Optimization of fermentation process of Panax quinquefolius and Lycium barbarum sweet fermented glutinous rice by response surface methodology and antioxidant activity
甜酒酿又称江米酒、米酒、糯米酒、甜米酒、酒酿儿，是我国的传统食品[1]。 甜酒酿主要是以糯米为原料，添加酒曲，利用酒曲中根霉和米曲霉等微生物将糊化后的淀粉糖化，将蛋白质水解成氨基酸，并通过糖酵解途径将糖转化成少量乙醇[2-3]。现代医学营养研究表明，米酒含有丰富低聚糖、多肽、有机酸、微量元素等保健成分，具有抗氧化、降血糖、降脂、降血压、提高免疫力、滋补益气、健脾开胃、改善肠道健康等保健功效[4-5]。
西洋参，也被称为花旗参，人参属，多年生草本。西洋参性寒，味甘微苦，具有补气养阴、清热生津之效[4]。西洋参的主要化学成分有皂苷类、多糖类、有机酸类等，具有抗肿瘤、抗氧化、降糖降血压、止吐以及保护神经、心脏等方面具有良好的功效[7-10]，2020年西洋参选入药食同源原料[11]。枸杞作为药食同源物质已有超过2 000年的食用历史，是第一批公布的可药食两用的物质之一[12]。枸杞子中具有多种活性成分，如枸杞多糖、黄酮类化合物、生物碱、枸杞色素、氨基酸类等[13-14]。 枸杞具有补益精气、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗视疲劳、抗肿瘤、调节肠道菌群等作用[15-18]。西洋参和枸杞两种药食同源物质，其营养和功能性得到了普遍认可，二者配伍不存在禁忌证，并可增强纳气之功，枸杞和西洋参配伍具有增强免疫、降血脂、常压耐缺氧和抗疲劳的等作用[19]。目前，以枸杞和西洋参为原料制作的饮品还较为少见，国内研究开发有枸杞黄芪黄精西洋参复合原浆饮料[20]，西洋参红茶复合饮料[21]，但将枸杞和西洋参为原料制作甜酒酿还鲜有相关报道。
为开发一种具有抗氧化、补气养阴、缓解疲劳等保健功能的甜酒酿饮品，本研究以西洋参、枸杞和糯米为原料，甜酒曲为糖化发酵剂，制备西洋参枸杞甜酒酿。以酒精度及感官评分为评价指标，通过单因素试验和响应面试验优化发酵工艺条件，并对其理化及微生物指标、总酚与总黄酮含量及抗氧化活性进行分析。以期为西洋参和枸杞药食同源资源的开发利用提供技术参考，同时也可以丰富甜酒酿种类并提升其营养价值和功能性，为保健型甜酒酿工业化生产提供技术依据。
1.1.1 材料
糯米：市售；西洋参：广东乐陶陶药业股份有限公司；枸杞：宁夏惠之友食品有限公司；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 试剂
氢氧化钠（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；95%乙醇、无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；酚酞（分析纯）、福林酚（生化试剂）：上海麦克林生化科技有限公司；芦丁（生化试剂）：上海源叶生物科技有限公司；硝酸铝（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；无水碳酸钠（分析纯）：郑州派尼化学试剂厂；亚硝酸钠（基准试剂）：天津市科密欧化学试剂有限公司；L（+）-抗坏血酸：（分析纯）：西陇科学股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS）：合肥巴斯夫生物科技有限公司。
C22-IH90电磁炉：浙江苏泊尔股份有限公司；JA2003A电子天平：上海精天电子仪器有限公司；TDL-50B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；GRP-9080型隔水式恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；SCDL1D00J4冰箱：黄石东贝制冷有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；KQ-250B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；多功能研磨机：河南新飞电器集团有限公司；LALIT酒精度计：青岛拓科仪器有限公司；UV-4802H型紫外可见分光光度计：优尼科（上海）仪器有限公司。
1.3.1 西洋参枸杞甜酒酿的制备工艺流程及操作要点
