红酸汤是用于制作酸汤火锅、酸汤丝娃娃、酸汤砂锅粉等贵州传统特色美食的重要调料，其制作方法主要采用番茄、辣椒和食盐等原料，在经过彻底清洗、细致破碎和充分搅拌后装入坛中密封，通过自然发酵加工制成[1-3]。其富含维生素、有机酸、可溶性多糖和游离氨基酸等多种营养成分，并具备增强免疫力、促进肠道蠕动、改善心血管功能、抑制炎症等功效[4-7]。由于其色泽红亮、酸爽可口、辣味柔和以及香气浓郁的独特风味特征，深受当地人民的喜爱[8]。
红酸汤作为一种发酵食品，其原料自身可能携带腐败菌和致病菌[9]。在灭菌过程中，若灭菌方法不当或处理不达标，会导致红酸汤在包装、储藏、运输过程中菌群组成和数量不断变化且难以控制，易发生变味、变色、涨袋等现象，从而严重影响产品的品质并增加安全风险[10-11]。目前，红酸汤生产企业主要采用巴氏灭菌、蒸汽灭菌和高温瞬时灭菌等不同灭菌工艺对其产品进行灭菌处理，但关于不同灭菌工艺所导致的红酸汤产品品质差异的研究相对较少[12]。有研究表明，不同灭菌工艺会对食品的营养、风味等品质造成不同的影响[13]。如张艳等[14]对韩国泡菜进行了辐照灭菌和巴氏灭菌处理，发现韩国泡菜在辐照灭菌后会导致涨袋率升高，而巴氏灭菌可以有效杀灭腐败菌并保持一定数量的乳酸菌；冉露霞等[15]对比了超高压灭菌和巴氏灭菌对百香果果汁品质的影响，发现巴氏灭菌不仅会导致总色差显著升高，还会造成酯类、醇类、醛类等挥发性化合物的显著损失，而超高压灭菌则可较好的保留；黄小兰等[16]研究发现蒸汽灭菌和巴氏灭菌会显著降低剁椒产品的色泽和维生素C含量，并增加酸值和过氧化值，导致产品的感官评分降低。
因此本研究旨在对超高压灭菌、巴氏灭菌和蒸汽灭菌处理后的红酸汤在储藏期间理化、微生物指标的变化以及储藏期后的理化、感官指标进行比较分析，以期为红酸汤产品灭菌工艺的选择提供科学依据，为产品的提质保真提供良好的技术手段参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
番茄、辣椒：贵阳市售。
1.1.2 试剂与培养基
无水乙醇、甲醇、福林酚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；草酸、2,6-二氯靛酚、酚酞试剂、硼酸钠、亚铁氰化钾、盐酸萘乙二胺、乙酸锌、冰醋酸、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯）、亚硝酸钠（纯度＞99.9%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酒石酸、苹果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸（纯度均＞99.9%）：上海麦克林生化科技股份有限公司；0.22 μm滤膜：天津津腾公司；维生素C、没食子酸（纯度均＞99%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；磷酸（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；磷酸二氢铵（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯）：北京化工厂；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基：上海博微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FA1204C电子分析天平：上海天美天平仪器有限公司；HH-4S电热恒温水浴锅：上海捷呈实验仪器有限公司；PHSJ-4F型pH计：上海雷磁仪器厂；超高压食品灭菌设备：山西力德福科技有限公司；GI54DS立式自动压力蒸汽灭菌器：厦门致微仪器有限公司；H1850R离心机：湘仪离心机仪器有限公司；1260型高效液相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；NH310色差仪：广东三恩时科技有限公司；3020型酶标仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；PEN3电子鼻：德国Airsense公司。
