Effect of pit space differences of sauce-flavor Baijiu production on the quality of the fourth-round base liquor
酱香型白酒具有“酱香突出，幽雅细腻，醇厚协调，回味悠长，空杯留香持久”的风味特点，而深受消费者青睐[1]。据《2023贵州省白酒产业发展报告》预计，2025年酱香型白酒市场规模将超过3 000亿元，市场占比将超过35%[2]。
酱香型白酒以高梁为主要原料，原料经高温蒸熟后混入糖化发酵剂高温大曲进行高温堆积，后进入窖池发酵，经历多轮次加料、蒸煮、取酒和储存，形成七个轮次基酒[3]。第一、二轮次酒酒体酸涩，呈现生粮香；第三、四、五轮次酒主要呈现酱香，带有花果香；第六、七轮次酒主要表现为焦糊香、糟香[4]。第三、四、五轮次基酒又称“大回酒”，占基酒总产量的55%，其中第四轮次基酒的出酒量在大回酒产量中的占比较高，能较好的反映大回酒阶段的典型特征[5]，且第四轮次基酒具有较好的酱香风格，酒体口感醇厚细腻[6]，是七个轮次中感官特征最为典型的一轮。此外，目前关于第四轮次酿造酒醅微生物的研究较多，如孙利林等[7-8]对第四轮次酒酿造过程中的细菌和真菌进行研究，揭示了四轮次酒酿造过程中微生物多样性；麻颖垚[9]利用宏基因组学对酱香型白酒第四轮次窖内发酵微生物代谢通路进行研究，阐释了微生物代谢与风味形成的关联。而对第四次基酒进行风味分析的研究较少。
窖池是酱香型白酒发酵的关键场所，其内部空间差异导致酒醅中物质组成和微生物环境不同[10]，微生物及其代谢差异导致了窖池上、中、下层酒醅所代谢的物质组成不同，进而形成了不同风格的基酒[11]。 窖池上层酒醅通常能产生酱香典型体基酒，具有酱香突出，无异杂味等特点；中层酒醅多获得醇甜典型体基酒，具有酱香明显、醇和回甜等特点；下层酒醅多形成窖底典型体基酒，具有窖香浓郁、口感醇和等特点[12-13]。 源于窖池不同空间位置的基酒风格特征存在明显差异，最后按一定比例勾调成酱香型成品白酒。 所以，对窖池各空间位置的基酒品质及其相互间的差异化合物进行解析，有助于更好地了解窖池空间差异环境下的微生物、酒醅理化差异对基酒品质的影响。
本研究利用气相色谱-氢火焰离子化检测（gas chromatography-flame ionization detection，GC-FID）技术对酱香型第四轮次发酵获得的不同窖池位置（窖面、窖中、窖底）基酒中的挥发性风味骨架成分进行检测，结合正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）鉴定出基酒间的差异化合物。并进一步结合香气活性值（odor activity value，OAV）和Spearman相关性分析，评估各差异化合物对基酒的风味贡献程度，及其与香气特征之间的相互关系。 这对研究窖池不同空间位置对酒醅所产基酒风味的影响和理解酱香型基酒的风味形成机理具有重要意义。
第四轮次发酵基酒（采集窖池上层、中层和下层酒醅蒸馏所获得的窖面（JM）酒，窖中（JZ）酒和窖底（JD）基酒）：贵州仁怀酱香型白酒核心产区某大型酒厂。
乳酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯，叔戊醇（内标1）、乙酸正戊酯（内标2）、2-乙基丁酸（内标3）等32种标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正丙醇、正丁醇、1,2-丙二醇、乙酸异戊酯、乙酸丙酯、正癸酸、正己醛、正己醇、异戊酸乙酯、无水硫酸钠：上海麦克林生化科技有限公司；丙酸、丙酮、乙缩醛、异戊醛等15种标准品：梯希爱化成工业发展有限公司。标准品均为色谱纯且纯度≥98.0%。
7890A型气相色谱仪（配备氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID））、DB-FATWAX G3903-63008 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：安捷伦科技（中国）有限公司。
1.3.1 感官评价
由9位（5名男性和4名女性）经验丰富的、具有品酒师资格的专家感官评价小组对基酒进行感官评价。 依据GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》、T/GZRHJX 007—2019《仁怀产区大曲酱香酒生产技术规范》，对基酒的酱香、曲香、陈香、窖香、果香、粮香、焦香和花香的香气特征及协调度、持久度、纯净度、柔和度和丰满度的口感特征进行描述。
1.3.2 内标配制
准确量取叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸各1 mL至容量瓶，用体积分数60%的乙醇溶液定容至100 mL，制备体积分数1%（V/V）的标准溶液，于4 ℃保存备用。
