酱香型白酒是中国白酒工艺最为独特和复杂的代表，其以一年为一个生产周期，期间产生的七个轮次风味各异的基酒是酱香型白酒勾调的基础，对最终产品的风味品质具有决定性影响[1]。
目前，国内对于酱香型白酒轮次基酒的研究主要围绕感官特征[2]、理化性质[3]、风味组成[4-6]、微生物代谢[7-11]等方面进行差异分析，其中风味组成研究主要关注整体物质解析或某一类物质的特征研究[12-16]，如王允中等[4，12]均基于挥发性风味物质对轮次基酒进行主成分分析（principal component analysis，PCA）；王荣钰[6]则是针对骨架成分的轮次变化规律进行了研究；何东梅等[13]讨论了机械化酱香轮次基酒中酯类物质的风味贡献；刘家欢等[14-15]分别对轮次基酒中的吡嗪类物质、非挥发性酸类物质含量差异进行分析；丁保坤等[16]则对轮次基酒中醇类、酯类和醛类物质含量都进行了对比。然而，将感官特征与风味成分差异规律关联的研究较少[1，17]。如LIU Q Y等[1，17]均对轮次基酒的感官特征和风味结构进行了解析，前者针对轮次基酒中挖掘出的关键香气成分进一步通过风味重构揭示了其与感官特征的影响机制，后者将多元统计法筛选出的重要风味成分与感官特征进行相关性分析，找出了与感官特征呈正相关的贡献成分。总体上，目前人们对七个轮次基酒的感官特性与其化学组成之间的相关性研究仍不够全面，这方面的研究一直受到行业重视，主要原因其一是这有益于勾调成品的质量保障，其二是这对酿造工艺的改进具有导向作用，对于稳定白酒产品品质及酒体设计与开发都具有十分重要的意义。
为了辨别各轮次基酒的风味成分差异，探究轮次基酒中挥发性成分变化规律及其与感官特征的重要联系，本研究以酱香型白酒一至七轮次基酒为研究对象，通过定量描述性分析（quantitative descriptive analysis，QDA）法分析各轮次基酒的感官特征；通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）、直接进样-气相色谱-氢火焰离子化检测器法（direct injection-gas chromatography-flame ionization detector，DI-GC-FID）、液液微萃取-气相色谱-质谱法（liquid-liquid microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，LLME-GC-MS）对各轮次基酒中的挥发性成分进行定性、定量分析，并结合多元统计分析对不同轮次基酒的挥发性成分差异规律进行分析，丰富对酱香型轮次基酒的风味化学认识，以期为酱香型白酒的酒体勾调设计和酿造工艺改进提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料酱香型白酒一至七轮次基酒：某酱酒公司不同酿造区生产，所有酒样统一置于室温条件下干燥储存。
1.1.2 化学试剂
氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙醚、正己烷（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；乙醇、2-辛醇、叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸（均为色谱纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；精确定量所用标准品（均为色谱纯）、C7～C40正构烷烃（均为色谱纯）：德国Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
GC-8890气相色谱仪（配备FID）、8890-5977B气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基 硅 氧 烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）箭型三相萃取头：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 酱香型白酒一至七轮次基酒感官分析方法
