图1 酒糟中游离肽（a）及维生素E（b）对DPPH自由基的清除能力
Fig.1 DPPH scavenging capacities of free peptide in distiller's grains (a) and vitamin E (b)
Anti-oxidative stress mechanism of cyclic dipeptide in distiller's grains of strong-flavor Baijiu
白酒酒糟是酒醅在窖内发酵完后再经蒸馏出酒后残留的固态混合物，是白酒生产产量最大的副产物[1]。在浓香型白酒酿造过程中，原辅材料中的植物蛋白和糟醅中的微生物蛋白在多种酶系和微生物的作用下生成一些具有生物活性的小分子多肽。由于白酒采用传统甑桶蒸馏方式，除少部分多肽会随着蒸馏过程进入酒体外，大部分多肽类物质都留在了蒸馏后的酒糟中。据统计，每生产1 t的白酒，将伴随产生6～10倍量的酒糟[2]。 若能将酒糟中的小分子多肽提取应用到白酒中，将为产品风味与营养健康品质的提升带来新的开发思路。 目前，已有学者在浓香型白酒酒糟中分离鉴定出环肽和直链多肽[3-4]，但是未对其抗氧化活性等方面的功能进行系统的研究。
氧化应激是指机体氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，常表现为自由基的积累和炎症反应，导致细胞和组织损伤[5-6]。 长期的氧化应激会导致许多非传染性慢性疾病，如帕金森、动脉粥样硬化[7]、关节炎[8]、癌症[9]、非酒精性脂肪肝[10]等。自然界中有许多结构简单的小分子肽类化合物，包括环二肽（cyclodipeptides，CDPs）和直链二肽，是机体吸收蛋白质的主要形式之一[11-12]。与线性肽相比，环二肽的环状结构更稳定，除能参与调节机体多种生理功能外，还具有抗菌、消炎、降压、抗肿瘤等药理作用[13-14]。
高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）通过对化合物相对分子质量和二级碎片信息的分析，可快速识别各类化学成分，具有高分辨率、高灵敏度的特点，已被用于功能成分的快速解析[15-18]。网络药理学基于目标分子、生物功能和生物活性化合物生成复杂的相互作用网络，能够从系统的角度在分子水平上阐明复合药物的作用机制，是研究复合药物的一种整体策略，为生物活性化合物的发现、机理研究、质量控制等领域提供了新的视野[19]。分子对接是计算机辅助药物设计的一种方法，从分子水平阐明中药活性成分与靶点的相互作用及位置[20]。本研究首先通过测定酒糟的甲醇提取液中游离肽的含量及其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基的清除能力，确定其具有抗氧化作用；然后参照天然药物的分离提取方法，采取硅胶柱层析法分离纯化酒糟中的环肽化合物，通过HPLC-Q-TOF-MS鉴别其中的环肽成分； 利用OMIM及GeneCards等数据库筛选氧化应激相关疾病靶点，构建酒糟-环二肽-靶点网络，预测关键作用靶点及机制，并结合分子对接探索小分子与蛋白之间的相互作用，以期从分子水平上阐明其抗氧化活性的潜在作用机制，为研究白酒的生物活性提供依据，同时对于酒糟的深度加工综合利用也具有重要意义。
酒糟：某浓香型白酒公司；双缩脲蛋白含量检测试剂盒、DPPH自由基清除能力检测试剂盒：北京盒子生工科技有限公司；甲醇（色谱纯）：德国默克股份两合有限公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1290系列高效液相色谱仪、6520B系列质谱仪、Agilent Mass Hunter数据采集工作软件、定性定量分析软件：美国Agilent公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；EVOlutIon300紫外可见分光光度计：美国Thermo Fisher有限公司；Milli-Q纯水制备仪：美国Millipore公司；5810R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司。
1.3.1 酒糟中游离肽的提取及含量的测定
游离肽的提取[21]：称取20.00 g酒糟，按料液比1∶3（g∶mL）加入甲醇，超声（超声温度20 ℃、功率300 W）萃取30 min，4 500 r/min、4 ℃条件下离心10 min，以除去不溶性的蛋白质和多糖等大分子物质，取上清液1 mL，用等体积的去离子水稀释一倍，过滤后得到滤液。