1.3.3 色谱条件
量取990 μL基酒，加10 μL混合内标，密封混匀；升温程序：初始温度30 ℃，保持2 min；以3 ℃/min升至180 ℃，再以15 ℃/min升至210 ℃，保持10 min；检测器温度为240 ℃；载气为氮气（99.999%），流速为1 mL/min；进样口温度为235 ℃，分流进样，分流比为30∶1。
1.3.4 定性、定量方法
在相同的色谱及分析条件下，比对待测物与标准品的保留时间，具有相同保留时间的物质定性为同一物质；以待测物与内标化合物的浓度之比作为横坐标，峰面积之比作为纵坐标，建立各待测物的标准曲线进行定量分析。
1.3.5 OAV计算
挥发性化合物的OAV计算公式如下：
式中：C代表挥发性化合物在样本中的质量浓度，μg/L；T代表该物质的气味阈值，μg/L。
1.3.6 统计与分析
采用SPSS 24.0进行方差分析（anaylsis of variance，ANOVA），P值＜0.05被认为具有统计学意义。通过R4.0.3软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA），通过SIMCA 14.0进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）分析，并通过变量重要性投影（variable importance projection，VIP）值＞1鉴定样品间的差异化合物。 采用Origin 2021绘制感官雷达图、柱状图和相关性分析热图。
由图1a可见，在香气维度，3种基酒在花香、果香、粮香、窖香、陈香上表现出极显著的差异（P＜0.01）。 从香气整体风味来看，JM基酒与JZ基酒相似，二者与JD 基酒则差异明显。JD基酒的陈香、窖香最高（P＜0.01），其酱香、曲香、焦香得分也最高但不具有显著性（P＞0.05），可能与其独特的制作工艺有关，窖底糟醅制作时需加入曲粉、尾酒、窖底水，在漫长的窖底糟醅堆积过程中，微生物持续代谢，各类风味物质不断积累、转化，最终形成以窖香为主，酱香、曲香也较为突出的JD基酒。由图1b可见，口感方面，仅持久度存在极显著差异（P＜0.01）。从口感整体来看，JD基酒最为丰满持久，与另两种基酒也具有较大差异。
图1 3种不同窖池位置酒醅所产基酒的香气（a）和口感（b）感官评价雷达图
Fig.1 Sensory evaluation radar chart of aroma (a) and taste (b) of base liquor produced from fermented grains in 3 different pit locations
3种不同窖池位置基酒挥发性风味成分的定性定量分析结果见表1。 由表1可知，应用GC-FID在3种基酒中共鉴定出56种挥发性风味成分，包括21种酯类、14种醇类、9种酸类、7种醛、3种酮类和2种含氮化合物。 3种基酒中酯类含量最高，其次是酸类、醇类、醛类、酮类和含氮化合物，其中醇类、醛类和酮类含量在3种基酒中具有显著差异（P＜0.05）。
表1 3种不同窖池位置酒醅所产基酒挥发性风味成分GC-FID分析结果
Table 1 Results of GC-FID analysis of volatile flavor components of base liquor produced from fermented grains in three different pit locations
序号 类别 化合物 CAS号123456789 1 0酯类11 12 13 14 15 16 17 18甲酸乙酯乙酸乙酯丁酸乙酯异戊酸乙酯乙酸异戊酯戊酸乙酯己酸乙酯庚酸乙酯乳酸乙酯己酸丁酯辛酸乙酯壬酸乙酯癸酸乙酯丁二酸二乙酯苯乙酸乙酯乙酸苯乙酯月桂酸乙酯十四酸乙酯109-94-4 141-78-6 105-54-5 108-64-5 123-92-2 539-82-2 123-66-0 106-36-9 97-64-3 626-82-4 106-32-1 123-29-5 110-38-3 123-25-1 101-97-3 103-45-7 106-33-2 124-06-1 JM 75.79±2.29b 2 159.68±87.79a 28.96±0.99b 11.72±0.99b 5.12±2.26a 2.98±0.47b 14.57±0.53b 2.05±0.21b 2 223.79±674.13a 3.45±0.36b 2.68±0.75b 3.98±0.19b 42.85±1.55b 64.27±86.27a 5.90±0.55b 37.71±51.66a 142.29±92.91a 2.52±1.80a含量/（mg·L-1）JZ JD 72.60±3.41b 2 101.19±80.41a 26.58±0.60b 9.86±0.16b 