泡菜是以多种新鲜蔬菜为原料,将其浸入一定浓度食盐水中,利用乳酸菌等益生菌发酵形成的一类具有独特风味的蔬菜制品[1]。传统泡菜制作多采用自然发酵法,由于没有对蔬菜原料进行杀菌[2],蔬菜自身的微生物、环境中杂菌种类多、对环境的耐受性差异大,导致产品风味及品质不稳定。为解决产品质量不稳定、发酵周期长等问题,可通过人工接种乳酸菌方式发酵泡菜,如植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)能够快速启动发酵,对促进泡菜成熟、减少亚硝酸盐和风味的形成至关重要[3]。泡菜水是经过不断取出泡菜和投加蔬菜及辅料进行泡制而成的卤水,经过多轮(至少三轮)循环发酵形成了老泡菜水生态系统[4-5]。循环发酵的泡菜一般具有高于自然发酵泡菜的酸度(0.8~1.2 g/100 g),相对稳定的微生物菌群结构与数量,以及有机酸、氨基酸、醛类、酯类等丰富的风味物质[6-9],但老泡菜水的这种生产方式周期长、产量小,不利于工业化生产。
蔬菜汁是将各种蔬菜榨汁得到的汁液,可为乳酸菌的生长提供碳源、氮源、生长因子和无机盐等物质,与传统MRS培养基相比,蔬菜汁可食用、营养丰富、成本更低[10-11]。姜晔[12]将番茄汁、胡萝卜汁等添加到基础培养基中进行增殖培养,培养7~8 h后乳酸菌活菌数可以达到9 lg(CFU/mL),而普通脱脂乳培养基仅能达到7 lg(CFU/mL)。蔬菜汁发酵液还含有各种乳酸菌代谢产物,包括有机酸、氨基酸和各种酶类,这与老泡菜水成分相似[13-14]。蔬菜汁发酵液具有一定酸度,能为泡菜提供预酸化环境,促使乳酸菌生长,还有利于风味的形成和缩短发酵周期,董帅等[15]在泡菜发酵液中添加5%的蔬菜汁后,总酸含量达1.794 g/100 g,泡菜特征风味物质有无机氯化物、萜类化合物、醇类和醛酮类、芳香成分和有机硫化物等。由于蔬菜汁本身具有的品质,使得泡菜整体代谢产物和风味更加丰富。
为模拟老泡菜水,本研究以白萝卜、黄瓜、番茄为原料,以植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)P158、LYA31和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PP为发酵菌株制备蔬菜汁发酵液,采用单因素试验及正交试验优化其发酵条件,并采用顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)结合气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)对其挥发性风味化合物进行分析。以期解决泡菜产品品质波动大、发酵工艺周期长等问题,为泡菜产品工业化生产提供新思路。
1.1.1 原料与菌种
白萝卜、黄瓜、番茄、食盐、生姜、大蒜、干辣椒(朝天椒)、食盐等:市售;分离筛选自泡菜的植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)P158和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)PP、分离筛选自醪糟的植物乳植杆菌(Lactobacillus plantarum)LYA31:保存于四川农业大学食品微生物实验室。
1.1.2 试剂
氢氧化钠、酚酞、邻苯二甲酸氢钾、氯化钠、庚酸甲酯、葡萄糖、酵母提取物、大豆蛋白粉:成都浩博优科技有限公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
MRS培养基:青岛海博生物技术有限公司。
PHSJ-3F型pH计:上海仪电科学仪器股份有限公司;6890N-5975C GC-MS联用仪、HP-5MS毛细管色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm):美国Agilent Technologies有限公司;DVB/CAR/PDMS三极萃取纤维头(50/30 μm):美国Supelco公司;SHZ-B电热恒温水浴锅:常州诺基仪器有限公司;LRH-150F生化培养箱:上海浦东荣丰科学仪器有限公司;JA1203B精密电子天平:上海越平科学仪器有限公司。
1.3.1 蔬菜汁发酵液的制备
将新鲜白萝、黄瓜和番茄清水清洗,白萝卜和黄瓜去除头部和尾梢、西红柿去除根蒂后切成小块,各蔬菜按质量比7∶2∶1混合,添加0.05%生姜、0.01%小米辣和0.01%大蒜,以料液比(1∶1)加水进行打浆,经纱布过滤,添加2%食盐、2%葡萄糖、1%酵母提取物、1%大豆蛋白粉,采用巴氏灭菌(65 ℃、30 min)后按7.0 lg(CFU/mL)接种活化后的乳酸菌(将3株乳酸菌冻干菌粉按质量比1∶1∶1于5%葡萄糖水溶液中,30 ℃条件下活化30 min),在37 ℃下培养3 d得到蔬菜汁发酵液。
