泡菜作为中国的传统发酵食品，历史悠久，可追溯至3 100年前的商代武丁时期[1]。泡菜是以蔬菜为原料，且主要为十字花科（Cruciferae）蔬菜，例如萝卜、芥菜等，在乳酸菌、酵母菌等作用下发酵生成的以酸香为主要感官属性的冷加工发酵产品[2]。泡菜因其丰富的益生元（低聚果糖、菌粉和果寡糖等）、益生菌（乳酸菌、双歧杆菌等）、后生元（有机酸、氨基酸和维生素等）、隐生元（纤维多糖、多酚和抗性淀粉等）在肠道中通过微生物酶代谢产生的活性物质等备受消费者的喜爱[3-6]。据统计，截至2023年中国泡菜的市场规模已达735亿，其中四川泡菜占比高达70%[7]。泡菜的品质一方面取决于色泽、质构，一方面取决于风味，这直接决定着消费者的接受度[8]。然而，目前市场上的泡菜普遍存在质量不一、货架期短、色泽褪去较快等现象，严重影响了泡菜的感官品质。
有机酸作为泡菜的重要风味构成物质，其种类决定着泡菜最终的感官属性[9]。有机酸在泡菜发酵过程中扮演着重要角色，其含量的变化不仅反映泡菜的成熟程度，而且影响泡菜品质与风味，是检测食品品质和消费者接受度的重要指标[8，10]。泡菜中常见有机酸包括乳酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸和琥珀酸等，发酵成熟的泡菜中主要以乳酸、乙酸、柠檬酸为主[10]。不同的有机酸呈现的滋味效果不同，乙酸酸感刺激、乳酸酸感柔和、苹果酸呈现浓郁爽口的口感、柠檬酸呈现强烈的酸感[9]。同样地，发酵成熟泡菜的不同有机酸组成也影响着泡菜的最终感官属性，但泡菜的质量在很大程度上取决于原材料以及发酵体系中的微生物，其会导致泡菜的最终有机酸组成比例不稳定且含量不均匀[11]。此外，为了在较短的发酵时间内达到所需的总酸含量，以获得类似老母水风味的发酵蔬菜，制造商通常会在发酵前添加有机酸[1，12-13]。然而，目前关于有机酸的研究主要是泡菜发酵过程中含量的变化，对于不同有机酸添加对发酵萝卜泡菜整体品质的影响还鲜有研究。
本研究以未添加有机酸的发酵萝卜泡菜为对照，在老母水中添加0.089 mol/L（以0.8%乳酸换算）的不同有机酸（乳酸、乙酸、柠檬酸）发酵萝卜泡菜，在发酵起点（0 d）和终点（5 d）测定发酵萝卜泡菜的理化性质、色泽、质构、有机酸组成和挥发性风味物质，探讨不同有机酸的添加对泡菜发酵进程、品质和风味的影响，明确在添加和不添加有机酸发酵对泡菜品质的影响差异以及何种有机酸对发酵影响最佳，以期为泡菜产业的生产工艺优化提供理论参考，为解决短期发酵泡菜总酸含量低、风味品质不佳问题的解决提供思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜红皮萝卜：成都市锦江区某果蔬市场；老母水（盐度4%、总酸含量0.312%）：市售；氯化钠、盐酸：成都金山化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：广州和为医药科技有限公司；四硼酸钠、α-萘乙二胺二盐酸盐、乙酸锌、无水对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、亚铁氰化钾、乳酸、乙酸、柠檬酸：成都市科隆化学品有限公司；氢氧化钠标准溶液：上海阿拉丁生化科技有限公司。本研究所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SynergyTM HTX多功能酶标仪：美国博腾仪器有限公司；LRH-150培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；S210 SevenCompact pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；Metrohm 855全自动滴定仪：瑞士万通有限公司；TAXTPlusC质构仪：Stable Micro Systems；DS-100色差仪：杭州彩谱科技有限公司；1260Infinity高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、Intuvo9000-5977b气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：安捷伦科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 萝卜泡菜的制备