1.3 方法
1.3.1 红酸汤的制备
选择无损伤和病斑的番茄和辣椒，先去除茎蒂，清洗并分别破碎。按照70%番茄和30%辣椒的比例（W/W）进行均匀混合，并添加其混合物质量的8%食盐。装入干净土坛密封，自然发酵25 d后即获得红酸汤原料。
1.3.2 不同杀菌方式对红酸汤品质的影响
以发酵25d且不灭菌的红酸汤为对照（CK），研究超高压灭菌（400 MPa、5 min，编号UHP）、巴氏灭菌（78 ℃、10 min，编号PT）和蒸汽灭菌（121 ℃、5 min，编号SS）方式对红酸汤品质的影响，参考王梅等[17]的方法在密封避光干燥的环境中室温条件下储藏100 d，储藏期间每20 d取样测定菌落总数、pH值和可滴定酸，并在储藏100 d时测定其维生素C、总酚含量、抗氧化性、亚硝酸盐、有机酸含量、色差和电子鼻气味差异。
1.3.3 微生物指标测定
菌落总数：参照GB 4789.2—2022《食品微生物学检验菌落总数测定》执行[18]。
1.3.4 部分理化指标测定
pH值：根据GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》测定[19]；总酸含量：按照GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》进行检测[20]；维生素C含量：根据GB 5009.86—2016《食品中抗坏血酸的测定》中2,6-二氯靛酚滴定法进行测定[21]；亚硝酸盐含量：根据GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中分光光度法测定[22]。
1.3.5 总酚含量测定
采用福林酚法[23]测定样品中的总酚含量，准确称取5 g样品，加入蒸馏水15 mL，8 000 r/min常温离心5 min，取1 mL上清液，分别加入1 mL福林酚和3 mL 7.5%碳酸钠溶液，蒸馏水定容至10 mL，避光反应30 min，在波长765 nm处测定吸光度值。以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程为y=0.014 2x+0.084 1，相关系数R2=0.997。
1.3.6 抗氧化活性测定
DPPH自由基清除率的检测，参照TANG W等[24]的方法，精确称取5 g样品，用蒸馏水定容10 mL，4 500 r/min离心10 min，取上清液配制成不同浓度的样品，分别加入100 μL DPPH溶液（0.2 mmol/L）和100 μL样品，室温避光静置30 min，在酶标仪波长517 nm处测吸光度值，样品与DPPH溶液反应的吸光度值为A样，以无水乙醇代替DPPH溶液的空白组吸光度值为A空，以无水乙醇代替样品的对照组吸光度值为A对照。DPPH自由基清除率计算公式如下：
1.3.7 有机酸测定
参照熊瑛等[25]的方法，精确称取10 g样品，加入0.5 g活性炭，定容至50 mL，8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm水系滤膜后进行检测。HPLC条件：C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为95%0.01 mol/L磷酸二氢铵溶液（pH为2.6）和5%的甲醇溶液；流速为0.8 mL/min；进样量10 μL；柱温25 ℃；检测波长210 nm。
1.3.8 色差
采用色差仪测定[26]。采用仪器自带白板的色差值（L*=76.48、a*=2.23、b*=10.84）为标准，测定明度L（L=0；L=100表示白色）、彩度指数a*（正数表示红色，负数表示绿色）和b*（正数表示黄色，负数表示蓝色）。通过公式计算总色差ΔE：
1.3.9 挥发性气味分析