参考GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》，成立由10名品酒人员组成的酱香型白酒轮次基酒感官品评小组，所有成员均取得贵州省白酒评委资格，对小组进行为期1个月的基本香味标度测试、差别检验及香味描述检验训练，每周3次，每次1～2 h，定期使用Panelcheck对品评员的重复性、区分度以及一致性进行检验[18]。经过小组集中讨论筛选确定8个香气属性词（粮香、花香、青草香、果香、曲香、酱香、酸香和糊香）以及8个味感属性词（酸味、苦味、甜味、后味、柔和度、丰满度、纯净度、回甜感），根据文献[19]及实际情况选取合适的香气参照物对小组进行进一步的强度训练，每周3次，每次1 h。感官品评小组成员采用定量描述性分析法对酱香型白酒一至七轮次基酒进行感官品评，采用1～9分制，其中“1”表示感知最弱、“9”表示感知最强，小组对每个白酒样品重复进行3次评分，单个酒样评分结果为成员3次品评结果的加权平均值。
1.3.2 酱香型白酒一至七轮次基酒挥发性成分定性分析方法
采用箭型顶空固相微萃取结合气相色谱质谱法（HSSPME-GC-MS）对酱香型白酒一至七轮次基酒挥发性成分进行检测。
前处理条件：参考ZHANG X Y等[20]的方法，用超纯水将基酒样品酒精度稀释至10%vol，然后准确吸取5 mL样品至20 mL顶空进样瓶中，并加入1.5 g NaCl，密封后，50 ℃孵化萃取5 min，50 ℃搅拌（转速250 r/min）萃取50 min。结束后，在250 ℃的进样口解吸附5 min。
GC条件：DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度和气相色谱检测器温度均为250 ℃，载气为高纯氦气（He）（纯度≥99.999%），载气流速为1mL/min。升温程序为40 ℃保持2 min；以3 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；再以3 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；最后以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。
MS条件：采用电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，扫描范围为30～550 m/z。
定性处理：利用安捷伦“未知物分析软件”对采集的数据自动解卷积，与美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）20谱库进行比对，筛选匹配度＞80的组分，过滤掉柱流失产生的化合物以及卤素化合物、烷烃、烯烃等无香气贡献的化合物。进一步在相同的检测方法条件下，通过正构烷烃计算化合物相应的保留指数（retention index，RI），与NIST数据库中收录的文献报道RI进行比对，筛选RI相差50以内的化合物。
1.3.3 酱香型白酒一至七轮次基酒挥发性风味成分定量方法
（1）骨架成分
采用DI-GC-FID测定酱香型白酒一至七轮次基酒中的骨架成分。
前处理：参考王金龙等[21]的方法，取各轮次酒样10 mL，加入200 μL混合内标（叔戊醇：294.54 mg/L、乙酸正戊酯：294.68 mg/L、2-乙基丁酸：299.4 mg/L），涡旋混匀，取1 mL至进样瓶待测。
GC条件：DB-WAX UI毛细管色谱柱（30 m×0.2 mm×0.25 μm）；进样口温度为240 ℃；进样量为1 μL；分流比为30∶1，载气为氮气（N2）（纯度≥99.999%）；载气流速为1mL/min；升温程序为30 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至90 ℃，再以5 ℃/min升至180 ℃，保持25 min；氢火焰离子化检测器温度250 ℃。
定量处理：采用53%vol的乙醇水溶液配制混合标准溶液，并稀释不同梯度，在相同检测条件下，以各化合物标准品与内标物质的峰面积之比为纵坐标，质量浓度之比为横坐标，绘制标准曲线，进行准确定量。
（2）微量成分
采用LLME-GC-MS测定酱香型白酒一至七轮次基酒中的部分微量成分。
前处理：用超纯水将基酒样品酒精度稀释至10%vol，准确吸取10 mL酒样至20 mL具塞比色管中，加入3.0 g NaCl及10 μL内标（2-辛醇：2 036 mg/L，2-甲氧基-3甲基吡嗪：4 067 mg/L），用2 mL乙醚：正己烷（1∶1，V/V）作萃取剂，涡旋振荡萃取1 min，静置分层后取1 mL上清液至进样瓶待测。
GC条件[22]：DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度和气相色谱检测器温度均为250 ℃，载气为高纯氦气（He）（纯度≥99.999%），载气流速为1mL/min，不分流进样。升温程序为40 ℃保持1 min；以2.5 ℃/min升至100 ℃，保持1 min；再以3 ℃/min升至160 ℃；最后以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。