游离肽含量的测定：采用双缩脲蛋白含量检测试剂盒说明书测定滤液中的多肽含量，结果以酒糟干基计。 以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的质量浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线的回归方程为Y=0.050 6X+0.001 5（相关系数R2=0.999 4）。
1.3.2 酒糟游离肽体外抗氧化活性的测定
以维生素E（vitamin E，VE）为对照，参照DPPH自由基清除能力检测试剂盒说明书测定滤液对DPPH自由基清的清除能力。
1.3.3 酒糟中游离肽的提取、分离纯化及鉴定[21]
称取酒糟1 000.00 g于5 L的不锈钢桶中，加入3 L的甲醇超声（超声温度20 ℃、功率300 W）萃取30 min，过滤，反复超声、过滤两次，合并滤液，于60 ℃旋转蒸发浓缩，得到约0.6 L萃取浓缩液A。在萃取浓缩液A中加入0.6 L石油醚进行萃取，反复萃取两次，得萃取余液B。最后，在萃取余液B中加入1 L乙酸乙酯进行萃取，反复萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液C，于60 ℃旋转蒸发浓缩，得到多肽粗提物。
将粗提物与等量正相硅胶（100～200目）搅拌均匀，装入以200～300目正向硅胶填充的硅胶柱中，对环肽粗提物进行正相柱层析。以乙酸乙酯-正丁醇体系为洗脱液，依次按体积比100∶0、80∶1、50∶1、20∶1进行梯度洗脱，以每管40 mL收集洗脱液，采用HPLC-Q-TOF-MS检测洗脱液，根据分析结果合并相似项，分别于60 ℃旋转蒸发浓缩，得到30个组分，编号分别为Y1～Y30。采用HPLC-Q-TOF-MS方法对分离组分中的环肽化合物进行检测鉴定。
1.3.4 网络药理学研究
环二肽抗氧化应激核心作用靶点的筛选：将鉴定出的环二肽在Swiss Target Prediction网站（http：//swisstar-getprediction.ch/）中绘制标准Smile格式后筛选出其对应的作用靶点，对环二肽进行网络药理学研究。以oxidative stress为关键词[20]，分别在OMIM（https：//www.omim.org/）及GeneCards数 据 库（https：//www.genecards.org/）中 进 行 检索，其中从GeneCards数据库中筛选出的靶点，其Score值的高低代表了与疾病相关程度的大小，根据中位数排序对筛选出的靶点进行二次筛选后获取适当数量相关性高的靶点，最后将两个数据库的结果取并集获得氧化应激有关的疾病靶点。将疾病的致病靶点与环二肽的作用靶点共同导入到Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中，绘制韦恩图，获取交集，筛选环二肽抗氧化应激的核心作用靶点。
蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析：将环二肽抗氧化应激的核心作用靶点输入String数据库（https：//string-db.org/），限定物种为人，将minimum required interaction score设置为0.400，对环二肽抗氧化应激的核心作用靶点进行PPI分析。 将分析结果导入Cytoscape3.9.1软件，选取degree值＞30的靶点构建PPI网络图。 进一步通过Cytoscape3.9.1软件中的CytoNCA插件对PPI网络的拓扑性质进行分析，分别以Betweenness（BC）、Closenes（CC）、Degree（DC）3种方法分别筛选出PPI网络中前10个主要靶点，取交集获得关键核心作用靶点。
基因本体（gene ontology，GO）功能和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析：使用环二肽的核心作用靶点在DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）中进行基因GO和KEGG富集分析。
1.3.5 分子对接
从PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）获得靶点蛋白的3D结构，将其3D结构导入AutoDock1.5.7软件，去水，加全氢，计算电荷，并设置为受体；采用ChemDraw21.0.0.28软件得到环二肽的3D结构，将其3D结构导入AutoDock1.5.7软件，加全氢，计算电荷，设置为配体，检查扭转键，选择扭转键。设置对接盒子，挑选最低结合能的结合方式，并采用PyMOL 2.6软件将对接结果可视化。
1.3.6 数据处理
采用Excel2010进行数据分析，Origin 2018进行图表绘制。