参照李国林等[27]的方法并稍做改动，准确称取1 g红酸汤置于20 mL顶空瓶中，室温（25±2）℃，静置1 h后用电子鼻测定其挥发性气味，每个样测定3次。测定时电子鼻运行参数如下：测定时间120 s，冲洗时间40 s，进样准备时间5 s，进样流速600 mm/min。PEN3型电子鼻传感器名称及性能：W1C（芳烃化合物）；W5S（氮氧化合物）；W3C（氨、芳香成分）；W6S（氰化物）；W5C（烯烃、芳族、极性分子）；W1S（烷烃类）；W1W（硫化合物）；W2S（醇类、部分芳香族化合物）；W2W（芳香成分、有机硫化物）；W3S（烷烃和脂肪族）。
1.3.10 数据处理与统计分析
数据采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）进行Tukey显著性差异检验，差异显著为P＜0.05。图表制作采用Origin 2017软件。电子鼻数据采用电子鼻配套的Winmuster 统计分析软件对红酸汤进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）和载荷分析（loadings analysis，LA）。
2 结果与分析
2.1 不同杀菌方式对红酸汤在储藏期pH值和总酸含量的影响
pH和总酸是红酸汤重要的理化指标，可直接反应红酸汤的微生物代谢情况，对其口感和风味具有影响[28]。本研究对不同灭菌处理的红酸汤样品在100 d储藏期内的pH值和总酸含量进行了检测，结果见图1。由图1可知，所有红酸汤样品在储藏期的pH值均呈下降趋势，CK组较其他灭菌组的pH值下降较快，而SS组相较于其他组pH值下降较慢，储藏期100 d时，CK组的pH值最低为3.54±0.07，与3个灭菌组的pH值（3.67±0.02～3.81±0.01）相比差异显著（P＜0.05），其中SS组的pH值最高为3.81±0.01，表明灭菌处理和灭菌方式对红酸汤的pH值在储藏期的变化具有影响；总酸含量在储藏期内均呈上升趋势，在储藏期0 d时，CK组的总酸含量为（6.34±0.06）g/kg与灭菌组的总酸含量（6.12±0.13～6.5±0.06）g/kg相比差异不显著（P＞0.05），经过100 d的储藏，所有样品总酸含量均有升高，其中CK组的总酸含量较其他处理组升幅较大，达到（11.01±0.14）g/kg，其次为PT组和UHP组，分别为（9.51±0.24）g/kg和（8.3±0.16）g/kg，而SS组的总酸含量最低，仅（7.47±0.08）g/kg。结果表明，灭菌处理可以有效控制微生物从而减缓红酸汤在储藏期内pH值和总酸含量的变化。
图1 不同灭菌方式对红酸汤在储藏期pH值（a）和总酸含量（b）的影响
Fig.1 Effects of different sterilization methods on pH (a) and total acid contents (b) of red sour soup during storage
2.2 不同灭菌方式对红酸汤在储藏期菌落总数的影响
由图2可知，不同灭菌方式对红酸汤的灭菌均具有较好的效果。在储藏期0 d时，CK组的菌落总数为3.57×105CFU/g，经过灭菌处理后，下降至0～2.3×103 CFU/g，3种灭菌方式的灭菌率均＞99%，其中SS组的灭菌效果最好，菌落总数＜1 CFU/g。随着储藏时间延长，所有样品的菌落总数均呈现上升趋势，其中PT组的菌落总数增长较快，贮藏期到达100 d时，PT组的菌落总数已达3.17×105 CFU/g，SS组的菌落总数最低，仅为1.77×102 CFU/g，相较于CK组，PT组、UHP组和SS组的菌落总数分别下降了60.10%、83.92%和99.77%，综上，在3种灭菌方式中，蒸汽灭菌对红酸汤菌落总数的效果最佳，其次是超高压灭菌。
图2 不同灭菌方式对红酸汤在储藏期菌落总数的影响
Fig.2 Effects of different sterilization methods on the total colonies counts of red sour soup during storage
2.3 不同杀菌方式对红酸汤储藏后维生素C和总酚含量的影响