将新鲜的红皮萝卜洗净、晾干、切成1 cm×1 cm×5 cm左右的条状后与老母水以质量比1∶2装入500 mL发酵瓶中。设置对照组（CK）：未添加有机酸；实验组：乳酸组、乙酸组和柠檬酸组分别在发酵前加入0.089 mol/L（以0.8%的乳酸含量换算）的乳酸、乙酸和柠檬酸。将制备好的萝卜放置于25 ℃条件下发酵5 d得到萝卜泡菜，并在发酵起点（0 d）和终点（5 d）取萝卜样品进行检测分析。
1.3.2 理化指标分析检测
称取各组样品各10 g于100 mL容量瓶中，加入40 mL蒸馏水，在功率100 W、频率40 Hz条件下超声20 min，蒸馏水定容，过滤。取滤液，采用电位法测定pH值[8]；采用酸、碱中和滴定法测定总酸含量[8]；采用DNS法测定还原糖含量[8]；根据GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》采用分光光度法测定亚硝酸盐含量。
1.3.3 有机酸的测定
取0.5 mL样品滤液，使用0.22 μm水溶性过滤器过滤于进样瓶中，采用HPLC检测有机酸组成[14]。
1.3.4 色泽测定
将萝卜样品切片，采用色度仪（经标准白板校正）对各组萝卜样品相同部位的颜色参数L*值（亮度）、a*值（红色/绿色值）、b*值（黄色/蓝色值）值进行测定[15]，每个样品测6次并取其平均值。
1.3.5 质构分析
取样品，将萝卜切成1 cm3的小方块，采用TAXTPlus质构仪（经1 kg标准砝码校正）对各组萝卜相同部位的硬度、脆度及咀嚼性进行测定[16]，每个样品测12次并取平均值。
1.3.6 挥发性风味物质分析[14]
样品前处理及顶空固相微萃取条件：取5 g样品于20 mL的顶空进样瓶中，加入1.5 g NaCl，50 ℃振摇加热20 min，新萃取头需经270 ℃老化5 min，然后插入顶空瓶吸附30 min，随后在气相色谱进样口250 ℃条件下解吸5 min。
气相色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm），升温程序为柱温50 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min的速度升至150 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至220 ℃并保持2 min。载气为高纯氦气（He），流速1 mL/min，不分流进样。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度250 ℃，电子能量70 eV，质量扫描范围为35～550 m/z。
定性、定量：测定结果在美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2001标准谱库进行检索与比对，根据匹配度＞800进行定性，使用面积归一化法进行相对定量。
1.3.7 数据处理与分析
采用SPSS20.0软件处理数据并进行方差分析，使用GraphPad Prism 9.0.0软件绘图，采用SIMCA14.1软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）和层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。
2 结果与分析
2.1 不同有机酸添加对萝卜泡菜发酵进程的影响
2.1.1 不同有机酸添加对萝卜泡菜还原糖含量的影响
