爱德万甜（advantame）是一种超高倍的新型甜味剂，分子式为C24H30N2O7·H2O[1]，是阿斯巴甜的衍生物，甜度远超过传统甜味剂[2]，虽有轻微苦味，但完全被高甜度、低用量所掩盖[3]，又因其能量低，被称之为非营养型甜味剂[4]。自2014年被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准其在部分食品中使用[5-6]后，陆续有多个国家都允许爱德万甜作为甜味剂在食品中限量使用[7-8]。2017年，我国国家卫健委发布公告正式将其纳入新型食品添加剂批准使用[9-10]，并在国标GB 2760—2024《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[11]中规定了爱德万甜在各类食品中的使用限量。近年来，针对爱德万甜的甜味评价和安全评价研究较多[12]，国家市场监管总局于2022年发布了食品补充检验方法BJS 202201《食品中爱德万甜的测定》[13]，尚未颁布关于检测方法的国家标准。相关研究主要集中在料酒[3]、饮料[14-15]、白酒[16-17]、药品糖浆[18]、电子烟烟液[19]等基质简单的产品。发酵乳因其发酵工艺决定了在加工生产过程中必须加入甜味剂才能满足消费者的口味需求，同时，其高脂肪高蛋白的产品特点为检测增加了难度，虞成华等[20]采用1%高氯酸提取，过Oasis HLB固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱进行检测，但该方法净化过程繁琐。采用新一代增强型脂质去除净化技术（Captiva EMR-Lipid）完美结合了体积排阻和疏水作用机制来去除脂质，高选择性、高效的脂质去除过程确保最大程度减少离子抑制对目标分析物的影响，且操作过程相对传统的固相萃取柱减少了活化、淋洗、洗脱等步骤，提供了一种简单的流通式净化，显著提高前处理效率。超高效液相色谱-串联质谱（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS）法是21世纪发展起来的一种高效的分析方法，它结合了超高效液相色谱和串联质谱的优势，能够对复杂基质中的化合物进行高效分离和精确检测，且分离能力强、灵敏度高、准确性强，广泛应用于环境监测、药物分析、科学研究和食品检测等领域[21]。本实验拟采用Captiva EMR-Lipid结合UHPLC-MS/MS技术，建立起发酵乳中爱德万甜的测定方法，减少前处理有机试剂使用，降低污染，同时简化前处理流程，提升工作效率，为提升检测机构的检测能力、监管部门的执法依据和生产企业的质量控制提供技术支撑和方法储备。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
5种发酵乳、12种风味发酵乳（原味炭烧、椰果果粒、黄桃果粒、草莓菠萝双拼、甜心草莓、草莓味、风味酸乳、俄式炭烧、藏式嚼酸奶、燕麦草莓、黄桃燕麦、原味）：购于河南漯河超市。
爱德万甜标准品（纯度97.3%）（CAS：714229-20-6）：北京BePure公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：德国Merck KGaA公司；甲酸（色谱纯）：上海安谱试验科技股份有限公司；氯化钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；Captiva EMR-Lipid净化柱（3 mL/300 mg）：安捷伦科技（中国）有限公司；0.22 μm有机相微孔滤膜：天津津腾实验设备有限公司；实验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
TSQ Quantis超高效液相色谱-串联质谱仪（配加热型电喷雾离子（heatedelectrosprayion，HSEI）源）、HypersilGOLD aQ液相色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.9 μm）：美国赛默飞公司；ME235S电子天平：德国Sartorius公司；HC-3015高速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
称取2.0 g混匀样品（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，加2 mL水，超声（功率360 W，室温）1 min，依次加入2 g氯化钠、20 mL1%甲酸乙腈溶液，超声（功率360 W，室温）2 min，6 000 r/min离心5 min。吸取2.55 mL有机相于另一离心管中，加入0.45 mL水，混匀后过Captiva EMR-Lipid固相萃取柱净化，收集流出液，经微孔滤膜过滤后，待上机进行UHPLC-MS/MS测定。
