中国白酒经固态发酵、蒸馏、陈酿、勾兑等复杂工序制作而成，根据其风味可基本分为12种香型[1]。酒体中有机酸是大曲微生物发酵的产物，也是白酒中重要的呈香和呈味物质，对白酒的香气、口感和品质的形成具有重要影响[2]。酱香型白酒中的有机酸主要为乳酸、乙酸、丁酸和己酸[3-4]，其中以乳酸和乙酸为主，其总含量高达3 000 mg/L，明显高于浓香型及清香型白酒[5-6]。
目前白酒有机酸的检测方法通常有气相色谱法（gas chromatography，GC）[7-8]、气相色谱质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[9-10]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[11-12]和离子色谱法（ion chromatography，IC）[13-15]。使用GC法测定白酒中的有机酸，需要对白酒样品进行衍生，方法较为复杂，且不适合于热不稳定性酸的测定；IC法可以实现白酒中短链、中链挥发酸以及包括乳酸在内的一些难挥发酸的检测，但不适宜企业实际应用于生产过程中有机酸检测[16]。HPLC具有操作简便、快速、准确度高、适应性广的特点，广泛应用于白酒中各种组分的检测。目前应用HPLC测定白酒有机酸主要集中于乳酸和乙酸等，但对于测定己酸和丁酸的应用较少[17]。根据GB 5009.157—2016《食品安全国家标准 食品中有机酸的测定》和DB34/T 3053—2017《白酒中非挥发性有机酸的测定高效液相色谱-串联质谱法》，虽然这些标准为有机酸的测定提供了指导，但由于白酒的复杂基质和低pH性，白酒中挥发性有机酸的标准尚未报道。
本研究利用HPLC法建立了测定酱香型白酒中4种有机酸（乳酸、乙酸、丁酸和己酸）含量的方法，测定了不同发酵轮次酱香型白酒中有机酸的变化规律。以期为不同轮次酱香型白酒中有机酸含量的测定提供参考，为企业生产工艺的改进提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱香型白酒（2023年生产，酒精度53%vol）：采自河北省邯郸市某酒厂不同生产车间不同轮次的酱香型白酒，按照第1～7轮次依次编号为HD1～HD7。乳酸、乙酸、丁酸、己酸标准品（纯度＞99%）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇、磷酸（均为色谱纯）：西陇科学化学试剂有限公司；磷酸二氢钾（色谱纯）：阿拉丁试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-20ADXR高效液相色谱仪（配备二极管阵列紫外-可见光检测器）、InertSustainSwift C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：日本岛津公司；YK-RO-B舒活泉超纯水机：舒活泉（厦门）人工智能有限公司；ME104E型分析天平（万分之一）：瑞士梅特勒-托利多股份有限公司；LC-85C型防腐隔膜真空泵：上海力辰科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液配制
分别称取1.5 g乳酸、1.5 g乙酸、0.5 g己酸和0.5 g丁酸，加超纯水于50 mL容量瓶中定容，分别制成乳酸、乙酸、丁酸、己酸的标准溶液储备液。取乳酸、乙酸、己酸、丁酸的母液各1.0 mL，加入0.2 mL磷酸溶液（1.0 mol/L），加超纯水定容至10 mL，分别配制成乳酸（3 000 mg/L）、乙酸（3 000 mg/L）、丁酸（1 000 mg/L）、己酸（1 000 mg/L）的单标溶液。取适量体积上述4种有机酸进行混合，加水稀释依次配制成不同梯度的混合标准溶液，其中乳酸、乙酸质量浓度依次为300 mg/L、600 mg/L、1 500 mg/L、3 000 mg/L、4 200 mg/L，己酸、丁酸质量浓度依次为20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L。
1.3.2 样品预处理
参照滕明德等[18]的处理方法进行盐化-减压浓缩，并进行改进。取酱香型白酒50 mL，用饱和的氢氧化钠溶液调节pH值至12.0，使有机酸转化为有机酸盐。于55 ℃条件下将酒样减压浓缩至25 mL，用5 mol/L的磷酸溶液调节pH值至3.0，定容至100 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤。