1.3.2 蔬菜汁发酵工艺优化
单因素试验:在方法1.3.1的基础上,分别考察蔬菜:水料液比(1∶0、1.5∶1.0、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0(g∶mL))、葡萄糖添加量(1%、2%、3%、4%、5%)、食盐添加量(1%、2%、3%、4%、5%)及发酵温度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃)对蔬菜汁发酵液pH、总酸含量的影响[16]。
正交试验:基于单因素试验结果,选取食盐添加量(A)、发酵温度(B)、料液比(C)3个因素作为影响因素,以总酸含量为评价指标,进行3因素3水平的L9(33)正交试验优化蔬菜汁发酵工艺条件,试验因素与水平见表1。
表1 蔬菜汁发酵液发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization of vegetable juice fermentation broth
水平 A 食盐添加量/% B 发酵温度/℃ C 料液比(g∶mL)1 2 3 1 2 3 30 35 37 1.5∶1.0 1.0∶1.0 1.0∶2.0
1.3.3 理化及微生物指标的测定
pH值的测定:采用pH计;总酸的测定:参照GB 12456—2021《食品国家安全标准 食品中总酸的测定》的酸碱指示剂滴定法;乳酸菌数的测定:参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》。
1.3.4 挥发性风味物质测定
参照WU R N等[17]的方法稍作改动,采用HS-SPMEGC-MS对蔬菜汁发酵液的挥发性风味物质进行测定。
HS-SPME条件:于4 mL蔬菜汁发酵液中加入1 g NaCl及10 μL质量浓度为0.1 mg/mL的庚酸甲酯(内标),43 ℃预热30 min后,将萃取纤维头插入GC-MS进样口43 ℃萃取30 min,于230 ℃热解吸5 min。
GC条件:HP-5MS毛细管色谱柱(30m×250μm,0.25μm);载气为超纯氦气(He);不分流模式;流速1 mL/min;辅助加热器温度为280 ℃;升温程序为初始温度35 ℃,保持3 min,以6 ℃/min升温至160 ℃,以10 ℃/min升温至250 ℃;进样口温度230 ℃。MS条件:电子能量70 eV,电子电离(electronic ionization,EI)源;四极杆温度150 ℃。
定性和定量分析:与美国国家标准技术研究所(national institute of standards and technology,NIST)11标准谱库检索,选择相似度>80的物质进行定性分析,采用内标法计算各挥发性风味物质含量,计算公式如下:
1.3.5 气味活度值计算
气味活度值(odor activity value,OAV)是衡量挥发性化合物对整体气味贡献的指标,表示该化合物的浓度与其嗅觉阈值的比值。OAV越大,说明该化合物对气味的贡献越大,定义OAV≥1的物质为关键挥发性风味化合物。
1.3.6 数据分析
采用Origin 2021以及SPSS 22.0对试验数据进行处理和分析。
2.1.1 料液比的确定
白萝卜、黄瓜和番茄本身除了具有一些酸类物质,如草酸、柠檬酸、苹果酸,还具有维生素、蛋白质和矿物质等营养成分,能为乳酸菌提供碳氮源和辅助因子[18]。不同料液比对蔬菜汁发酵液总酸及pH值的影响见图1。由图1可知,随着料液比在1∶0~1.0∶2.0(g∶mL)范围内的增加,pH值变化不大,总酸含量呈先升高后下降的趋势,当料液比为1.5∶1.0、1.0∶1.0(g∶mL)时,总酸含量较高(0.81 g/100 mL、0.78 g/100 mL),且差异不明显,其pH值分别为3.21、3.23。因此,选择最佳料液比为1.0∶1.0(g∶mL)。
图1 不同料液比对蔬菜汁发酵液总酸含量及pH值的影响
Fig.1 Effect of different material liquid ratios on the total acid contents and pH values of vegetable juice fermentation broth
2.1.2 葡萄糖添加量的确定
葡萄糖是乳酸菌的重要碳源物质,能参与乳酸菌的生长代谢,形成酸类、有机酸等风味物质[19]。不同葡萄糖添加量对蔬菜汁发酵液总酸、pH值的影响见图2。由图2可知,当葡萄糖添加量为1%~2%时,总酸含量逐渐增加,pH值逐渐降低;当葡萄糖添加量为2%时,总酸含量达到最高值,pH值最低,分别为0.78 g/100 mL、3.20;当葡萄糖添加量>2%时,总酸含量逐渐下降,pH值逐渐上升。因此,选择最佳葡萄糖添加量为2%。
图2 不同葡萄糖添加量对蔬菜汁发酵液总酸含量和pH值的影响