操作要点：
西洋参浸提液制备：取西洋参片，以料液比1∶30（g∶mL）在超声功率200 W，超声时间15 min，浸提温度80 ℃，浸提时间2 h的条件下，得到西洋参浸提液[22]，过滤备用。
枸杞浆制备：选择新鲜、优质、无虫害、无霉变的枸杞，用水冲洗至无明显浊水，以料液比1∶4（g∶mL）加水，在50 ℃浸泡60 min吸胀后破碎打浆，榨汁后80 ℃灭酶2 min，过滤，得到枸杞浆[23]。
糯米的处理：将糯米放入清水中淘洗，去除杂质。 将淘净的糯米置于清水中浸泡4 h，确保糯米充分吸水，吸水率为34%，放在蒸锅中，摊平，上汽后蒸煮40 min至糯米无硬芯。
拌曲搭窝：糯米蒸煮好后冷却至30 ℃，然后将5%西洋参浸提液和6%枸杞浆混合搅拌，再与0.8%甜酒曲一同添加到冷却后的糯米中，并搅拌均匀。 将糯米混合料液倒入发酵罐中，并用工具将表面轻轻压实，在糯米中央留孔，加盖密封发酵。
发酵：将发酵罐置于恒温发酵箱中，设置发酵温度30℃，发酵48 h[3]。
灭菌：将米酒灌装于玻璃罐中密封、杀菌（75℃、30min），冷却至室温[24]，即得西洋参枸杞甜酒酿成品。
1.3.2 西洋参枸杞甜酒酿发酵条件优化
单因素试验：以糯米质量为基准，设置基础条件为枸杞浆添加量6.0%，甜酒曲添加量0.8%，发酵时间48 h，发酵温度30 ℃，采用单因素轮换法，分别考察西洋参浸提液添加量（1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%）、枸杞浆添加量（4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%）、甜酒曲添加量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、发酵时间（40 h、44 h、48 h、52 h、56 h），对酒精度及感官评分的影响。
响应面试验设计：在单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken原理选择影响较显著的3个因素，以枸杞浆添加量（A）、甜酒曲添加量（B）、发酵时间（C）为自变量，感官评分（Y）为响应值，设计3因素3水平响应面试验优化发酵工艺条件，其响应面试验因素及水平见表1。
表1 甜酒酿发酵工艺优化响应面试验因素及水平
Table 1 Factor and levels of response surface tests for fermentation process optimization of sweet fermented glutinous rice
水平 A 枸杞浆添加量/% B 甜酒曲添加量/% C 发酵时间/h-1 0 1 6 8 1 0 0.8 1.0 1.2 44 48 52
1.3.3 感官评价
西洋参枸杞甜酒酿制作好后，邀请10名经过培训的感官评价人员，从外观、气味、滋味及组织状态4个方面对甜酒酿进行感官评定[3]，满分为100分，感官评分标准见表2。
表2 西洋参枸杞甜酒酿感官评分标准
Table 2 Sensory score standards of Panax quinquefolius and Lycium barbarum sweet fermented glutinous rice
项目 评分标准 感官评分/分外观（25分）呈橙黄色，轻微浑浊呈橙红色，稍浑浊呈红色，较浑浊15～25 8～14 0～7气味（25分）具有甜酒酿香味，具有西洋参枸杞淡淡的香味，无异味具有淡淡的甜酒酿香味，淡淡的西洋参和枸杞味道甜酒酿香气较淡，无西洋参枸杞香味或者西洋参枸杞味道过重15～25 8～14 0～7滋味（30分）组织状态（20分）糯米软硬适中，酸甜协调、适口糯米软硬适中，口感偏甜或偏酸糯米较硬或较软，苦涩或偏甜或偏酸糯米颗粒较饱满、完整糯米颗粒大部分完整，少量破碎糯米颗粒大部分不完整，破碎较多21～30 11～20 0～10 12～20 6～11 0～5
1.3.4 理化指标及微生物指标的测定
总酸的测定：参考GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》的酸碱指示剂滴定法[25]；可溶性固形物的测定：参考GB 12143—2008《饮料通用分析方法》的折光计法[26]；酒精度测定：参考GB 5009.225—2023《酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》的酒精计法[27]；菌落总数的测定：参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[28]；大肠菌群的测定：参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[29]。