1.3.3 检测条件
选用InertSustainSwift C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液（pH 2.3），流速为1 mL/min，进样量为10 μL，柱温箱温度为35 ℃，检测波长为215 nm，采用等度洗脱进行分离。根据有机酸标准品出峰时间定性，采用外标法根据峰面积进行定量分析。以相邻两组分的保留时间及两组分色谱峰的峰底宽度计算样品的分离度（R）。其计算公式如下：
式中：tR2和tR1分别是相邻两组分的保留时间，min；W1和W2分别是两组分色谱峰的峰底宽度。
1.3.4 检测条件优化
（1）梯度洗脱中磷酸二氢钾水溶液（pH 2.30）（A）与甲醇（B）体积比的选择
在1.3.3的基础上，分别按照①：0～3 min流动相A：100%、流动相B：0，3～20 min流动相A：70%、流动相B，30%，20～25min流动相A：70%～100%、流动相B：30%～0；②：0～3 min流动相A：100%、流动相B：0，3～20 min流动相A：75%、流动相B：25%，20～25min流动相A：75%～100%、流动相B：25%～0；③：0～3 min流动相A：100%、流动相B：0，3～20 min流动相A：80%、流动相B：20%，20～25 min流动相A：80%～100%、流动相B：20%～0进行梯度洗脱实验。考察梯度洗脱程序中磷酸二氢钾水溶液与甲醇比例（V：V）对白酒中4种有机酸分离的影响。
（2）磷酸二氢钾水溶液pH值的选择
在方法1.3.3 ③的基础上，选择上述最佳流动相，配制0.02 mol/L的磷酸二氢钾水溶液，用1 mol/L的磷酸溶液调节至pH值分别为2.30、2.50和2.70，考察不同pH值的磷酸二氢钾水溶液对分离白酒中有机酸的影响。
（3）柱温箱温度的选择
在方法1.3.3 ③的基础上，选择上述最佳流动相及磷酸二氢钾水溶液pH值，分别设置柱温箱温度为30 ℃、35 ℃和40 ℃，考察不同柱温箱温度对分离白酒中有机酸的影响。
（4）流速的选择
在方法1.3.3 ③的基础上，选择上述最佳流动相、磷酸二氢钾水溶液pH值及柱温箱温度，分别设置流动相流速为0.5 mL/min、0.8 mL/min和1.0 mL/min，考察不同流速对分离白酒中有机酸的影响。
1.3.5 方法学考察
（1）标准曲线、检出限、定量限
将上述标准品溶液稀释成乳酸、乙酸质量浓度均依次为300 mg/L、600 mg/L、1 500 mg/L、3 000 mg/L、4 200 mg/L，己酸、丁酸质量浓度均依次为20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的混合标准溶液。在方法1.3.4色谱条件下进行测定，以标准溶液质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，建立标准曲线回归方程。以信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）为3时的质量浓度作为检出限（limit of detection，LOD），以SNR为10时的质量浓度作为定量限（limit of quantitation，LOQ）。
（2）精密度试验
取同一酒样，基于方法1.3.4的色谱条件对样品重复测定7次，并计算精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
（3）加标回收率试验
向HD7样品中（其中乳酸、乙酸、丁酸、己酸质量浓度分别为1.875 g/L、2.726 g/L、0.651 g/L、0.137 g/L）依次添加100 mg/L、200 mg/L和500 mg/L的4种有机酸标样[19]，基于方法1.3.4的色谱条件进行测定，计算加标回收率。
1.3.6 数据处理
使用Excel2021、Origin2022Pro软件及Labsolution进行数据处理、显著性分析以及可视化。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的优化
