 5 Analysis of odor activity values of volatile flavor compounds of tartary buckwheat beer
OAV 20% 25% 30% 35%化合物 阈值/（mg·kg-1）[25] 风味特征[35]乙酸乙酯 0.005 14 176.0 14 142.0 18 576.0 15 458.0 水果香味
续表
注：“-”表示未确定。
化合物 阈值/（mg·kg-1）[25] 风味特征[35]OAV 20% 25% 30% 35%丁酸乙酯乙酸异戊酯正己酸乙酯癸酸乙酯辛酸异戊酯γ-癸内酯2-甲基丁醇乙酸异丁酯2-甲基丁基乙酸酯异丁醇丙酸乙酯1,1-二乙氧基乙烷异戊醇乳酸乙酯2-甲基丁酸正己醇乙酸苯乙酯辛酸乙酯γ-壬内酯苯乙烯正庚醇3-甲硫基丙醇1-辛烯-3-醇己酸苯乙醛芳樟醇2-壬基醇壬醛苯乙醇4-乙基苯酚苯甲酸乙酯1-壬醇2-癸醇癸醛4-羟基苯乙烯香茅醇苯乙酸乙酯香叶醇2-甲基萘壬酸乙酯4-乙烯基-2-甲氧基苯酚十二醇2,4-二叔丁基苯酚2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二异丁酸酯0.000 9 0.000 15 0.005 0.005 0.07 0.001 1 0.015 9 0.025 0.011 6.505 2 0.1 0.004 9 12.2 0.003 0.5 0.005 6 0.249 59 0.019 3 0.015 6 0.012 02 0.005 4 0.123 23 0.001 5 0.89 0.546 23 0.000 22 0.058 0.001 1 0.564 23 0.013 0.055 56 0.045 5 0.025 0.003 0.01 0.062 0.155 55 0.006 6 0.003 0.019 3 0.012 02 0.016 0.5 0.014 788.9 282 866.7 3 468.0 2 264.0 8.6 627.3 17 047.2 121.6 1 534.5 10.6 5.5 246.9 46.0 186.7 6.3 541.1 1 418.4 4 067.4 708.3 62.4 363.0 3.3 473.3 40.8 17.6 6 863.6 26.9 4 263.6 4 585.9 12.3 7.9 119.1 124.0 4 693.3 504.0 63.7 9.7 347.0 323.3 67.4 5 450.9 143.8 211.2 102.9 1 055.6 532 866.7 3 628.0 3 516.0 18.6 954.5 18 195.6 93.6 2 687.3 8.0 6.3 59.2 40.0 66.7 6.7 332.1 1 175.7 8 386.0 721.8 118.1 368.5 3.8 406.7 38.3 12.4 8 000.0 31.7 4 536.4 4 583.1 73.8 9.2 167.7 100.0 4 566.7 461.0 81.0 12.0 381.8 340.0 101.6 4 432.6 170.6 298.6 97.1 4 544.4 1 722 400.0 9 428.0 4 122.0 27.3 290.9 24 113.2 48.0 4 678.2 10.1 25.5 49.0 50.7 3.3 4.3 283.9 1 598.0 17 405.7 748.7 139.8 840.7 20.4 1 260.0 58.7 14.7 4 272.7 8.3 3 100.0 4 219.9 15.4 40.7 56.0 60.4 4 026.7 559.0 47.3 14.4 574.2 326.7 92.2 3 901.8 133.1 218.7 70.7 1 122.2 291 933.3 3 928.0 3 280.0 12.4 500.0 17 741.5 31.2 1 336.4 6.7 15.0 106.1 48.1 363.3 4.3 298.2 1 239.9 6 702.1 434.0 55.7 329.6 2.2 360.0 41.7 12.4 5 590.9 38.1 6 572.7 4 155.9 9.2 15.5 112.1 80.8 4 470.0 387.0 48.7 10.4 218.2 266.7 68.9 4 662.2 82.5 114.2 59.3菠萝芳香气味香蕉香味水果香味椰子香味水果香、白兰香椰子、桃子香味-水果酯香味芳香气味-菠萝香味-苹果白兰地香朗姆酒、水果和奶油香羊乳干酪气味嫩枝叶气、酒香、果香甜蜜香味白兰地的香味椰子香、茴香、杏、李子香味芳香气味油脂和柑橘香肉或肉汤香味蘑菇、玫瑰和干草香味-风信子香，杏仁、樱桃香味佛手香味-蜜蜡花香味玫瑰香味木-酚气息、甜香味冬青油和依兰油香玫瑰花蜡和桔子、甜橙味-甜橙油与柠檬油味-玫瑰香味蜂蜜香味玫瑰花香-油脂、水果和白兰香味香辛料、丁香味油脂气味--
2.5 苦荞啤酒中关键差异挥发性风味化合物分析
OPLS-DA主要用于处理组间差异显著但样本量较小的高维数据[36-37]。选取OAV≥1的关键挥发性风味物质进行正交偏最小二乘-判别分析，结果见图1。
图1 不同苦荞啤酒中关键挥发性风味物质的正交偏最小二乘-判别分析得分散点图（a）、200次置换检验结果（b）及变量重要性投影值（c）
Fig.1 Score scatter plot of orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis (a), 200 permutation test results(b) and variable importance in projection values (c)of key volatile flavor substances of different tartary buckwheat beer
由图1a可知，不同苦荞酒样品在前发酵和后发酵后风味存在明显的差异，苦荞添加量为30%时，前发酵苦荞啤酒中与其他样品分布于两个不同的象限，与其他样品能明显区分开来，后发酵苦荞啤酒样品距离较近，但也能将不同样品区分开来。由图1b可知，模型经过200次置换检验和7倍交叉验证后，得到R2值为0.916 5，Q2回归线与纵轴的截距＜0，可知模型自变量和因变量没有过度拟合[38]，说明模型验证有效，因此该模型结果能应用于苦荞啤酒中关键香气成分的分析。 由图1c可知，VIP值＞1时，该变量对样品的区分具有较高的贡献率[39]。筛选出异丁醇、庚酸乙酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、γ-壬内酯、乙酸苯乙酯、十四酸乙酯、4-羟基苯乙烯、乙酸异丁酯、1,1-二乙氧基乙烷、2-癸醇、己酸、乙酸乙酯等32种关键差异挥发性风味物质（VIP值＞1、P＜0.05），这些物质与苦荞啤酒中特征风味有着重要的作用。
3 结论
苦荞添加量为20%～35%时，苦荞啤酒感官评分较高（88.1～90.5分）；其色度由10.7 EBC增加至14.8 EBC，原麦汁浓度、酒精度及总酸分别由12.15°P、3.68%vol、1.83%下降至10.0°P、3.1%vol、1.52%；挥发性风味物质共检出80种，其中，酯类36种，烷烃类6种、醇类20种、醛类4种、酮类2种、有机酸类7种、其他类物质5种。当苦荞添加量为30%时，前发酵、后发酵苦荞啤酒样品中挥发性风味物质含量最高。通过气味活性值（OAV）结合VIP值，筛选出异丁醇、庚酸乙酯等32种关键差异挥发性风味物质（OAV≥1，VIP值＞1）。这些物质对苦荞啤酒中特征风味有着重要的作用，本研究结果可为苦荞啤酒的生产及品质提升提供理论依据。
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