1.3.5 总黄酮及总多酚含量测定
总黄酮的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法，并参考KOU X H等[30-31]方法测定。以芦丁质量浓度（x）为横坐标，以波长510 nm处的吸光度值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，获得标准曲线回归方程（y=0.025 3x+0.018 5，R2=0.999），计算总黄酮含量。
总多酚含量的测定采用福林酚法[32-33]，以没食子酸溶液质量浓度（x）为横坐标，以波长765 nm处的吸光度值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，获得标准曲线回归方程（y=0.428 9x+0.022 2，R2=0.991 7），计算总多酚含量。
1.3.6 抗氧化活性测定
DPPH自由基清除率测定：参照李湘利等[34]的方法，配制DPPH标准溶液，取5 mL西洋参枸杞甜酒酿3 000 r/min离心10 min后，取上清液2 mL与2 mL 0.01 mmol/L DPPH溶液混合均匀，避光静置30 min，以无水乙醇为对照，测定波长517 nm处的吸光度值（A1）。 取2 mL无水乙醇与2 mL 0.01 mmol/L DPPH溶液混合均匀，测定波长517 nm处的吸光度值（A2）。取2 mL上清液与2 mL无水乙醇混合均匀，测定波长517 nm处的吸光度值（A3）。以0.2 mg/mL 的维生素C（vitamin C，VC）溶液作对照，将西洋参枸杞甜酒酿与0.2 mg/mL的VC溶液分别稀释至样液体积分数分别为0.05 mL/mL、0.25 mL/mL、0.50 mL/mL、0.75 mL/mL、1.00 mL/mL，按下式计算DPPH自由基清除率，计算半抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）值[35]。
ABTS自由基清除率测定：参考闫世芳等[36]的方法，配制ABTS标准液，取5 mL西洋参枸杞甜酒酿3 000 r/min离心10 min，取上清液0.1 mL和3.9 mL ABTS标准液混合均匀，避光6 min，反应完成后，测定波长734 nm处吸光度值（A4）。取3.9 mL蒸馏水与0.1 mL样品液混合均匀，避光6 min，反应完成后，测定波长734 nm处吸光度值（A5）。0.1 mL蒸馏水与3.9 mL ABTS标准液混合均匀，避光6 min，反应完成后，测定波长734 nm处吸光度值（A6）。 以0.2 mg/mL的VC溶液作对照，甜酒酿待测样品制备同DPPH自由基测定中的方法，按下式计算ABTS自由基清除率，计算IC50值。
1.3.7 数据分析与处理
采用SPSS 21.0、Origin 2018、Design-Expert 8.0.6对数据进行分析处理。
2.1.1 西洋参浸提液添加量的确定
西洋参浸提液添加量对西洋参枸杞甜酒酿感官评分及酒精度的影响见图1。
图1 西洋参浸提液添加量对感官评分及酒精度的影响
Fig.1 Effect of the Panax quinquefolius extract addition on sensory score and alcohol content
小写字母不同代表差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，随着西洋参浸提液添加量在1%～9%范围内的增加，西洋参枸杞甜酒酿酒精度呈缓慢上升趋势。 西洋参浸提液添加量为1%～5%时，感官评分呈上升趋势；当西洋参浸提液添加量为5.0%时，感官评分达到最高值，为83.5分，此时，酒精度为1.13%vol；当西洋参浸提液添加量＞5.0%时，西洋参的滋味稍突出，风味不协调，导致感官评分下降。 因此，最佳西洋参浸提液添加量为5.0%。
2.1.2 枸杞浆添加量的确定
枸杞浆添加量对西洋参枸杞甜酒酿感官评分及酒精度的影响见图2。
图2 枸杞浆添加量对感官评分及酒精度的影响
Fig.2 Effect of Lycium barbarum pulp addition on sensory score and alcohol content