2.1.1 磷酸二氢钾水溶液与甲醇体积比的选择
磷酸二氢钾水溶液与甲醇体积比对白酒中4种有机酸分离效果的影响见图1。由图1可知，4种有机酸在3种洗脱条件下均能达到完全分离（R＞1.50）[20]，且4种有机酸保留时间均低于16 min。梯度中甲醇含量过高容易使流路中的磷酸盐析出，造成色谱柱和流路堵塞[21]。随着梯度的变化，会使得泵压升高，造成基线漂移，影响测试的准确性，且对色谱柱的损伤亦随之增大。因此，最适磷酸二氢钾水溶液∶甲醇为80∶20（V/V）。
图1 磷酸二氢钾水溶液与甲醇体积比对白酒中4种有机酸分离效果的影响
Fig.1 Effect of the volume ratio of potassium dihydrogen phosphate aqueous solution to methanol on the separation effect of four organic acids in Baijiu
1.乳酸；2.乙酸；3.丁酸；4.己酸。下同。
2.1.2 流动相中磷酸二氢钾水溶液pH值的选择
流动相中pH值对白酒中4种有机酸分离效果的影响见图2。由图2可知，3种pH值条件下的磷酸盐均能够使乳酸跟乙酸达到分离（R＞1.50），当流动相中磷酸二氢钾水溶液的pH值为2.50、2.70时，丁酸的基线具有较大的漂移，漂移过大会影响测试的准确性[22]。酒体中乙醇的存在，会干扰乳酸与乙酸的分离定性，因此在酒样预处理中会对其pH值进行调节为3.0[18]。而流动相中pH值跟测试样品pH值会对有机酸的测定结果造成影响[11]。因此，最适磷酸二氢钾水溶液的pH值为2.30。
图2 流动相中磷酸二氢钾水溶液的pH值对白酒中4种有机酸分离效果的影响
Fig.2 Effect of pH of potassium dihydrogen phosphate aqueous solution in mobile phase on the separation effect of four organic acids in Baijiu
2.1.3 柱温的选择
柱温对白酒中4种有机酸分离效果的影响见图3。由图3可知，柱温对乳酸和乙酸的分离影响较小，对丁酸和己酸的分离效果影响较大，当柱温为30 ℃、40 ℃时，丁酸和己酸分离时间相应延后。当柱温为35 ℃时，乳酸和乙酸能够达到最大分离度（R=1.52）。因此，最适柱温为35 ℃。
图3 柱温对白酒中4种有机酸分离效果的影响
Fig.3 Effect of column temperature on the separation effect of 4 organic acids in Baijiu
2.1.4 流动相流速的选择
流动相流速对白酒中4种有机酸分离效果的影响见图4。由图4可知，流速增大降低了有机酸的保留时间，3种流速下4种有机酸均能完全分离（R＞1.5），在保证有机酸分离条件（R＞1.5）的前提下，应缩短检测时间，提高效率[23]。因此，最适流速为1.0 mL/min。
图4 流动相流速对白酒中4种有机酸分离效果的影响
Fig.4 Effect of mobile phase flow rate on the separation effect of four organic acids in Baijiu
2.2 方法学考察
2.2.1 线性关系、检出限及定量限
由表1可知，乳酸和乙酸的线性范围为300～4 200mg/L、丁酸和己酸的线性范围为20～400 mg/L。4种有机酸线性回归方程的相关系数R2均≥0.997 9，说明各有机酸质量浓度和峰面积之间有良好的线性关系。4种有机酸的检出限依次为乳酸（0.003 9 mg/mL）、乙酸（0.003 1 mg/mL）、丁酸（0.005 2 mg/mL）、己酸（0.005 3 mg/mL），定量限依次为乳酸（0.0096mg/mL）、乙酸（0.0093 mg/mL）、丁酸（0.015 9mg/mL）、己酸（0.0165mg/mL），各有机酸浓度能够在较低范围内检出。
表1 4种有机酸的线性回归方程
Table 1 Linear regression equation of four organic acids