3.39±0.03a 2.58±0.12b 14.12±0.77b 1.60±0.41b 1 643.49±68.11a 3.68±0.46b 1.85±0.04b 3.74±0.27b 48.19±8.81b 2.71±0.24a 5.31±0.36b 1.25±0.39b 61.06±16.37a 1.12±0.17a 84.93±4.87a 1 780.44±104.27b 264.79±14.75a 17.56±1.01a 4.20±0.43a 57.93±2.99a 508.07±28.02a 32.05±1.20a 1 528.19±78.68a 4.93±0.30a 9.48±0.45a 6.52±0.32a 96.79±2.82a 4.73±0.71a 8.33±0.73a 4.34±4.30b 35.45±9.76a 1.15±0.20a
续表
注：小写字母不同代表差异显著（P＜0.05）。下同。
序号 类别 化合物 CAS号19 20 21 628-97-7 111-62-6 544-35-4 22 23 24 25 26 27 28 29 30酸类64-19-7 79-09-4 79-31-2 107-92-6 503-74-2 109-52-4 142-62-1 142-62-1 142-07-2 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44醇类67-56-1 78-92-2 71-23-8 78-83-1 6032-29-7 71-36-3 1565-80-6 123-51-3 71-41-0 111-27-3 513-85-9 57-55-6 98-00-0 60-12-8 45 46 47 48 49 50 51醛类75-07-0 123-38-6 78-84-2 105-57-7 590-86-3 98-01-1 100-52-7 52 53 54酮类67-64-1 6032-29-7 513-86-0 55 56含氮类棕榈酸乙酯油酸乙酯亚油酸乙酯总含量乙酸丙酸异丁酸丁酸异戊酸戊酸己酸庚酸辛酸总含量甲醇2-丁醇正丙醇异丁醇2-戊醇正丁醇2-甲基丁醇3-甲基丁醇正戊醇正己醇2,3-丁二醇1,2-丙二醇糠醇β-苯乙醇总含量乙醛正丙醛异丁醛乙缩醛异戊醛糠醛苯甲醛总含量丙酮2-戊酮乙偶姻总含量三甲基吡嗪四甲基吡嗪总含量357927-50-5 1124-11-4 JM 78.76±68.58a 24.01±15.86a 35.50±37.29a 4 968.60±1127.42a 1 519.71±63.83a 10.80±0.97b 62.77±2.45a 27.99±9.53b 23.44±0.96ab 3.69±1.60b 31.96±5.26b 2.40±0.32b 249.25±52.81a 1 932.02±137.73a 136.13±6.70ab 12.26±0.51b 399.77±22.72b 183.57±8.51a 263.60±116.16a 88.17±6.01b 59.22±15.23a 400.43±42.68a 10.66±0.65b 15.41±4.64b 67.11±6.11b 57.55±19.25a 16.73±1.39a 18.52±0.89a 1 729.21±251.47b 426.7±21.21b 5.01±1.80a 8.84±0.40b 783.92±33.25ab 43.24±1.89b 111.28±6.26b 7.74±7.39a 1 386.73±72.43b 14.91±0.49b 5.00±2.43a 60.24±2.91b 80.14±5.83b 0.50±0.37a 2.52±0.31a 3.02±0.68a含量/（mg·L-1）JZ JD 24.08±0.54a 8.47±2.04a 7.05±0.30a 4 043.91±184.02a 1 465.89±39.58a 9.56±0.72b 65.07±1.98a 17.81±0.85b 20.90±0.75b 4.64±1.21b 16.48±1.40b 2.17±0.80b 176.26±30.50a 1 778.77±77.79a 122.62±5.21b 13.14±0.41b 359.42±12.48b 155.86±5.04b 259.36±11.69a 86.41±3.47b 46.26±4.42a 311.84±10.67b 9.52±0.20b 11.25±0.45b 56.58±2.64b 46.84±2.77a 12.19±0.52b 16.31±0.73a 1 507.60±60.70c 408.94±14.73b 2.36±0.30a 7.75±0.67b 716.45±27.01b 35.67±1.73c 95.75±3.07b 2.12±0.17a 1 269.03±47.69b 