由图3可知，在储藏100 d后，CK组的总酚和维生素C含量分别为（377.06±2.97）mg/kg和（45.69±1.68）mg/kg，经过灭菌处理后的红酸汤样品，总酚和维生素C含量均显著下降（P＜0.05），并且不同灭菌方式对总酚和维生素C含量的影响显著（P＜0.05）。总体而言，总酚和维生素C含量由高到低的排列顺序为CK组＞UHP组＞PT组＞SS组，相较于CK组，UHP组、PT组和SS组的维生素C含量分别下降了6.01%、17.09%和37.06%，而总酚含量分别下降了7.50%、13.26%和54.88%，有研究表明，温度会影响维生素C和部分多酚的稳定性，高温环境会引起氧化降解以及酚类和蛋白质的聚合反应[29-30]。综上可知，超高压灭菌对红酸汤总酚和维生素C的影响相对较小。巴氏灭菌和蒸汽灭菌对红酸汤总酚和维生素C含量的影响显著，相较之下，巴氏灭菌对总酚和维生素C的影响较小，且随着温度升高，这种影响更为明显。
图3 不同灭菌方式对红酸汤储藏后维生素C和总酚含量的影响
Fig.3 Effects of different sterilization methods on vitamin C and total phenol contents after storage of red sour soup
不同字母表示不同组别同一指标差异显著（P＜0.05）。下同。
2.4 不同杀菌方式对红酸汤储藏后抗氧化活性的影响
DPPH自由基清除率是一种常用于评价样品体外抗氧化能力的标准方法。由图4可知，红酸汤表现出一定的抗氧化能力，在储藏100 d后，红酸汤对DPPH自由基清除率随着样品浓度增加而升高。当样品质量浓度为50 mg/mL时，CK组和UHP组对DPPH自由基清除率分别为（37.47±1.04）%和（38.27±0.88）%，差异不显著（P＞0.05），而PT组和SS组的DPPH自由基清除率较低，均≤30%；当样品质量浓度为100～300mg/mL时，红酸汤对DPPH自由基清除率随样品质量浓度增加而升高；当样品质量浓度达到500 mg/mL时，对DPPH自由基清除率由强到弱依次为CK组＞UHP组＞PT组＞SS组，且与总酚和维生素C含量的结果吻合。此外，相较于巴氏灭菌和蒸汽灭菌方法，超高压灭菌对红酸汤的抗氧化能力影响较小。
图4 不同灭菌方式对红酸汤储藏后DPPH自由基清除率的影响
Fig.4 Effects of different sterilization methods on DPPH free radical scavenging rates after storage of red sour soup
2.5 不同杀菌方式对红酸汤储藏后亚硝酸盐含量的影响
亚硝酸盐是否超标是发酵蔬菜食品安全的重要指标之一，红酸汤在发酵过程中乳酸菌产生的硝酸还原酶会将硝酸盐还原为亚硝酸盐[31]。由图5可知，储藏100 d后的红酸汤样品对照组和处理组的亚硝酸盐含量分别为（1.54±0.09）～（1.96±0.05）mg/kg，远低食品安全国家标准（＜20 mg/kg）[32]；其中亚硝酸盐含量最高的是UHP组，为（1.96±0.05）mg/kg，显著高于CK组（1.82±0.06）mg/kg（P＜0.05），含量最低的是PT组和SS租，但其差异不显著（P＞0.05），有研究指出，在经过高温处理并处于酸性环境下，亚硝酸盐会发生降解，因此其含量相对较低[33]。
图5 不同灭菌方式对红酸汤储藏后亚硝酸盐含量的影响
Fig.5 Effects of different sterilization methods on nitrite contents after storage of red sour soup
2.6 不同杀菌方式对红酸汤储藏后有机酸含量的影响
有机酸是红酸汤重要的营养成分之一，主要来源于原料番茄和辣椒以及发酵过程中微生物产生的代谢产物，对红酸汤的口感和风味具有重要影响。由表1可知，储藏100 d后，CK组与UHP组、PT组和SS组的有机酸含量差异显著（P＜0.05），其中UHP组的酒石酸和苹果酸含量最高，分别为（31.56±0.16）mg/kg和（38.27±0.78）mg/kg，SS组的丙二酸含量最高，为（66.11±0.46）mg/kg，但其他有机酸含量均相对偏低，且未检测出柠檬酸。总体来看，所有样品中有机酸含量最高的是乳酸和乙酸，由高到低依次为CK组＞UHP组＞PT组＞SS组，与CK组相比较，有机酸含量较为接近的是UHP组，其次为PT组。以上结果表明，乳酸和乙酸是红酸汤的主要有机酸成分，灭菌处理改变了红酸汤原有的微生物群落结构，进而影响了储藏期间微生物对有机酸的代谢过程。与蒸汽灭菌和巴氏灭菌相比，超高压灭菌对乳酸菌的影响较小。