MS条件：采用EI源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，扫描范围为30～550 m/z。
定量处理：采用53%vol的乙醇水溶液配制混合标准溶液，并稀释不同梯度，在相同检测条件下，以各化合物标准品与内标物质的峰面积之比为纵坐标，质量浓度之比为横坐标，绘制标准曲线，进行准确定量。
其余难以购买到标准品的微量成分采用HS-SPMEGC-MS检测，方法同1.3.2，但需在萃取前加入10 μL内标（2-辛醇：0.297 mg/L），采用内标法进行半定量。
1.3.4 数据处理与统计分析方法
雷达图以及柱状图采用Excel 2019软件绘制；单因素方差分析采用SPSS 25软件进行；正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA）以及偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析采用SIMCA 14.1软件进行；热图采用TB tools软件绘制。
2 结果与分析
2.1 酱香型白酒一至七轮次基酒的感官特征分析
以品评小组的QDA结果绘制各轮次基酒的感官香气描述雷达图，结果见图1。
图1 酱香型白酒一至七轮次基酒的感官特征
Fig.1 Sensory characteristics of the 1st to 7th rounds of base liquor of sauce-flavor Baijiu
由图1可知，七个轮次基酒的感官描述特征存在差异，具有分类效应。其中，一、二轮次酒感官轮廓相似，均具有明显的粮香、酸香和果香，味感以突出的酸味为主；三轮次基酒在前基础上增加了花香和青草香，四轮次基酒酱香和曲香渐突出，五轮次基酒又增加了舒适的糊香，味感上均具有明显的回甜感和纯净度，三、四、五轮次酒的感官轮廓均较为协调，是酱香型白酒勾调的基石。六、七轮次基酒则呈现相似的较为浓郁的糊香、曲香特征，且以苦味和后味突出。已有研究表明，这些特征变化与酱香型白酒酿造的发酵温度、微生物生长状况、粮谷原料的淀粉含量等因素有关[23]，且各轮次基酒的感官特征差异程度灵活地影响着勾调师的勾兑设计[2]。
2.2 酱香型白酒一至七轮次基酒挥发性成分分析
2.2.1 挥发性成分类别差异分析
由于各轮次基酒感官特征上的差异与酿造过程中产生的挥发性成分类别组成和数量比例密切相关，因此，通过HS-SPME-GC-MS对各轮次基酒中的挥发性成分进行定性分析，结果从各轮次基酒中共鉴定出272种挥发性成分，具体类别数量见表1。
表1 酱香型白酒一至七轮次基酒中各类别挥发性成分数量分布
Table 1 Quantitative distribution of various categories volatile components in the 1st to 7th rounds of base liquor of sauce-flavor Baijiu
类别数量/种一轮次 二轮次 三轮次 四轮次 五轮次 六轮次 七轮次 各轮次共有酯类醇类酸类醛酮类呋喃类吡嗪类酚类含硫类含氮类萜烯类芳香族总计86 29 10 29 12 12 78 27 12 31 14 13 66 30 12 36 12 13 63 30 12 35 13 12 62 27 11 37 13 12 63 24 11 36 15 14 65 25 10 36 17 12 48 20 10 25 8 11 7 2 1 4 9 7 2 1 4 1 0 7 2 1 5 6 7 2 1 4 1 1 7 2 1 3 1 1 7 2 1 6 7 7 2 1 5 9 7 2 1 1 2 201 199 190 190 186 186 189 135
由表1可知，酱香型白酒一至七轮次基酒中的挥发性成分种类上均以酯类物质数量最多，这与酱香型白酒独特的固态发酵工艺和复杂的微生物环境有关，即各轮次酒醅中含有丰富的产酯微生物及酯化酶[9]；同时，一、二轮次基酒中鉴定出的物质种类更为丰富，为201种和199种，这可能与一、二轮次的原料底物浓度高，用曲量大，带入的微生物较多有关。通过对各轮次基酒中挥发性成分的种类进行对比分析发现，各轮次基酒共有的成分有135种，差异成分有137种，这些差异成分数量的堆积柱状图见图2。由图2可知，一、二轮次基酒中鉴定出的种类差异成分数量较多，各轮次基酒间差异成分的类别主要集中在酯类和醛酮类上，这与丁保坤等[16]的分析结果一致。
图2 酱香型白酒一至七轮次基酒中各类别差异成分的数量分布