还原糖作为发酵蔬菜中微生物的碳源之一，可以有效反映发酵的进程，因此，考察不同有机酸添加对萝卜泡菜还原糖含量的影响，结果见图1。由图1可知，发酵0 d时，不同组别中的还原糖含量无显著差异（P＞0.05）。发酵5 d时，CK组、乳酸组和柠檬酸组的还原糖含量几乎消耗殆尽，无显著差异（P＞0.05），而乙酸组还原糖含量为（0.91±0.18）g/100 g，且是CK组的12倍，与其余3组具有显著差异（P＜0.05）。乙酸的添加使得还原糖的消耗速度显著低于CK组以及另外的有机酸添加组，表明乙酸对萝卜泡菜体系中的微生物有抑制作用，进而减缓了发酵进程，而乳酸和柠檬酸与CK组相比对微生物的影响无差异。
图1 添加不同有机酸对萝卜泡菜还原糖含量的影响
Fig.1 Effect of adding different organic acids on the reducing sugar contents of radish Paocai
不同字母表示同一发酵时间不同处理组之间有显著差异（P＜0.05）。下同。
2.1.2 不同有机酸添加对萝卜泡菜pH和总酸含量的影响
pH及总酸含量反映了泡菜的发酵状态，因此，考察不同有机酸添加对萝卜泡菜pH和总酸含量的影响，结果见图2。pH值反映的是发酵环境中可电离酸的总和。由图2A可知，在发酵0 d时，不同有机酸处理组的pH存在显著差异（P＜0.05），且显著低于CK组（P＜0.05）。在发酵5 d时，乳酸组和柠檬酸组的pH值显著低于CK组和乙酸组（P＜0.05），且柠檬酸组显著更低（P＜0.05），这可能与柠檬酸（三元酸）的电离程度更高有关，而乳酸和乙酸均是一元酸。总体上，所有组别的pH在3.5左右，表明萝卜泡菜发酵成熟[17]。总酸反映的是可电离和不可电离酸的总和。由图2B可知，在发酵0 d时，不同组别的总酸含量无显著差异（P＞0.05），而发酵5 d时，不同组别的总酸含量差异显著（P＜0.05），且柠檬酸组、乙酸组、乳酸组、CK组总酸含量依次减少，分别为（2.31±0.05）g/100 g、（1.17±0.16）g/100 g、（0.76±0.08）g/100 g、（0.51±0.07）g/100 g。赵楠等[1，13]对老母水泡菜的总酸含量进行测定，结果发现，总酸含量在1.01～1.52g/100g。综上，添加有机酸发酵可提高萝卜泡菜中的总酸含量，因此通过添加有机酸发酵可在较短的发酵时间内达到所需总酸含量。
图2 添加不同有机酸对萝卜泡菜pH（A）和总酸含量（B）的影响
Fig.2 Effect of adding different organic acids on the pH (A) and total acid contents (B) of radish Paocai
2.2 不同有机酸添加对萝卜泡菜发酵品质的影响
2.2.1 不同有机酸添加对萝卜泡菜亚硝酸盐含量的影响
亚硝酸盐是评价泡菜食品安全性的重要指标之一[18]，因此，考察不同有机酸添加对萝卜泡菜亚硝酸盐含量的影响，结果见图3。
图3 添加不同有机酸对萝卜泡菜亚硝酸盐含量的影响
Fig.3 Effect of adding different organic acids on nitrite contents in radish Paocai
由图3可知，发酵0 d的新鲜萝卜亚硝酸含量较低，不同组中亚硝酸含量无显著差异（P＞0.05），且均＜0.2 mg/kg，发酵5 d时，不同组萝卜泡菜的亚硝酸盐含量均升高，但均远低于GB 2762—2017《食品中污染物限量》中规定的最高允许限量（20 mg/kg），且有机酸处理组均显著低于CK组（P＜0.05）。发酵过程中亚硝酸盐含量升高可能是由于随着发酵的进行，新鲜蔬菜中的硝酸盐在乳酸菌等微生物的作用下分解为亚硝酸盐[19]。结果表明，有机酸的加入有利于亚硝酸盐的分解，该结果与徐柯等[20-21]的研究结果一致。
2.2.2 不同有机酸添加对萝卜泡菜色泽的影响
由表1可知，发酵前后不同组别L*值、a*值和b*值差异显著（P＜0.05）；L*值、b*值显著下降（P＜0.05），a*值显著升高（P＜0.05），即亮度和黄度下降，红度升高[22]，这可能与萝卜本身所带的外皮红色随着发酵溶解到发酵体系中有关。发酵5 d时，不同组别的L*值和a*值无显著差异（P＞0.05），有机酸处理组与CK组相比，a*值偏高。而b*值有差异，相较于CK组，乳酸组和乙酸组b*值显著升高（P＜0.05）。综上，乳酸、乙酸处理后延缓了发酵萝卜泡菜黄色变浅。