白酒酒糟中含有大量微生物分解粮食蛋白形成的多肽类化合物，经测定，酒糟中游离肽的含量为30.20 mg/g。DPPH自由基清除率被广泛应用于研究物质的体外抗氧化活性[22]。 因此，以VE为对照，测定酒糟滤液中游离肽对DPPH自由基的清除率，结果见图1。由图1可知，随着游离肽质量浓度的增加，DPPH自由基的清除率也随之增加，当游离肽质量浓度达到4.96 mg/mL时，DPPH自由基清除率趋于平衡，其对DPPH自由基的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值为2.30 mg/mL，远低于VE（0.09 mg/mL），说明酒糟中含有的游离肽具有一定体外抗氧化活性，但活性低于VE。
图1 酒糟中游离肽（a）及维生素E（b）对DPPH自由基的清除能力
Fig.1 DPPH scavenging capacities of free peptide in distiller's grains (a) and vitamin E (b)
酒糟游离肽中环肽化合物的分离及鉴定结果见表1。由表1可知，从酒糟中共分离鉴定得到19个环肽类化合物，分别为10个环二肽：Cyclo（Pro-Val）、Cyclo（Pro-Phe）、Cyclo（Ala-Leu）、Cyclo（Ala-Pro）、Cyclo（Ala-Val）、Cyclo（Val-Tyr）、Cyclo（Leu-Tyr）、Cyclo（Pro-Pro）、Cyclo（Pro-Thr）和Cyclo（Pro-Ser），2个环三肽：Cyclo（Leu-Glu-Leu）和Cyclo（Glu-Leu-GABA），7个环二肽乙酯及环三肽乙酯：Cyclo（Glu-Leu）-Ethyl、Cyclo（Glu-Phe）-Ethyl、Cyclo（Glu-Pro）-Ethyl、Cyclo（Glu-Tyr）-Ethyl、Cyclo（Glu-Ala）-Ethyl、Cyclo（Glu-Leu-Val）-Ethyl、Cyclo（Glu-Leu-Leu）-Ethyl。鉴定出的环二肽种类与文献[23]报道的黄水中环二肽种类的结果基本一致，这是由于黄水是固态白酒发酵过程中酒糟的浸出液，具有酒糟中的相似成分。同时酒糟发酵过程是处于一定浓度的乙醇体系中，易与谷氨酸（酸性氨基酸）中的羧基作用形成酯类，因而从酒糟中分离鉴定出7个含有谷氨酸的环肽乙酯类化合物。已有研究发现，环二肽多是由细菌、真菌和动物蛋白质代谢的次级功能代谢物或副产物[24]，具有抗菌、消炎、抗肿瘤等生物活性。 LI J等[25]从植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）CCFM8724中分离鉴定出环二肽：Cyclo（Leu-Pro）、Cyclo（Phe-Pro），并发现Cyclo（Leu-Pro）具有抗生物膜活性；王艾晶等[26]从洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）CF-66发酵液中分离得到的环二肽Cyclo（Pro-Phe）对真菌类病原菌具有强烈的抑制作用；李虹[27]研究了环苯丙氨酸-脯氨酸（Cyclo（L-Phe-L-Pro），cFP）对生物膜早期形成能力及胞外聚合物的影响，发现cFP对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物膜的最小生物膜抑制质量浓度和最小生物膜清除浓度分别为6.0 mg/mL和12.0 mg/mL。此外，从海洋放线菌代谢产物中发现的Cyclo（Leu-Ala）、Cyclo（Pro-Val）、Cyclo（Pro-Tyr）、Cyclo（Pro-Phe）和Cyclo（L-Pro-L-Leu）等环二肽具有较弱的抗肿瘤活性[28-29]。
表1 酒糟游离肽中环肽化合物的鉴定结果
Table 1 Identification results of cyclic peptide compounds in free peptide of distiller's grains
序号 质荷比 分子式 二级碎片离子（m/z） 化合物1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 197.128 7 245.128 8 185.127 5 169.097 3 171.112 8 263.138 4 277.154 6 195.113 1 199.108 4 185.093 9 356.218 2 328.186 9 271.164 0 305.149 2 255.134 6 321.145 3 229.118 9 370.232 9 384.249 3 C10H16N2O2 C14H16N2O2 C9H16N2O2 C8H12N2O2 C8H14N2O2 C14H18N2O3 C15H20N2O3 