标样 保留时间/min 线性回归方程 线性范围/（mg·mL-1）相关系数R2 检出限/（mg·mL-1）定量限/（mg·mL-1）乳酸乙酸丁酸己酸4.718 4.947 11.096 15.380 Y=230.551X+9 749.44 Y=263.150X+17 520.80 Y=281.810X+5 300.37 Y=268.492X+9 316.74 0.3～4.2 0.3～4.2 0.02～0.4 0.02～0.4 0.999 9 0.999 9 0.999 4 0.997 9 0.003 9 0.003 1 0.005 2 0.005 3 0.009 6 0.009 3 0.015 9 0.016 5
2.2.2 精密度试验结果
4种有机酸的精密度试验结果见表2。由表2可知，乳酸、乙酸、丁酸和己酸精密度试验结果的RSD值分别为1.21%、1.48%、1.50%、0.83%，RSD值均＜2.0%，表明仪器性能稳定，方法的精密度良好，可以满足试验要求。
表2 4种有机酸精密度试验结果
Table 2 Results of precision test of four organic acids
有机酸 质量浓度/（mg·L-1）RSD/%乳酸乙酸乳酸己酸平均质量浓度/（mg·L-1）1 871.33 2 713.17 651.36 136.59 1 871.53 2 712.15 649.29 134.32 1 868.46 2 714.79 649.32 135.77 1 870.16 2 713.90 648.17 135.91 1 871.43 2 712.94 647.32 136.68 1 871.10 2 713.59 651.36 136.38 1 869.28 2 710.16 649.25 136.59 1 870.47 2 712.97 649.44 136.03 1.21 1.48 1.50 0.83
2.2.3 加标回收率试验结果
4种有机酸加标回收率试验结果见表3。
表3 4种有机酸加标回收率试验结果
Table 3 Results of recovery rates of adding standard experiments
待测组分本底值/（g·L-1）加标量/（g·L-1）理论值/（g·L-1）测定值/（g·L-1）加标回收率/%平均加标回收率/%乳酸95.43乙酸100.53丁酸96.87己酸1.875 1.875 1.875 2.726 2.726 2.726 0.651 0.651 0.651 0.137 0.137 0.137 0.100 0.200 0.500 0.100 0.200 0.500 0.100 0.500 1.000 0.100 0.500 1.000 1.975 2.075 2.375 2.826 2.926 3.226 0.751 1.151 1.651 0.237 0.637 1.137 1.974 2.054 2.364 2.828 2.930 3.214 0.742 1.145 1.659 0.234 0.635 1.128 99.00 89.50 97.80 102.00 102.00 97.60 91.00 98.80 100.80 97.00 99.60 99.10 98.57
由表3可知，乳酸、乙酸、丁酸和己酸的平均加标回收率分别为95.43%、100.53%、96.87%、98.57%，各有机酸回收率均在95%～105%范围内，表明该方法具有较高的准确度，符合试验要求。
2.3 不同轮次酱香型白酒中有机酸含量的测定结果
不同轮次酱香型白酒中4种有机酸含量和总有机酸含量变化见图5。由图5A可知，不同轮次酱香型白酒HD1～HD7中有机酸主要为乳酸和乙酸，其含量呈先增加后降低的趋势，其质量浓度范围分别为1 880.09～3 666.94 mg/L、2 725.25～3 915.73 mg/L，丁酸含量在样品HD1～HD5中变化趋势较为平稳，含量范围为93.69～197.14mg/L，在样品HD6中质量浓度达到最高值，为813.41 mg/L，而在样品HD7中质量浓度降低651.36mg/L，HD6、HD7检出己酸，其含量分别为187.79mg/L、136.59 mg/L。由图5B可知，不同轮次酱香型白酒HD1～HD7中总有机酸含量整体呈先增加后减少的趋势，其在第3轮次酱香型白酒样品中总有机酸含量最高，为7 128.99 mg/L。
图5 不同轮次酱香型白酒中4种有机酸含量（A）和总有机酸含量（B）变化