表1 添加不同有机酸对萝卜泡菜颜色参数的影响
Table 1 Effect of adding organic acids on color parameters of radish Paocai
注：同行不同大写字母表示同一组别发酵不同时间存在显著差异，同列不同小写字母表示某一指标在不同组别中存在显著差异（P＜0.05）。
颜色参数 组别 0 d 5 d L*值a*值b*值CK乳酸乙酸柠檬酸CK乳酸乙酸柠檬酸CK乳酸乙酸柠檬97.90±0.08Aa 97.90±0.08Aa 97.90±0.08Aa 97.90±0.08Aa-60.39±0.75Ba-60.39±0.75Ba-60.39±0.75Ba-60.39±0.75Ba 17.60±0.13Aa 17.60±0.13Aa 17.60±0.13Aa 17.60±0.13Aa 57.28±1.49Ba 58.18±1.24Ba 58.43±1.86Ba 58.30±0.30Ba 9.76±0.98Aa 11.31±0.88Aa 12.11±1.42Aa 11.28±0.55Aa 4.80±0.13Bb 5.18±0.37Ba 5.72±0.26Ba 4.73±0.14Bb
2.2.3 不同有机酸添加对萝卜泡菜质构的影响
萝卜泡菜的质构是影响消费者接受度的重要指标之一，在质构剖面分析中，硬度、脆度和咀嚼性是评价萝卜泡菜质构的主要指标[16]。因此，考察不同有机酸处理对萝卜泡菜硬度、脆度及咀嚼性的影响，结果见图4。由图4可知，新鲜萝卜经发酵后硬度、脆度和咀嚼性均明显下降，表明萝卜发酵过程中组织逐渐软化。在硬度方面，发酵5 d时，与CK组相比，有机酸组处理组的硬度均下降，其中，柠檬酸组硬度显著下降23.5%（P＜0.05），而乳酸组和乙酸组分别下降9.1%和16.4%（P＞0.05），表明有机酸的添加会促进萝卜硬度的下降，尤其柠檬酸最为显著，可能和有机酸促进了果胶的分解有关[23]。在脆度方面，发酵5 d时，乙酸组的脆度最高，且显著高于CK组和柠檬酸组（P＜0.05），甚至比柠檬酸组高37.2%，表明相比于CK组，乙酸、乳酸的添加均能延缓萝卜泡菜脆度下降，而柠檬酸的效果却相反。在咀嚼性方面，相较于发酵前的新鲜萝卜，CK组咀嚼性下降28.5%，而乳酸、乙酸和柠檬酸组依次下降43.5%、54.7%和62.2%，表明有机酸的添加在发酵中促使萝卜组织软化。综上，相较于CK组和柠檬酸组，乳酸、乙酸的添加能延缓萝卜泡菜脆度降低的效果，换言之乳酸或乙酸有助于泡菜保脆，这可能是由于有机酸对萝卜的果胶影响程度不同，使得蔬菜的脆度变化不一致；也可能是蔬菜中的钙离子和乳酸反应生成乳酸钙形成了保脆的效果，谢霞等[24]的研究结果也表明，乳酸钙对发酵蔬菜的保脆效果最佳。
图4 添加不同有机酸对萝卜泡菜硬度（A）、脆度（B）和咀嚼性（C）的影响
Fig.4 Effect of adding different organic acids on the hardness (A),brittleness (B), and chewiness (C) of radish Paocai
2.3 不同有机酸添加对萝卜泡菜风味的影响
2.3.1 不同有机酸添加对萝卜泡菜有机酸组成的影响
有机酸作为泡菜中重要的味觉化合物，是泡菜酸味的重要提供者[9]。因此，考察不同有机酸添加对萝卜泡菜有机酸组成的影响，结果见图5。新鲜萝卜中的有机酸主要为乙酸、琥珀酸、苹果酸和柠檬酸[25]。由图5可知，在不添加有机酸的情况下，随着发酵的结束，CK组的有机酸主要为乳酸和乙酸，乳酸含量是乙酸的31倍，其主要由糖酵解和磷酸乙酮醇酶途径产生[26]。不同种类的有机酸赋予泡菜不同的酸感，乙酸酸感刺激，乳酸酸感柔和，有研究显示两者的比例赋予产品不同的酸味体验，高乳酸比例酸味柔和，反之则不仅具有刺激性更强的酸感，甚至会产生腐臭类的酸感[23]。有机酸添加组在发酵5 d时均体现出不同的有机酸组成，对于乳酸组，除了乳酸和乙酸还有新鲜萝卜中的琥珀酸和苹果酸，苹果酸呈现浓郁爽口的口感；对于乙酸组，仅检出乳酸和乙酸，且两者的比例为7∶5，高含量的乙酸给泡菜带来刺激的酸感；对于柠檬酸组，柠檬酸含量占比为81.5%，而乳酸、苹果酸和乙酸总含量占比仅为18.5%，柠檬酸呈现强烈的酸感。综上，添加不同的有机酸对发酵泡菜的风味口感差异较大，这可能和不同有机酸触发微生物的代谢通路有所差异有关[27]。