C10H14N2O2 C9H14N2O3 C8H12N2O3 C17H29N3O5 C15H25N3O5 C13H22N2O4 C16H20N2O4 C12H18N2O4 C16H20N2O5 C10H16N2O4 C18H31N3O5 C19H33N3O5 70.066 0，72.081 6 70.066 1，120.081 0 86.097 0，44.048 6 70.065 9，72.044 9 72.081 2，44.052 7 72.081 5，107.046 1，136.074 1 86.096 3，107.047 9，136.076 9 70.065 9，98.060 8 70.066 0，56.047 9，74.063 1，153.101 5 70.066 0，60.045 3 86.096 8，132.102 0，144.101 6 84.043 6，86.097 4，104.0698 86.096 2，84.044 1，160.129 0 120.080 5，194.116 6，84.046 6，231.112 0 70.066 6，84.043 8，144.099 7 136.072 1，84.046 3，247.108 7 84.046 1，44.049 2 72.080 0，86.096 1，160.132 9，84.041 4 84.043 5，86.097 8，160.132 8，197.126 9 Cyclo（Pro-Val）Cyclo（Pro-Phe）Cyclo（Ala-Leu）Cyclo（Ala-Pro）Cyclo（Ala-Val）Cyclo（Val-Tyr）Cyclo（Leu-Tyr）Cyclo（Pro-Pro）Cyclo（Pro-Thr）Cyclo（Pro-Ser）Cyclo（Leu-Glu-Leu）Cyclo（Glu-Leu-GABA）Cyclo（Glu-Leu）-Ethyl Cyclo（Glu-Phe）-Ethyl Cyclo（Glu-Pro）-Ethyl Cyclo（Glu-Tyr）-Ethyl Cyclo（Glu-Ala）-Ethyl Cyclo（Glu-Leu-Val）-Ethyl Cyclo（Glu-Leu-Leu）-Ethyl
2.3.1 环二肽抗氧化应激的核心靶点与PPI网络分析
10个环二肽中Cyclo（Pro-Thr）和Cyclo（Pro-Ser）没有作用于氧化应激的靶点出现，可能是由于这两个环二肽目前还未有相关研究收录，因此，对其他8种环二肽进行网络药理学研究，8种环二肽抗氧化应激的核心作用靶点及其PPI网络图见图2。
图2 环二肽抗氧化应激的核心作用靶点（A）及其PPI网络图（B）
Fig.2 Anti-oxidative stress core target (A) and PPI network diagram(B) of cyclic dipeptide
由图2A可知，使用Swiss Target Prediction网站获得环二肽抗氧化应激作用靶点共330个；以“oxidative stress”为关键词分别从GeneCards及OMIM两个数据库中检索氧化应激相关靶点，并将相关靶点合并去重后最终获得氧化应激相关靶点共7 190个。 将330个环二肽抗氧化应激作用靶点与7 190个氧化应激相关靶点绘制韦恩图，得到核心作用靶点274个，占环二肽化合物抗氧化应激作用靶点总数的83.03%，说明环二肽在氧化应激方面具有显著表现。
图2B中，节点代表靶点，边代表靶点间相互作用，每个节点根据degree值以不同大小呈现，degree值越大，节点面积越大，颜色越深。 通过PPI网络的拓扑性质分析，筛选出BC、CC、DC 3种算法的前10个抗氧化应激核心作用靶点，取交集获得8个关键核心作用靶点，分别是丝氨酸/苏氨酸激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、酪氨酸蛋白激酶SRC（sarcoma gene，SRC）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白细胞介素1β（interleukin 1 beta，IL1β）、胱天蛋白酶3（caspase 3，CASP3）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、信号转导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、基质金属肽酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP9）。 AKT1是AKT家族（AKT1、AKT2和AKT3）的三个成员之一，在调节细胞存活、胰岛素信号、血管生成和肿瘤形成中起关键作用[30-31]。 原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC在促进细胞增殖、存活、迁移等生长过程中具有着重要作用[32]。EGFR是一种跨膜糖蛋白，会通过各种机制异常激活，例如受体过度表达、突变、配体依赖性受体二聚化、配体非依赖性激活，并且与多种人类癌症的发生有关[33]。