Fig.2 Effect of different glucose addition on the total acid contents and pH values of vegetable juice fermentation broth
2.1.3 食盐添加量的确定
不同食盐添加量对蔬菜汁发酵液总酸、pH值的影响见图3。由图3可知,当食盐添加量为1%~2%时,总酸含量逐渐增加,pH值逐渐降低;当食盐添加量为2%时,总酸含量达到最高值,pH值最低,分别为0.78 g/100 mL、3.20;当食盐添加量>2%时,总酸含量逐渐下降,pH值逐渐上升。这与欧雪等[20]的研究结果一致。因此,选择最佳食盐添加量为2%。
图3 不同食盐添加量对蔬菜汁发酵液总酸含量和pH值的影响
Fig.3 Effect of different salt addition on the total acid contents and pH values of vegetable juice fermentation broth
2.1.4 发酵温度的确定
发酵温度是影响微生物生长的重要因素,温度通过影响乳酸菌生长代谢从而影响蔬菜汁总酸含量,30~37 ℃为乳酸菌最适生长温度[21]。不同发酵温度对蔬菜汁发酵液总酸、pH值的影响见图4。由图4可知,随着发酵温度在25~37 ℃范围内增加,总酸含量呈先升高后下降的趋势,而pH值的变化与之相反。当发酵温度为35 ℃、37 ℃时,总酸含量及pH均较高,且差异不大,总酸含量分别为0.77g/100mL、0.78g/100mL,pH值分别为3.21、3.20。因此,选择最佳发酵温度为35 ℃。
图4 不同发酵温度对蔬菜汁发酵液总酸和pH的影响
Fig.4 Effect of different fermentation temperature on the total acid and pH value of vegetable juice fermentation broth
在单因素试验的结果的基础上,固定葡萄糖添加量为2%,选取食盐添加量(A)、发酵温度(B)、料液比(C)3个因素为影响因素,以总酸含量为评价指标,采用3因素3水平的L9(33)正交试验优化蔬菜汁发酵工艺条件,结果与分析见表2。
表2 蔬菜汁发酵液发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization of vegetable juice fermentation broth
试验号 A 食盐添加量/%B 发酵温度/℃C 料液比(g∶mL)总酸含量/(g·100 mL-1)1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 0.70 0.68 0.62 0.59 0.64 0.81 0.50 0.68 0.58 K2 K3 R 2.00 2.04 1.76 0.28 30 35 37 30 35 37 30 35 37 1.79 2.00 2.01 0.22 1.5:1.0 1.0:1.0 1.0:1.5 1.0:1.0 1.0:1.5 1.5:1.0 1.0:1.5 1.5:1.0 1.0:1.0 226.75 223.50 223.75 3.25
由表2可知,由极差R可知,影响总酸含量因素主次顺序为料液比(C)>食盐添加量(A)>发酵温度(B)。由K值可知,最优组合均为A2B3C1,即葡萄糖添加量2%、食盐添加量2%、发酵温度37 ℃、料液比1.5∶1.0(g∶mL)。在此条件下进行3次平行试验验证,总酸含量为0.81 g/100 mL,pH值为3.20,乳酸菌活菌数达到8.590 lg(CFU/mL)。
主体风味成分不但受到挥发性物质相对含量的影响,而且与风味阈值密切相关[22]。蔬菜汁发酵液的挥发性风味物质含量及其OAV见表3。由表3可知,蔬菜汁发酵液共鉴定出26种挥发性风味成分,其中酸类2种、酯类1种、醇类9种、醛类5种、酮类4种、烃类2种以及其他类3种。检出的酸类物质为异丁酸和异戊酸,能为泡菜提供果香和甜香,但其阈值较高,对风味贡献不明显。硫代乙酸甲酯是蔬菜汁发酵液中检出的唯一一种酯类物质,其含量为1.71 μg/kg。醇类物质种类最丰富,其中乙醇、正己醇含量相对较高,分别为58.13 μg/kg和12.26 μg/kg,可能是乳酸菌的异型发酵使醇类积累[23],但乙醇香气阈值较高,其OAV低,对风味贡献不明显;正己醇OAV为2.19,为特征挥发性风味物质,能为泡菜提供果香和酒香味,芳樟醇含量虽较低(1.09 μg/kg),但其阈值较低,OAV为4.95,对泡菜中花香和甜香风味有重要贡献。醛类物质中,反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、正己醛含量较高,分别为7.21 μg/kg、3.45 μg/kg、2.24 μg/kg,巴豆醛和反-2-辛烯醛阈值较低,OAV>1,具有果香、脂肪香。酮类物质中甲基庚烯酮含量较高,为5.92 μg/kg,其具有青草香,可能来源于不饱和脂肪酸的氧化作用[24],可以增强泡菜的风味层次。2种烃类物质均属于烯烃类,为莰烯、α-姜黄烯,其来源于生姜等植物原料自身成分。其他类化合物中硫化物为二甲基二硫和二甲基三硫,其含量分别为41.15 μg/kg和4.13 μg/kg,由于它们的香气阈值较低,OAV较高,分别为37.41和41.33,其可能来源于白萝卜,对风味形成至关重要。此外,2,4-二叔丁基苯酚含量较高,为22.80 μg/kg。