图5 添加不同有机酸对萝卜泡菜有机酸组成的影响
Fig.5 Effect of adding different organic acids on the organic acid composition of radish Paocai
2.3.2 不同有机酸添加对萝卜泡菜挥发性风味物质的影响
为了探究不同有机酸添加发酵对萝卜泡菜挥发性风味物质的影响，利用HS-SPME-GC-MS对不同组发酵5 d的萝卜泡菜样品的挥发性风味物质进行检测，结果共检出61种挥发性风味物质，包括8种酯类、8种醇类、6种酸类、9种醛酮类、5种含硫类化合物及25种其他类物质，基于此对不同组萝卜泡菜样品进行PCA、OPLS-DA、HCA，结果见图6。
图6 添加不同有机酸对萝卜泡菜挥发性风味物质的影响
Fig.6 Effect of adding different organic acids on volatile flavor components in radish Paocai
A：PCA得分图；B：OPLS-DA得分图；C：HCA结果；D：200次置换检验结果。
由图6A可知，PC1的方差贡献率为33.8%，PC2的方差贡献率为28.6%，前两个主成分的累计方差贡献率为62.4%，说明该模型可以解释原变量信息中的大部分信息[28]。不同组别分布于PCA模型不同的象限，但乳酸组和柠檬酸组接近，说明与CK组相比，不同有机酸处理发酵对萝卜泡菜挥发性风味物质有影响，且不同有机酸处理导致的挥发性风味也有差异，其中，乳酸组和柠檬酸组更相似，而乙酸组不同于这两组。这可能和乙酸的极易挥发性有关，导致乙酸组检测到的挥发性风味成分主要为乙酸，区别于其他组别。
由图6B可知，该模型的自变量拟合指数R2X为0.853、因变量拟合指数R2Y为0.982、预测能力Q2为0.96，表明该模型稳定可靠[29]。由图6D可知，该模型经过200次置换检验，Q2的回归线与Y轴的截距为负值，表明模型不存在过拟合现象[30-31]。OPLS-DA、HCA与PCA结果均相似，即组内差异较小，不同组别的样品分离清晰，而乳酸组和柠檬酸组距离更近。具体而言，异硫氰酸酯主要富集在CK组、乳酸组和柠檬酸组周围，异硫氰酸酯是硫苷的主要降解产物，在发酵十字花科蔬菜中常被检测到[32]。值得注意的是，苯甲醇、乙酸乙酯等芳香物质主要富集在柠檬酸组和乳酸组周围，表明选择性的添加有机酸，如柠檬酸或乳酸更有利于酯类挥发性风味物质的产生[23]。总体而言，不同的有机酸处理萝卜泡菜导致了挥发性物质含量以及成分的差异，影响了泡菜的最终感官品质。
3 结论
发酵5 d时，与CK组相比，乙酸组还原糖含量显著降低（P＜0.05），各有机酸组亚硝酸盐含量显著降低（P＜0.05）；乳酸组和乙酸组b*值显著升高（P＜0.05）；柠檬酸组硬度和咀嚼性显著降低（P＜0.05），乙酸组咀嚼性显著降低（P＜0.05），脆度显著升高（P＜0.05）；柠檬酸组总酸含量和有机酸组成变化较大，而乳酸组有机酸组成更为丰富；乳酸组和柠檬酸组挥发性风味物质更相似，更有利于酯类挥发性风味物质的产生。综上，有机酸的添加使得萝卜泡菜的发酵进程改变，降低了亚硝酸盐的含量，改善了色泽和质构，丰富了泡菜的有机酸结构，促进了酯类物质的生成。总体而言，乳酸的添加对萝卜泡菜的整体影响效果最佳。本研究结果有助于深入了解添加不同有机酸发酵对泡菜品质的影响，且为优化发酵策略和提高泡菜品质提供了重要的理论参考。同时，这些结果也有助于市场泡菜的质量稳定、批次品质统一，并促进泡菜产业的经济效益。此外，本研究为生产实际中加酸处理发酵提供了新思路，为解决短期发酵泡菜总酸低、滋味、风味品质不佳问题提供了理论参考。
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