Fig.2 Quantitative distribution of various categories differential components in the 1st to 7th rounds of base liquor of sauce-flavor Baijiu
2.2.2 挥发性成分含量差异分析
联合HS-SPME-GC-MS、GC-FID、LLME-GC-MS检测技术对酱香型白酒一至七轮次基酒定性出的272种挥发性风味成分进行定量分析，比较各轮次基酒挥发性成分在类别含量上的差异，结果见图3。由图3可知，醇类、酯类、酸类和萜烯类物质的含量变化均随轮次增加整体呈降低趋势。其中，酯类物质的降低幅度较小，因为轮次变化过程中，乙酸乙酯的含量逐渐降低的同时乳酸乙酯的含量逐渐上升，二者在四轮次基酒中含量比例趋于平衡。有研究发现，乙酸乙酯-乳酸乙酯的比例与酒体口感协调度有关[24]，这可能也与四轮次基酒各口感维度轮廓协调的感官结果相关联。醇类物质的含量降低幅度最大，主要由正丙醇的含量变化占主导，其由一轮次的27 940.12 mg/L降低至七轮次的510.05 mg/L。此外，醛酮类、呋喃类、吡嗪类、酚类、含硫类、含氮类以及芳香族的含量较低，但含量均随轮次的增加整体呈上升趋势，这与LIU Q Y等[1]研究结果一致。醛酮类以乙醛和乙缩醛含量升高趋势为主，呋喃类则以糠醛的含量升高占主导，这些含量升高特征与高温发酵过程中碳氮源量随轮次逐渐减少有关[25]。吡嗪类则以2,6-二甲基吡嗪的含量升高占主导，酚类以4-乙基愈创木酚的含量升高占主导，它们是白酒发酵过程中重要的美拉德反应产物[25]。在白酒勾调过程中依据这些含量差异特征规律，合理配比不同轮次基酒，对白酒产品的酒体平衡协调具有重要作用。
图3 酱香型白酒一至七轮次基酒中各类别挥发性成分含量的变化
Fig.3 Changes of various categories volatile components contents in the 1st to 7th rounds of base liquor of sauce-flavor Baijiu
进一步对一至七轮次基酒中的挥发性成分含量差异进行分析，结果从272种挥发性成分中筛选出104种含量具有显著差异的成分（P＜0.05），包括酯类36种、醛酮类23种、醇类18种、酸类6种、呋喃类8种、含氮类1种、含硫类2种、吡嗪类7种、酚类1种、萜烯类1种和芳香族1种。基于104种显著差异挥发性成分对各轮次基酒进行OPLS-DA，结果见图4。由图4可知，模型中自变量拟合指数（R2X）为0.998，因变量拟合指数（R2Y）为0.808，模型预测指数（Q2）为0.676，R2和Q2均＞0.5，表示模型拟合结果可接受[26]。进一步经200次置换检验，结果发现Q2与纵坐标的截距为负值，说明模型不存在过拟合，进一步证明模型有效。七个轮次基酒在置信区间内分区明显，主要分布在3个区域，即一、二轮次基酒聚为一类，三、四、五轮次基酒聚为一类，六、七轮次基酒聚为一类，这与感官分析结果一致。
图4 基于104种显著差异挥发性成分酱香型白酒一至七轮次基酒正交偏最小二乘-判别分析得分散点图（A）及200次置换检验结果（B）
Fig.4 Scattered plots (A) and 200 permutation test result (B) of orthogonal partial least squares discriminant analysis based on 104 significantly differential volatile compounds in the 1st to 7th rounds of base liquor of sauce-flavor Baijiu
进一步以变量重要性投影值（variable importance for the projection，VIP）＞1为标准，基于该OPLS-DA模型筛选出13种主要含量差异贡献成分，结果见图5。
图5 酱香型白酒一至七轮次基酒中主要含量差异贡献挥发性成分含量热图及VIP值
Fig.5 Content heatmap and variable importance in the projection of important volatile components contributed to contents difference in the 1st to 7th rounds of base liquor of sauce-flavor Baijiu