2.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析
通过对274个核心作用靶点进行GO功能富集分析，共获得1 054条GO功能，包括714条生物过程（biological process，BP）、211条分子功能（molecular function，MF）和129条细胞组分（cellular component，CC）。 按P值由小到大排列，每部分前10个GO条目的富集情况见图3A。由图3A可知，BP部分主要富集在蛋白水解、细胞外基质分解、缺氧反应、胶原蛋白分解代谢过程及细胞增殖的正向调节等；MF部分主要富集在内肽酶活性、肽酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、蛋白质脱乙酰酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性及蛋白激酶结合等；CC部分主要富集在质膜、突触、细胞表面、膜筏、树突、突触后膜、突触前膜及神经元细胞体等。
图3 环二肽抗氧应激核心作用靶点基因本体论（A）和京都基因与基因组百科全书通路（B）富集分析
Fig.3 Gene ontology (A) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (B) enrichment analysis of anti-oxidative stress core target of cyclic dipeptides
通过对274个核心作用靶点进行KEGG通路富集分析，按P值由小到大排列，共得到149条KEGG条目，前20个KEGG条目的富集情况见图3B。由图3B可知，与酒糟中环二肽抗氧化应激作用密切相关的通路主要涉及神经活性配体-受体的相互作用通路、癌症通路、钙信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinaseprotein kinase B，PI3K-Akt）信号通路、细胞凋亡、前列腺癌通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体（advanced glycalion end products-receptor for advanced glyeation end products，AGE-RAGE）信号通路及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路等，说明酒糟中环二肽的抗氧化应激作用机制可能是一个多成分、多靶点和多通路的过程。其中神经活性配体-受体的相互作用通路与癌症的预后和免疫治疗反应相关[34]。PI3K-Akt信号通路具有调节细胞周期、蛋白质合成的作用，在癌症发病中PI3K-Akt信号通路通过多方面抑制细胞凋亡，促进细胞增殖、肿瘤转移及新生血管生成[35]。现代研究表明，针对前列腺癌靶向治疗中较为成熟且具有明显研究价值的途径之一是PI3K-Akt信号通路，该信号通路的异常活化与疾病的发展和转归有显著相关性，在机体细胞的生长、增殖、凋亡以及炎症反应、血管生成以及肿瘤的发生发展中都起到了重要的参与调节作用[36]。TNF信号通路是促发炎症的关键信号通路[37]，Ca2+信号通过靶向主要活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成位点（包括线粒体呼吸和NOX酶）来控制ROS水平[38]，ROS可通过AGE-RAGE信号通路间接导致核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）磷酸化并调控多种损伤反应相关基因的表达[39]。
为进一步从分子水平上探究环二肽抗氧化作用机制，以8个关键核心作用靶点：AKT1（PDB ID：6hhg）、SRC（PDB ID：4u5j）、EGFR（PDB ID：7u99）、IL1B（PDB ID：5r8f）、CASP3（PDB ID：1re1）、STAT3（PDB ID：6njs）、MMP9（PDB ID：1gkc）、PTGS2（PDB ID：5f1a）作为蛋白受体，以8个环二肽作为配体进行半柔性分子对接，结果见表2。由表2可知，除Cyclo（Val-Tyr）与MMP9的结合能为-4.9kcal/mol外，8个环二肽与8个关键核心作用靶点的结合能均＜-5 kcal/mol，说明酒糟中的环二肽与关键核心作用靶点间结合性较好。 其中，PTGS2与各环二肽的结合能都较小，在不同位点形成的氢键数也相对较多，如Cyclo（Ala-Leu）和Cyclo（Ala-Pro）能分别与PTGS2形成4个氢键。