1.3.2 标准溶液的配制
准确称取标准品20 mg（精确至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到质量浓度为2.0 mg/mL的标准储备液。准确吸取0.1 mL爱德万甜标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，得到质量浓度为20.0 μg/mL的标准中间液。
取经质谱确认、不含爱德万甜的与被测样相同基质的样品，按1.3.2前处理步骤制备空白样品基质溶液。吸取适量的标准中间溶液，用空白样品基质溶液配制成质量浓度分别为0.2 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL系列基质匹配标准使用液。
1.3.3 超高效液相色谱条件
HypersilGOLDaQ液相色谱柱（100mm×2.1×mm1.9μm）；柱温35 ℃；进样量2 μL；流动相为甲醇（A相）-0.1%甲酸溶液（B相）；梯度洗脱程序：0～0.5 min，10%A；0.5～6.0 min，10%～60%A；6.0～10.5 min，60%A；10.5～10.6 min，60%～10%A；10.6～13 min，10%A。
1.3.4 质谱条件
加热型电喷雾离子（HESI）源；扫描方式：正离子模式扫描，选择离子监测（selected ion monitoring，SRM）模式；喷雾电压3 000 V；鞘气压力35 arb；辅助气压力10 arb；反吹气压力1 arb；雾化气温度325 ℃；离子传输管温度325 ℃；一级扫描（Q1）分辨率0.7；一级扫描（Q3）分辨率0.7；质谱参数见表1。
表1 选择离子监测模式下爱德万甜质谱参数
Table 1 Parameters of mass spectrometry for determination of advantame under selected ion monitoring mode
注：“*”为定量离子。
离子模式 母离子（m/z）子离子（m/z）碰撞能量/eV 射频电压/V正离子 459.2 101.92*，252.0 28，20 228.8
1.3.5 定性定量方法
采用基质匹配标准曲线外标法，根据保留时间和定性离子进行定性分析，根据峰面积和定量离子进行定量分析。
1.3.6 方法学考察
（1）标准曲线的绘制[22]
选用空白发酵乳样品，配制系列基质匹配标准使用液，采用优化后的检测条件上机测定，以爱德万甜质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制爱德万甜标准曲线。
（2）检出限和定量限[23]
选用空白发酵乳样品，添加不同质量浓度的爱德万甜标准溶液，采用已确定的前处理方法和测定条件上机测定，以信噪比S/N=3结合空白基质样品噪音响应确定方法的检出限（limit of detection，LOD），以信噪比S/N=10确定方法的定量限（limit of quantitation LOQ）。
（3）加标回收试验
选用空白发酵乳样品，分别添加不同质量浓度标准溶液（爱德万甜的终质量浓度分别为5.0 μg/kg、20.0 μg/kg、100.0 μg/kg），采用已确定的前处理方法和测定条件，每个添加水平重复测定6次，计算加标回收率[24]。
（4）精密度试验
加标样品重复进样6次，采用已确定的前处理方法和测定条件进行检测，计算精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
（5）基质效应
选用空白发酵乳样品，分别绘制空白基质标准曲线和空白溶剂标准曲线，采用两套标准曲线斜率的比值来评价基质效应（matrix effect，ME）。
2 结果与分析
2.1 前处理方法的选择
2.1.1 萃取剂的选择
发酵乳属于发酵型产品，基质比较复杂，含有大量的蛋白质和脂肪，尤其是一些风味发酵乳因添加辅料和添加剂，还会含有色素。本试验选用乙腈盐析萃取法，加入氯化钠，产生强烈的水化作用，使本来溶解在水相中的爱德万甜更好地富集到有机相中；高乙腈的萃取体系不但可以溶出样品中的目标分析物，还可以有效地沉淀蛋白质，减少蛋白沉淀剂的使用[25]。本实验考察了以乙腈作为萃取剂，分别加入0、1%（V/V）、2%（V/V）、5%（V/V）甲酸时的提取效果，经测定，回收率均可达到80%～110%，但经甲酸-乙腈超声萃取后，乙腈相可以快速与水相分层，便于乙腈相的移取，而甲酸浓度的高低对提取结果并无明显影响。综合考虑成本，本实验选取含1%（V/V）甲酸的乙腈溶液作为提取液。