13.06±0.77b 5.49±3.31a 56.71±2.14b 75.26±6.22b 0.49±0.34a 1.86±0.32a 2.35±0.66a 28.41±4.15a 12.22±1.24a 9.96±1.16a 4 500.46±262.36a 1 206.72±104.03b 24.92±2.72a 38.65±3.76b 140.68±28.36a 30.45±5.65a 65.79±15.07a 199.66±30.18a 19.14±3.44a 70.79±10.67b 1 796.79±203.87a 144.07±6.50a 48.01±2.74a 714.27±37.88a 165.46±8.71ab 178.27±66.72a 212.78±11.72a 64.81±10.71a 453.34±12.43a 18.84±1.00a 28.69±1.66a 107.52±5.49a 94.91±43.55a 17.95±2.03a 17.96±1.36a 2 266.89±212.50a 527.41±31.64a 4.42±0.74a 10.88±0.78a 824.10±45.89a 76.09±3.65a 195.91±8.91a 6.49±0.43a 1 645.31±92.05a 22.69±1.34a 3.68±0.52a 131.55±6.98a 157.92±8.84a 1.08±0.08a 2.71±0.07a 3.79±0.14a
酯类化合物是白酒中最主要的一类挥发性成分。 乙酸乙酯在JM基酒和JZ基酒中含量较高，分别为（2 159.68±87.79）mg/L和（2 101.19±80.41）mg/L。 乙酸乙酯具有菠萝香等水果香，其产生与酿酒酵母、汉森菌、念珠菌和霉菌密切相关[14]。 JD基酒中己酸乙酯和丁酸乙酯含量较高，分别为（508.07±28.02）mg/L和（264.79±14.75）mg/L，它们有助于形成独特的窖香[13]。此外，异戊酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯等酯类在JD基酒中的含量也较高。
酸类物质可以起到缓冲作用，减少酒体辛辣和刺激感[15]。 JM基酒和JZ基酒中乙酸、辛酸和异丁酸含量高于JD基酒，JD基酒中己酸、丁酸等含量较高。酱香型白酒高温大曲的使用及高温发酵有利于乳酸菌和梭状芽胞杆菌属代谢，是产生大量的乳酸、丁酸和己酸等有机酸的主要原因之一[13，16]。
醇类有助于增加白酒的甜味[17]，多由谷物发酵的糖酵解途径产生。 JD基酒中醇类含量最高，其次是JM基酒，最后是JZ基酒。 其中2-丁醇、正丙醇、正丁醇、3-甲基丁醇、正戊醇、正己醇等在JD基酒中含量高，异丁醇、糠醇、3-甲基丁醇在JM基酒和JD基酒中含量高。 正丙醇和异丁醇是高级醇，在适量的情况下可以协调酒体香气[18]，但过量时会产生杂醇油味。 3-甲基丁醇贡献醇香和麦芽香，是白酒中重要的香气化合物之一[19]。
另外，酒体中的醛类物质一般与酒体的果香和青草香等清新香气有关[20]，和酮类一起对酒体起助香协调作用。本研究中醛酮类在JD基酒中含量高于JM基酒和JZ基酒，包括乙醛、异丁醛、异戊醛、丙酮、乙偶姻等。其中乙醛带有苹果香、梨香、甜香，乙缩醛具有清香味、果香，是基酒中含量较高的物质[21]。 乙偶姻是三种基酒中含量最高的酮类，与氨经非酶促反应生成四甲基吡嗪[22]，有助于增加焙烤香和坚果香[23]。
为筛选3种不同窖池位置基酒中差异化合物，基于挥发性风味成分含量对3种不同窖池位置酒醅所产基酒进行PCA、OPLS-DA分析，结果见图2。
图2 挥发性风味成分的主成分分析得分图（a）、正交偏最小二乘判别分析得分散点图（b）、200次置换检验结果（c）和变量重要性投影值（d）
Fig.2 Principal component analysis score plot (a), orthogonal partial least squares discriminant analysis scatter plot (b), 200 permutations test results (c) and variable importance projection values (d) of volatile flavor components
由图2a可知，第一主成分（principal component，PC1）的方差贡献率为60.32%，第二主成分（PC2）的方差贡献率为20.78%，累计方差贡献率为81.10%，说明该模型可代表原始变量反映综合特征，3种不同窖池位置酒醅基酒分布在图中不同位置，说明3种基酒可以明显区分。由图2b、图2c可知，OPLS-DA模型总方差贡献率为88.20%，R2=0.38、Q2=-0.431，说明模型不存在过拟合现象，模型可靠。OPLS-DA模型显示JM基酒位于第一、四象限，JZ基酒位于第一象限，JD基酒位于第二、三象限，说明3种基酒区分良好，3种基酒的挥发性成分具有较大差异。由图2d可知，根据变量重要性投影（VIP）值＞1及P＜0.05筛选出12种差异化合物，分别是己酸乙酯、正丙醇、乙酸乙酯、乙酸、丁酸乙酯、己酸、辛酸、正丁醇、丁酸、3-甲基丁醇、乙醛和糠醛。