表2 酒糟中环二肽和关键核心作用靶点的分子对接结果
Table 2 Molecular docking results of cyclic dipeptide and key core functional targets in distiller's grains
环二肽 靶点 结合能/（kcal·mol-1） 氢键数/个 环二肽 靶点 结合能/（kcal·mol-1） 氢键数/个Cyclo（Pro-Val）Cyclo（Pro-Phe）Cyclo（Ala-Leu）Cyclo（Ala-Pro）AKT1 SRC EGFR IL1B CASP3 STAT3 MMP9 PTGS2 AKT1 SRC EGFR IL1B CASP3 STAT3 MMP9 PTGS2 AKT1 SRC EGFR IL1B CASP3 STAT3 MMP9 PTGS2 AKT1 SRC EGFR IL1B CASP3 STAT3 MMP9 PTGS2-6.3-6.1-6.1-6.1-5.2-5.5-5.2-6.8-6.4-7.2-6.1-6.7-6.1-6.9-6.4-7.5-5.5-5.6-5.5-5.4-5.2-5.6-5.3-6.7-6.1-5.6-5.2-6.1-5.0-5.8-5.9-6.2 101212122010211141 2241431212412 Cyclo（Ala-Val）Cyclo（Val-Tyr）Cyclo（Leu-Tyr）Cyclo（Pro-Pro）AKT1 SRC EGFR IL1B CASP3 STAT3 MMP9 PTGS2 AKT1 SRC EGFR IL1B CASP3 STAT3 MMP9 PTGS2 AKT1 SRC EGFR IL1B CASP3 STAT3 MMP9 PTGS2 AKT1 SRC EGFR IL1B CASP3 STAT3 MMP9 PTGS2-5.2-5.4-5.2-5.3-5.0-5.1-4.9-6.0-6.6-7.6-7.2-6.3-6.4-6.5-6.5-7.8-6.1-5.6-5.8-6.4-6.4-6.2-5.9-8.0-6.0-6.1-6.1-5.6-5.7-5.8-5.5-7.2 22013132210124233112241420102002
进一步利用PyMOL 2.6软件将PTGS2与8个环二肽分子对接结果进行可视化处理，结果见图4。
图4 酒糟中环二肽与前列腺素内过氧化物合酶2分子对接构象图
Fig.4 Conformational diagram of docking between cyclic dipeptide and prostaglandin-endoperoxide synthase 2 in distiller's grains
由图4可知，8个环二肽与关键核心作用靶点PTGS2均可以形成氢键，其中，环肽酰亚胺基中的氧原子作为氢受体，酪氨酸侧链酚羟基、酰亚胺基中的氢原子作为氢供体参与氢键的形成，如Cyclo（Val-Tyr）和Cyclo（Leu-Tyr）酪氨酸侧链酚羟基中的氢原子作为氢供体分别与PTGS2中Val228、Asn537和Gln203、Thr212各形成2个氢键。
浓香型白酒酒糟中游离肽含量为30.20 mg/g，其对DPPH自由基的IC50值为2.30 mg/mL，具有一定的体外抗氧化活性。通过液液萃取、正相硅胶柱层析等分离技术，结合HPLC-Q-TOF-MS技术，从酒糟中共分离鉴定出19个环肽，包括10个环二肽、2个环三肽和7个环肽乙酯，并首次发现序列中有酸性氨基酸（谷氨酸）的小肽在酒糟中多以其乙酯化的结构存在。 基于网络药理学方法探究了其中8个环二肽在缓解氧化应激疾病方面的作用，获得274个与抗氧化应激作用相关的核心靶点，通过PPI分析得到8个关键核心靶点；通过GO和KEGG富集分析发现，8个环二肽与8个关键核心靶点通过多靶点、多途径的方式发挥抗氧化应激作用，主要涉及细胞凋亡、癌症、钙调节、炎症等生物学过程。 进一步利用分子对接模拟8个环二肽与8个关键核心靶点的作用机制发现，8个环二肽与8个关键靶点均能通过分子间作用力形成稳定的复合物，在抗氧化应激方面具有一定的研究价值。 本研究仅对于酒糟环二肽在抗氧化应激方面的作用机制进行了初步探讨，后续仍需进一步通过细胞或者小鼠试验对网络药理学中预测的结果进行验证，以期为酒糟环二肽的应用提供理论依据及数据参考。
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