Fig.5 Changes of organic acid contents (A) and total acid contents (B)in different rounds of sauce-flavor Baijiu
不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）。
范文来等[24]使用液液微萃取结合超高效液相色谱对11种香型白酒中42种有机酸进行测定，结果表明，白酒中有机酸以乳酸和乙酸为主，丁酸和己酸相对含量较少，这与本研究的结果相一致。蒙德俊等[25]采用离子色谱分析酱香型白酒酿造过程中基酒中酸类风味物质的构成，发现乳酸含量随着轮次的增加呈先增长后降低的变化，乙酸含量在总体上是逐级递减的趋势，这与本研究结果相一致。蒋永春等[26]研究发现，酒醅中有机酸的含量是随着发酵时间逐渐变化的。白酒中的酸类物质来源于窖泥及酒醅中的微生物[27-28]，在前期变化缓慢，可能是由于微生物数量较少，因此酸度较低。随着发酵进行，微生物代谢产生大量酸，之后随着营养物质消耗，微生物生长受到抑制，最终导致其代谢产生的酸类物质呈现先增加后减少的趋势。
3 结论
本研究建立并优化了HPLC测定酱香型白酒中乳酸、乙酸、丁酸和己酸含量的方法，并应用该方法探究了不同轮次酱香型白酒中4种有机酸含量的变化规律。采用减压-盐化法处理样品，选用InertSustainSwift C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.02 mol/L磷酸二氢钾水（pH 2.30）溶液为流动相梯度洗脱，柱温箱温度为35 ℃，流速为1.0 mL/min，外标法定量。结果表明，4种有机酸能够在20 min内全部出峰，其中乳酸和乙酸能够在5 min内完全分离。该方法测定乳酸和乙酸，丁酸和己酸时分别在300～4 200 mg/L、20～400 mg/L质量浓度范围内具有良好的线性关系（R2＞0.997 9）。4种有机酸的检出限为0.003 1～0.0053 mg/mL，定量限为0.0093～0.0165 mg/mL，精密度试验结果的RSD均＜2%，平均加标回收率为95.48%～100.53%。在不同轮次酱香型白酒中有机酸含量以乳酸和乙酸为主，丁酸和己酸含量较低，且4种有机酸总含量的变化为先增加后减少。该方法简便，重现性好，能够为白酒企业质量监测提供一定的理论参考。
[1]吕锡斌，吴耀领，郝飞，等.高通量测序技术分析酱香型白酒下造沙轮次的微生物多样性[J].酿酒科技，2019（3）：52-58，64.
[2]苟丹，周仁和，毛霞，等.一次性准确定量白酒中4种酸类物质的方法研究[J].酿酒科技，2023（1）：111-116，129.
[3]ZHUANSUN W W,XU J,LI Z Q,et al.Dynamic changes in the microbial community,flavour components in jiupei of a novel Maotai-Luzhouflavoured liquor under various Daqu blending modes and their correlation analysis[J].LWT-Food Sci Technol,2022,172:114167.
[4]侯睿，向丽萍，张冰雪，等.HPLC同时测定酱香型白酒酒糟中13种有机酸的分析研究[J].酿酒科技，2023（8）：103-107.
[5]CAI X,SHEN Y,CHEN M,et al.Characterisation of volatile compounds in Maotai flavour liquor during fermentation and distillation[J].J I Brewing,2019,125(4):453-463.
[6]冯海燕，卢君，陈竹君，等.酱香型白酒出入窖糟醅性能评价的技术研究[J].酿酒科技，2021（8）：35-42.
[7]ZHANG J,TIAN Z,MA Y,et al.Origin identification of the sauce-flavor Chinese Baijiu by organic acids,trace elements,and the stable carbon isotope ratio[J].J Food Qual,2019,2019(1):7525201.