表1 不同杀菌方式对红酸汤储藏后有机酸含量的影响
Table 1 Effects of different sterilization methods on organic acids content after storage of red sour soup
注：同一列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
灭菌方式含量/（mg·kg-1）酒石酸 苹果酸 丙二酸 乳酸 乙酸 柠檬酸 总量CK UHP PT SS 27.62±0.43b 31.56±0.16a 26.30±0.11c 10.76±1.08d 31.36±0.45c 38.27±0.78a 36.64±0.32b 8.82±0.11d 15.20±0.36b 12.59±0.43d 14.09±0.07c 66.11±0.46a 680.57±1.89a 554.63±3.64b 499.47±1.92c 442.86±3.73d 264.89±1.86a 120.98±1.00b 116.98±0.41b 107.39±4.56c 95.87±4.45b 107.52±1.49a 112.17±0.80a-1 115.51±9.44a 865.55±7.50b 805.65±3.63c 635.94±9.94d
2.7 不同杀菌方式对红酸汤储藏后色泽的影响
红酸汤的色泽主要呈红色或略带浅黄色。由表2可知，不同灭菌方式对红酸汤在100 d储藏后的色泽具有影响，从明亮度上来看，UHP组、PT组和SS组的L*值均显著高于CK组（P＜0.05），说明灭菌处理可以提高红酸汤在储藏期的明亮度，可能与未灭菌红酸汤在储藏期仍在发酵有关；从红绿值a*、黄蓝值b*和色差值ΔE上看，CK组均显著高于UHP组、PT组和SS组（P＜0.05），且PT组与SS组差异不显著，说明CK组相较于灭菌后的处理组更偏红、偏黄，灭菌处理颜色变化的原因可能是番茄红素和类胡萝卜素的降解以及高温造成的美拉德反应[34]；色差值由高到低依次为CK组＞UHP组＞PT组＞SS组，虽然超高压灭菌会对红酸汤的色泽产生一定影响，但相较于巴氏灭菌和蒸汽灭菌，其能更好地保留红酸汤的色泽。
表2 不同杀菌方式对红酸汤储藏后色泽的影响
Table 2 Effects of different sterilization methods on the color after storage of red sour soup
灭菌方式 L*值 a*值 b*值 ΔE CK UHP PT SS 35.61±0.20d 37.27±0.57c 37.55±0.43b 38.26±0.21ab 14.28±0.27a 12.46±0.51b 9.75±0.24c 9.22±0.57c 11.93±0.11a 10.55±0.20b 9.01±0.37c 8.28±1.08c 42.79±0.26a 40.69±0.56b 39.87±0.45c 39.12±0.24c
2.8 不同杀菌方式对红酸汤储藏后气味差异的影响
对储藏100 d后的样品进行电子鼻气味分析，由图6可知，第一主成分方差贡献率和第二主成分的方差贡献率和为99.82%，远高于85%，说明该方法对红酸汤的气味信息提取相对完整，分析中未受其他气味干扰。CK组和UHP组的红酸汤在第一主成分上有部分重叠，PT组和SS组在第二主成分有部分重叠，说明CK组与UHP组气味较为接近，CK组和PT组和SS组在第一主成分距离相对较远，可能是高温对红酸汤的气味造成了一定影响。
图6 基于电子鼻分析响应值不同灭菌方式红酸汤储藏后的主成分分析结果
Fig.6 Principal component analysis result of red sour soup with different sterilization methods after storage based on the response values of electronic nose analysis