2.1.2 净化条件的选择
Captiva EMR-Lipid利用了一种能够选择性除脂的独特吸附剂，采用传统的净化型固相萃取方式，高效去除复杂基质中的脂质干扰物。本试验比较了传统吸附剂十八烷基硅烷键合硅胶（octadecylsilyl，C18）、N-丙基-乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitizing of carbon black，GCB）和Captiva EMR-Lipid固相萃取小柱对爱德万甜提取液的净化效果，结果见图1。PSA和GCB净化后，目标物的回收率只有20%～40%，而由C18和Captiva EMR-Lipid净化的回收率比较高，超过85%。但经Captiva EMR-Lipid固相微萃取柱净化后，溶液更加澄清透明，说明其除脂能力远远超过C18，且同时可以吸附部分色素。因此，本试验选Captiva EMR-Lipid固相微萃取柱进行净化。
图1 不同吸附剂的固相萃取柱净化效果
Fig.1 Purification effect of solid-phase extraction column with different adsorbents
与传统的固相萃取柱相比，Captiva EMR-Lipid不需要活化、淋洗、洗脱等繁琐操作，可直接将提取液上柱净化，实现“通过式一步净化”，大大缩短了净化时间，但爱德万甜提取液中加水量会影响到吸附剂与样品基质的相互作用，直接影响目标物回收率，因此本实验对过CaptivaEMR-Lipid净化柱的爱德万甜提取液加水量进行了优化。分别吸取3.00mL、2.85mL、2.70mL、2.55 mL、2.40mL、2.25mL、2.10 mL、1.95 mL提取液，依次加入0、0.15 mL、0.30 mL、0.45 mL、0.60 mL、0.75 mL、0.90 mL、1.05 mL超纯水，混匀，即加水量分别为0、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%，过Captiva EMR-Lipid净化柱，检测不同加水量对回收率的影响，结果见图2。由图2可知，在加水量10%～20%时，回收率较好，为90%以上，加水量为15%时，回收率最高，可达105.4%。因此，本实验选取爱德万甜提取液，加水量为15%，上Captiva EMR-Lipid净化柱。
图2 不同加水量对爱德万甜回收率的影响
Fig.2 Effect of different water addition on the recovery rates of advantame
2.2 流动相的选择
实验首先考察了液质分析中常用的有机相甲醇和乙腈对爱德万甜的洗脱效果，分别以甲醇和乙腈作为A相，以水为B相，对爱德万甜标准工作液（质量浓度为0.2 μg/mL）按照1.3.3洗脱程序进行梯度洗脱，结果见图3。由图3可知，两种体系下，目标分析物的保留时间接近，峰型良好，响应值差别不大，考虑到乙腈的毒性更大、成本更高，本实验选用甲醇（A相）-0.1%甲酸溶液、5 mmol/L乙酸铵溶液、10mmol/L乙酸铵溶液（B相）作为流动相，对爱德万甜标准溶液进行梯度洗脱，进一步考察不同流动相对目标物的峰形影响、分离效果和响应强度，结果见图3。由图3可知，不同流动相体系下，目标物均获得对称性好且尖锐的色谱峰，目标物在色谱柱上保留较强，对应的出峰时间无明显区别。经甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相梯度洗脱后时，爱德万甜的响应强度明显高于其他几组流动相体系，故选择此体系作为流动相。在最终确定的色谱条件下，爱德万甜UHPLC-MS/MS分析的总离子流色谱图峰型尖锐对称，响应强度高，出峰时间为6.62 min。
图3 不同流动相体系下爱德万甜的总离子流色谱图
Fig.3 Total ion chromatogram of advantame under different mobile phase systems
2.3 质谱条件的优化
取质量浓度为1 μg/mL的爱德万甜标准溶液，通过蠕动针泵直接进样的方式，分别在正负两种离子扫描模式下进行母离子全扫描（SCAN），确定母离子，采用选择离子监测（SIM）对母离子进行扫描，优化射频电压（RF-lens），在产物离子扫描（Product Ion Scan）模式下进行Q3扫描，筛选响应强、丰度高、干扰少且稳定的离子作为子离子，在SRM模式下优化碰撞能量，结果见图4。由图4可知，采用正离子扫描模式时，目标物的响应值明显高于负离子扫描模式。因此，本试验选择正离子扫描模式分析，并确定了爱德万甜的母离子【M+H】+为m/z 459.2，得到四个相对丰度较高的特征碎片离子m/z 101.9，252.0，192.1，399.2，试验最终选取丰度较高且稳定的两对SRM 离子对m/z 459.2＞101.9和m/z 459.2＞252.0分别作为定量和定性离子，和文献报道一致[13，17，26]，在此基础上进一步对目标物质的质谱参数进行优化，最佳质谱条件见表1。