[8]熊燕飞，马卓，彭远松，等.中国白酒风味成分的色谱分析方法研究进展[J].中国酿造，2019，38（11）：1-5.
[9]杨会，范文来，徐岩.基于BSTFA衍生化法白酒不挥发有机酸研究[J].食品与发酵工业，2017，43（5）：192-197.
[10]江思瑶，宋昊，陈晨，等.白酒酒糟中有机酸的分离提取及香气成分分析[J].食品工业科技，2019，40（17）：206-211.
[11]IVANOVA-PETROPULOS V,PETRUSEVA D,MITREV S.Rapid and simple method for determination of target organic acids in wine using HPLC-DAD analysis[J].Food Anal Methods,2020,13(5):1078-1087.
[12]廖勤俭，王小琴，周韩玲，等.高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法鉴别白酒中羧酸[J].酿酒科技，2019（12）：77-81.
[13]XU J,CHEN M,LIU X.Changes in main trace components of different alcoholic crude Chinese spirits during storage[J].Nephron Clin Pract,2018,14(4):209-211.
[14]罗莉，林培，雷雨婷.离子色谱法测定特香型白酒九种有机酸[J].酿酒，2022，49（4）：97-100.
[15]宋卫得，李兆杰，杨立明，等.离子色谱法快速测定白酒中多种有机酸和阴离子[J].中国酿造，2017，36（11）：153-157.
[16]骆茂香，徐兴江，陈仁远，等.不同工艺酱香型白酒中非挥发性有机酸及酚酸的差异分析[J].酿酒科技，2024（7）：17-24，42.
[17]王梦菡.超高效液相色谱法测定不同香型白酒中乳酸和乙酸的含量[J].食品安全导刊，2021（28）：75-76.
[18]滕明德，莫新良，王先桂.盐化-减压浓缩-高效液相色谱法测定酱香白酒中乳酸和乙酸的含量[J].理化检验-化学分册，2022，58（10）：1225-1227.
[19]余松柏，吴奇霄，黄张君，等.基于HPLC结合多元统计方法分析不同种类酒中有机酸的差异[J].中国酿造，2023，42（2）：46-52.
[20]魏功，王乐，李春芳，等.高效液相色谱法检测白酒中痕量环己基氨基磺酸钠[J].中国酿造，2024，43（4）：247-252.
[21]李咏如，李徐，陶胜男，等.反相高效液相色谱法测定Rancimat测量池水中的短链脂肪酸[J].中国油脂，2017，42（9）：126-128.
[22]李春阳，程倩，陈昭，等.高效液相色谱法同时检测发酵人参中三种稀有人参皂苷[J].中国酿造，2024，43（12）：261-265.
[23]杨成聪，沈馨，马雪伟，等.高效液相色谱法测定米酒中有机酸的含量[J].食品研究与开发，2018，39（10）：116-123.
[24]范文来，龚舒蓓，徐岩.白酒有机酸谱[J].酿酒，2019，46（1）：37-42.
[25]蒙德俊，张娇娇，郭炳豪，等.酱香型白酒轮次基酒酸类风味物质与酒醅微生物的相关性分析[J].食品科技，2022，47（10）：77-83.
[26]蒋永春，雷学俊，郑佳，等.温度胁迫下浓香型白酒酒醅理化性质、有机酸和挥发性风味物质的变化研究[J].酿酒科技，2024（3）：40-46，52.
[27]LU L,ZUO Q,CHENG Y,et al.The mechanism of microbial structure and flavor characteristics in Qing-Jiang-flavor Jiupei regulated by different fermentation seasons[J].Food Chem X,2024,22101392.
[28]CHENG W,CHEN X,XUE X,et al.Comparison of the correlations of microbial community and volatile compounds between pit-mud and fermented grains of compound-flavor Baijiu[J].Foods,2024,13(2):203.