LDA是通过对样品气味进行线性组合来实现气味区分。由图7可知，对照组和各处理组的样品在第一主成分上均能较好的分开，表明电子鼻线性判别分析可以准确识别杀菌处理对红酸汤造成的气味差异。此外，CK组和UHP组之间距离较为接近，而与PT组和SS组相比距离较远，表明CK组和UHP组具有更为相似的气味特征。由此可知，超高压灭菌对红酸汤的气味影响较小，巴氏灭菌和蒸汽灭菌对红酸汤的气味影响相对较大。
图7 基于电子鼻分析响应值不同灭菌方式红酸汤储藏后的线性判别分析结果
Fig.7 Linear discriminant analysis results of red sour soup with different sterilization methods after storage based on the response values of electronic nose analysis
载荷分析的目的是为了判定10个传感器对相应气味的贡献率。当传感器的响应值与坐标轴上的1越接近时，表示其贡献率越高；相反，当接近坐标轴原点0时，则对应气味的贡献率较低。对储藏100 d后的四组红酸汤样品分别进行线性判别分析，结果见图8。由图8可知，CK组W5S（在第一主成分＞90%）和W2S（在第二主成分＞85%）传感器的贡献率较高，表明红酸汤气味以氮氧化合物、乙醇和部分芳香族化合物为主。UHP组W5S（在第一主成分＞80%）和W2S（在第二主成分＞80%）传感器的贡献率较高，其次为W1W传感器（在第一主成分＞40%）。PT组W1W（在第一主成分＞80%）和W1S（在第二主成分＞70%）传感器的贡献率较高，SS组W1W（在第一主成分＞65%）和W5S（在第一主成分55%）传感器的贡献率较高，其次为W1S和W2W（均在第一主成分和第二主成分＞25%）传感器，表明超高压灭菌、巴氏灭菌和蒸汽灭菌均会增加传感器W1W的响应值，增加气味中硫化物贡献率，造成刺激性气味增加。此外，巴氏灭菌和蒸汽灭菌还会增加W1S传感器的响应值，表明气味中烷类化合物贡献率增加，有研究表明高温处理会造成烷类物质增加[35]。综合比较可以看出超高压灭菌相较于巴氏灭菌和蒸汽灭菌对红酸汤气味的影响相对较小。
图8 基于电子鼻分析响应值不同灭菌方式红酸汤储藏后的线性判别分析载荷因子图
Fig.8 Loading factor diagram of linear discriminant analysis red sour soup with different sterilization methods after storage based on the response values of electronic nose analysis
a-CK；b-UHP；c-PT；d-SS。
3 结论
本研究探讨了超高压灭菌（400 MPa、5 min）、巴氏灭菌（78 ℃、10 min）和蒸汽灭菌（121 ℃、5 min）对红酸汤在储藏期100 d内pH、总酸和菌落总数的变化，以及储藏期结束后对维生素C、总酚、DPPH自由基清除率、亚硝酸盐、有机酸、色泽和气味的影响。结果显示，3种灭菌方式的灭菌率均达到99%以上。其中蒸汽灭菌后的红酸汤在储藏期的pH值、总酸和菌落总数的变化相对更加稳定。在储藏期100 d结束时，超高压灭菌处理后的红酸汤维生素C、总酚含量均最高，分别为42.94 mg/kg、348.77 mg/kg；DPPH自由基清除率最高，为38.27%～96.08%；乳酸含量为554.63 mg/kg，色差值ΔE为40.69，与对照组乳酸含量（680.57 mg/kg）和色差值（42.79）更为接近。电子鼻检测结果表明，3种灭菌方式均会增加硫化合物的贡献率；而巴氏灭菌和蒸汽灭菌还会增加烷类化合物的贡献率。综上所述，相较于巴氏灭菌和蒸汽灭菌，超高压灭菌是一种更为适宜的处理方法，在有效灭菌的同时，能够更好地保留红酸汤的风味和营养成分，该研究可为酸汤生产企业提供应用参考。
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