由图5可知，丁酸乙酯、正丙醇、乙酸乙酯、2-戊酮、乙酸在一、二轮次基酒中含量较高，且随轮次增加呈降低趋势；其中，正丙醇的这一含量变化特点已在酱酒行业受到广泛关注[27]，研究发现一、二轮次的正丙醇含量较高可能与前两轮发酵高温大曲的用曲量和黑曲添加比例有着很大关联[28]。相反，糠醛、1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷则在六、七轮次基酒中含量较高，且随轮次增加呈升高趋势。糠醛已被证实是酱香白酒中重要的呈焦香类物质[5]，与六、七轮次基酒焦糊的感官特征香气有关联；1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷具有水果香，同时它被认为是赋予浓香型白酒特征性浓郁香气的一种重要化合物[29]。三、四、五轮次基酒中，甲醇和异戊醇的含量较低，乳酸乙酯的含量较高。因乳酸乙酯对酒体的醇厚、回味等感官感受有重要贡献，这可能也与三、四、五轮次酒体复合程度高，酒体较为协调相关联[30]。这些差异贡献成分的含量规律可能与轮次基酒风味特征变化有着重要关系。
2.3 酱香型白酒一至七轮次基酒挥发性成分香气与感官属性关联分析
通常影响轮次基酒香气特征的是具有较高香气活度值（odor activity value，OAV）的成分，以OAV＞1的筛选标准，从272种挥发性成分中筛选出45种重要香气贡献成分，包括8种OAV＞1、23种OAV＞10、8种OAV＞100以及6种OAV＞1 000的成分，这些物质在一至七轮次基酒中的OAV差异热图及其与感官属性的PLSR分析结果见图6。
图6 酱香型白酒一至七轮次基酒中重要香气差异贡献挥发性成分的气味活性值热图（A）及其与感官属性的偏最小二乘回归分析结果（B）
Fig.6 Odor activity value heatmap (A) and partial least squares regression analysis results with sensory attributes (B) of important volatile components contributed to aroma difference in the 1st to 7th rounds of base liquor of sauce-flavor Baijiu
由图6A可知，具有重要香气差异贡献的酯类物质有15种，其中以OAV＞1 000的丁酸乙酯、戊酸乙酯、异戊酸乙酯贡献较大，主要赋予酒体怡人的果香[31]；贡献果香及醇香的醇类物质有6种，且以正丙醇的OAV较高，其在一、二轮次基酒中的OAV＞100，是微生物酒精发酵的产物，通常会影响酒体感官刺激程度[32]。具有重要香气差异贡献的醛酮类物质有9种，其中异戊醛的香气贡献在各轮次基酒均较高，主要贡献青草香、可可香[31]；其次为乙醛与乙缩醛，许多缩醛与它们的先驱物——醛有着类似的气味，主要贡献青草香、果香[33]。对酒体酸气和酸味有重要差异贡献的酸类物质有5种，以乙酸和异戊酸的贡献较大；在香气差异贡献较大的物质中还有二甲基三硫和二甲基二硫2种含硫类物质，其在七个轮次基酒中的OAV明显较高，通常具有甘蓝、硫气味，属于酱香型白酒的异嗅化合物[34]。
由图6B可知，OAV＞1 000的丁酸乙酯、戊酸乙酯以及OAV＞100的正丙醇、乙酸异戊酯、乙酸乙酯与一、二轮次基酒的酸香和粮香属性相关联；OAV＞1 000的乙醛和OAV＞100的乙缩醛与三、四轮次基酒中的青草香属性相关联，相关性系数较高，分别为0.94、0.91；OAV＞1 000的异戊醛、二甲基三硫以及OAV＞100的3-羟基-2-丁酮、二甲基二硫则是与六、七轮次基酒中的糊香属性相关联，有研究表明，异戊醛在低浓度时，呈现可可、焙烤香气[35]；而3-羟基-2-丁酮呈甜香、木香，其还可以通过非酶催化反应转化为常与焙烤香相关的吡嗪[36]。
3 结论
本研究以酱香型白酒一至七轮次基酒作为研究对象，采用QDA对其感官特征进行分析，结果表明，一、二轮次基酒具有明显的粮香、酸香和果香，酸味突出；三、四、五轮次基酒具有花香、青草香、酱香、曲香和糊香，且回甜感和纯净度明显；六、七轮次基酒则呈现浓郁的糊香和曲香，以苦味和后味突出。采用GC-MS等方法从各轮次基酒中共鉴定出272种挥发性成分，在类别上，以酯类数量最多，各轮次间物质种类差异主要集中在酯类和醛酮类上；在含量上，随着轮次增加，醇类、酯类、酸类含量整体呈降低趋势，而而醛酮类、呋喃类、吡嗪类、酚类、含硫类、含氮类以及芳香族含量整体呈升高趋势。采用OPLS-DA从各轮次基酒中筛选得到13种主要含量差异贡献成分（VIP值＞1），基于OAV＞1从各轮次基酒中筛选得到45种重要香气差异贡献成分，通过PLSR分析发现，其与各轮次基酒的感官属性具有一定的关联性。综上，本研究较为系统地解析了酱香型白酒一至七轮次基酒的感官及挥发性成分差异特征规律，为酱香型白酒的酒体设计提升提供了数据支撑。
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