图4 不同扫描模式下爱德万甜的总离子流色谱图
Fig.4 Total ion chromatogram of advantame under different scanning modes
2.4 基质效应
基质效应在质谱分析中是普遍存在的，通常表现为基质增强或基质抑制，从而影响定量结果的准确性，这可能是经液相色谱柱分离保留，和目标物同一时间流出的共流物引起的。当ME＞1.1时，存在基质增强效应，ME＜0.9时，存在基质抑制效应，0.9＜ME＜1.1时，基质效应不明显[5，27]。通过对酸奶基质分析，在正离子模式下，ME值为0.88，说明，该实验条件下，酸奶样品的爱德万甜基质效应表现为轻微的抑制效应，因此本方法采用基质标准曲线法定量，以消除基质效应的影响。
2.5 方法学考察
2.5.1 线性回归方程、检出限和定量限
采用最终确立的Captiva EMR-Lipid结合UHPLC-MS/MS法测定发酵乳中爱德万甜，以爱德万甜质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标绘制爱德万甜标准曲线，得到爱德万甜标准曲线线性回归方程为y=4.64e+003x+2.09e+002，相关系数R2=0.998 3，说明在正离子模式下，爱德万甜在质量浓度为0.2～500 ng/mL范围内线性关系良好，LOD为0.6 μg/kg，LOQ为2 μg/kg，均可满足检测条件。
2.5.2 加标回收率及精密度试验
加标回收率及精密度试验结果见表2。由表2可知，正离子模式下，在高、中、低不同添加量时，加标回收率为87.9%～102.5%，满足GB 5009.295—2023《食品安全国家标准化学分析方法验证通则》[28]的要求，说明该方法准确度高，满足痕量分析的要求。
表2 爱德万甜加标回收率和精密度试验结果（n=6）
Table 2 Results of standard recovery rates and precision experiments of advantame (n=6)
本底值/（μg·kg-1）加标质量浓度/（μg·kg-1）测定值/（μg·kg-1）加标回收率/%相对标准偏差/%未检出5.0 87.9～97.0 4.05未检出100.0 92.1～101.8 3.67未检出300.0 4.394，4.635，4.538 4.424，4.850，4.782 95.706，94.000，98.588 92.118，101.824，94.412 285.643，298.864，303.907 301.480，307.596，281.160 93.7～102.5 3.57
精密度试验结果相对标准偏差（RSD）为3.57%～4.05%，满足GB 5009.295—2023《食品安全国家标准 化学分析方法验证通则》[28]的要求，说明该方法精密度良好，满足痕量分析的要求。
2.6 实际样品的检测
用本方法对在不同超市和集贸市场随机购买的5种发酵乳、12种风味发酵乳样品进行检测，均未检出爱德万甜。
3 结论
本试验通过对提取液、净化方式、流动相、质谱条件等的选择，建立了Captiva EMR-Lipid 结合UHPLC-MS/MS测定发酵乳中爱德万甜含量的分析方法。该方法以1%甲酸-甲腈溶液作为提取液，减少了蛋白沉淀剂的使用；经Captiva EMR-Lipid固相萃取柱净化，既减少了污染，提高了净化效果，又缩短了净化时间。在正离子模式下，采用Hypersil GOLD aQ液相色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.9 μm），0.1%甲酸溶液-甲醇作为流动相梯度洗脱，基质匹配标准曲线外标法进行定量分析，降低了基质效应；爱德万甜在质量浓度为0.2～500 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数R2为0.998 3，LOD为0.6 μg/kg，LOQ为2 μg/kg，表明该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度，且操作简单、分析速度快，通用性强，满足各种发酵乳中爱德万甜含量的测定要求。
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