表3 蔬菜汁发酵液挥发性风味物质含量及其香气活度值
Table 3 Contents and odor activity values of volatile flavor substances in vegetable juice fermentation broth
注:“-”表示未查找到阈值或无法计算。
种类 保留时间/min 化合物 香气阈值/(mg·kg-1)[29-30] 含量/(μg·kg-1)OAV 气味描述[31]0酸类(2)0.01酯类(1)-0 0 0醇类(9)0.01 2.19 0.01 4.95果香、干酪香、甜香果香奶酪味、鸡蛋味强烈酒精味果香果香青草香果香、酒香4.85 7.14 3.37 1.30 3.10 4.08 5.22 7.83 13.55 14.28 16.16 16.61 1.88 5.78 10.40 13.18 14.39 11.21 13.41 16.50 3.62 10.02 23.17 4.21 10.62 23.75异丁酸异戊酸硫代乙酸甲酯乙醇1-戊烯-3-醇3-甲基-3-丁烯-1-醇异戊烯醇正己醇辛醇芳樟醇薄荷醇松油醇巴豆醛正己醛反-2-庚烯醛反-2-辛烯醛壬醛甲基庚烯酮5-甲基-1-苯基己烷-1-酮4-(1-甲基乙基)-环己烯-2-烯-1-酮乙偶姻莰烯α-姜黄烯二甲基二硫二甲基三硫2,4-二叔丁基苯酚6.550 5 0.49-950 0.358 1 0.547 125 0.25 0.005 6 0.125 8 0.000 22-1.2 0.000 3 0.005 0.04 0.003 0.001 1 0.068 4.13 4.45 1.71 58.13 3.90 0.87 1.33 12.26 1.43 1.09 6.98 1.61 0.96 2.24 7.21 3.45 0.78 5.92 0.39 1.91 1.77 1.13 0.83 41.15 4.13 22.80-0醛类(5)3.21 0.45 0.18 1.15 0.71 0.09柑橘、花香、甜香薄荷味清淡花香果香脂肪、青草、果味青草味脂肪、黄瓜、肉味橙花花香青草香、柑橘香酮类(4)——0.014 0.13烃类(2)——其他(3)0.001 1 0.000 1 0.5 37.41 41.33 0.05焦香、脂香柠檬香辛香刺激洋葱味肉香、洋葱香
蔬菜汁发酵液中关键挥发性风味化合物(OAV≥1)有正己醇、芳樟醇、巴豆醛、反-2-辛烯醛、二甲基二硫、二甲基三硫。研究表明,老盐水发酵的泡菜中二甲基二硫和二甲基三硫对风味影响较大[25],含硫化合物也是萝卜泡菜的重要风味化合物。成熟泡菜中通常还含有乙醇、芳樟醇、松油醇、己醇等醇类化合物[26],这些物质为泡菜提供了清新的水果和花香气味,壬醛、正己醛、反-2-辛烯醛等醛类能为泡菜提供清新的水果香。史梅莓等[5]的研究结果表明,将二甲基三硫、芳樟醇、松油醇、壬醛、乙偶姻等确定为多轮发酵泡菜的重要挥发性风味成分。CHEN A J等[27]在发酵6轮的萝卜泡菜中检出了二甲基二硫、二甲基三硫、芳樟醇、壬醛等物质成分;陈功等[25]将萝卜、白菜、辣椒循环发酵后,检出了二甲基硫醚、二甲基二硫、二甲基三硫、苧烯、乙醛、芳樟醇等物质;RAO Y等[28]在老盐水发酵的萝卜泡菜中检测出苯甲醛、哌啶-2-硫酮、四氢吡咯-2-硫酮二甲基三硫、1-十二醇等物质。综上研究表明蔬菜汁发酵液具备与老泡菜水相似的风味化合物。
本研究通过单因素、正交试验得到蔬菜汁发酵液最优发酵条件为:葡萄糖添加量2%、食盐添加量2%、料液比1.5∶1.0(g∶mL)、发酵温度37 ℃。在此优化条件下,蔬菜汁发酵液的总酸含量达0.81 g/100 mL,pH值为3.20,乳酸菌活菌数达8.59 lg(CFU/mL)。蔬菜汁发酵液中共检出26种挥发性风味化合物,包括酸类2种、酯类1种、醇类9种、醛类5种、酮类4种、烃类2种以及其他类3种。关键挥发性风味物质(OAV≥1)有正己醇、芳樟醇、巴豆醛、反-2-辛烯醛、二甲基二硫、二甲基三硫6种。可将此发酵液应用于发酵泡菜,以期获得具有传统老泡菜水发酵风味的泡菜产品。
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