借助OAV评估差异化合物对基酒的风味贡献度，结果见表2。
表2 差异化合物香气活度值及其香气特征描述
Table 2 Aroma activity values and aroma characteristics description of differential compounds
序号 化合物 阈值/（μg·L-1）[27] VIP 香气描述[27-28]JM OAV JZ JD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12己酸乙酯丁酸乙酯乙醛丁酸己酸正丁醇乙酸乙酯辛酸正丙醇乙酸糠醛3-甲基丁醇55.33 53 952.63 32 551.6 160 000 81.5 2 517.16 2 700 2 733.35 964 179 000 1 200 44 000 2.42 2.00 1.89 1.72 1.67 1.42 1.37 1.22 1.15 1.12 1.12 1.05 263.39b 355.34b 355.58b 29.04b 12.70b 32.26b 66.35a 92.31a 7.41b 9.50a 2.53b 2.24a 255.26b 326.09b 340.78b 18.47b 6.55b 31.61b 64.55a 65.28a 6.66b 9.16a 2.18b 1.74b 9 182.48a 3 248.92a 439.51a 145.93a 79.32a 77.85a 54.70b 26.22b 13.24a 7.54b 4.45a 2.53a水果香菠萝香苹果、梨香、甜香腐败的脂肪或油脂香蕉、成熟水果苹果香香蕉、苹果香脂肪或油味香蕉、水果醋酸焦糖、杏仁香蕉
在JD基酒中，己酸乙酯与丁酸乙酯的OAV分别达到9 182.48和3 248.92，说明其对JD基酒窖香的贡献极大。其次，乙醛、丁酸、己酸、正丁醇、正丙醇与糠醛OAV均＞1，且在JD基酒中的OAV也显著高于JM基酒与JZ基酒（P＜0.05）。研究表明，己酸乙酯与其他风味化合物一起，有助于增加香气的浓郁度[24]，这可能是JD基酒香气最为复杂和浓郁的原因。而乙酸乙酯、乙酸和辛酸在JM和JZ基酒中的OAV显著高于JD基酒（P＜0.05），因此JM基酒和JZ基酒具有更为显著的花果香。 整体来看，差异化合物风味贡献程度差异解释了JM基酒与JZ基酒香气轮廓相似，而与JD基酒差异显著的原因。 进一步通过Spearman系数评估差异化合物与香气特征之间的相关性，结果见图3。
图3 差异化合物与香气特征的相关性分析
Fig.3 Correlation analysis between differential compounds and aroma characteristics
“**”表示在0.01水平相关性显著；“*”表示在0.05水平相关性显著。
由图3可知，乙酸、辛酸、乙酸乙酯与花香和果香呈显著、极显著正相关（P＜0.05，P＜0.01），而与窖香、酱香则呈显著或极显著负相关（P＜0.05，P＜0.01）。刘欣欣等[25]的研究也得出了类似的结论，乙酸和乙酸乙酯是白酒的重要风味因子，乙酸能够促进果香的释放，而乙酸乙酯有助于增强花香和减弱窖香的表达。 此外，糠醛、丁酸、己酸等与曲香呈极显著正相关（P＜0.01），而与粮香呈极显著负相关（P＜0.01），这一定程度说明了这些成分对三种基酒突出的香气特征具有重要贡献。余小斌等[15]的研究进一步证实了糠醛与酱香、曲香之间的正相关关系。此外，王丽等[26]通过添加实验证明了正丁醇与曲香之间的紧密相关性，刘欣欣等[25]的Logistic回归模型分析发现，降低正丁醇的含量会导致粮香的增强。
基酒风味组成受到窖池、发酵工艺和环境等多方面因素的影响，为了探究窖池不同空间位置的酒醅所产基酒的风味差异，本研究借助GC-FID检测技术和统计学分析发现酱香型白酒第四轮次JM、JZ、JD基酒中存在己酸乙酯、正丙醇、乙酸乙酯、乙酸等12种差异化合物，其中己酸乙酯和丁酸乙酯在JD基酒中风味贡献极其显著。乙酸、辛酸、乙酸乙酯与花香和果香呈显著、极显著正相关（P＜0.05，P＜0.01），而与窖香、酱香则呈显著或极显著负相关（P＜0.05，P＜0.01）；糠醛、丁酸、己酸等与曲香呈极显著正相关（P＜0.01），而与粮香呈极显著负相关（P＜0.01）。 本研究通过探究窖池空间差异对基酒品质的影响，为基酒辨识、成品品质提升提供了依据，为进一步的基酒高质量生产提供控制的理论基础。
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