由图2可知，随着枸杞浆添加量在4%～12%范围内增加，西洋参枸杞甜酒酿酒精度整体呈上升趋势。 随着枸杞浆添加量在4%～12%范围内增加，感官评分呈上升趋势；当枸杞浆添加量为8%时，感官评分达到最高值，为86.5分，此时，酒精度为1.37%vol；当枸杞浆添加量＞8%时，口感偏甜，不协调[37]，导致感官评分下降。因此，最佳枸杞浆添加量为8%。
2.1.3 甜酒曲添加量的确定
甜酒曲添加量对西洋参枸杞甜酒酿感官评分及酒精度的影响见图3。
图3 甜酒曲添加量对感官评分及酒精度的影响
Fig.3 Effect of sweet Jiuqu addition on sensory score and alcohol content
由图3可知，随着甜酒曲添加量在0.6%～1.4%范围内的增加，酒精度呈上升趋势。随着甜酒曲添加量在0.6%～1.0%范围内的增加，感官评分逐渐增加；甜酒曲添加量为1.0%时，感官评分达到最高值（91.5分），此时酒精度为1.75%vol；当甜酒曲添加量＞1.0%时，感官评分下降。发酵反应过快，酒精度快速升高，从而过早抑制发酵菌活性[38]。因此，最佳甜酒曲添加量为1.0%。
2.1.4 发酵时间的确定
发酵时间对西洋参枸杞甜酒酿感官评分及酒精度的影响见图4。
图4 发酵时间对感官评分及酒精度的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on sensory score and alcohol content
由图4可知，随着发酵时间在40～56 h范围内的增加，西洋参枸杞甜酒酿酒精度逐渐上升。随着发酵时间在40～48 h范围内的增加，感官评分呈上升趋势；当发酵时间为48 h时，感官评分达最高值（92.0分），此时酒精度为1.80%vol；当发酵时间＞48 h，西洋参枸杞甜酒酿酒精味过重，导致感官评分下降。因此，最佳发酵时间为48 h。
2.2.1 响应面试验结果与方差分析
在单因素试验结果的基础上，选择对感官评分影响较大的3个因素枸杞浆添加量（A）、甜酒曲添加量（B）、发酵时间（C）为自变量，感官评分（Y）为响应值，设计3因素3水平响应面试验优化发酵工艺条件，发酵工艺优化响应面试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process optimization
试验号 A B C Y 感官评分/分1234567891 0-1 1-1 1-1 1-1-1-1 110000-0000-1-1 11-1-1 11 12 13 14 15 16 17 1000000000 11-1100000 1100000 85.8 80.4 85.6 79.2 85.9 78.5 82.4 84.2 83.4 79.8 80.7 85.7 93.0 94.8 92.4 93.3 94.1
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B****AC BC A2 B2 C2 41.12 28.01 1.262E-013 2.70 0.19 15.66 13.68 84.59 96.34 96.34＜0.000 1 0.001 1 1.000 0 0.114 5 0.680 0 0.005 5 0.007 7＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1**********残差失拟项纯误差总差500.02 37.85 1.705E-013 3.65 0.250 0 21.16 18.49 114.29 130.16 130.16 9.46 5.91 3.55 509.48 91111111117341 6 55.56 37.85 1.705E-013 3.65 0.250 0 21.16 18.49 114.29 130.16 130.16 1.35 1.97 0.89 2.22 0.228 1
利用Design Expert 8.0.6软件对表3结果进行多元线性回归分析，建立二项多项式回归方程如下：
由表4可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.228 1＞0.05），表明该回归模型合理且模型拟合度高，回归方程的决定系数R2=0.981 4，调整决定系数R2adj=0.957 6，说明该模型中95.76%的感官评分变化来自自变量A、B、C，该模型可以很好地反映试验真实值，因此该方程可以用于试验结果的分析。由P值可知，一次项A、交互项AC、BC、二次项A2、B2、C 2对西洋参枸杞甜酒酿感官评分影响极显著（P＜0.01），一次项B、C、交互项AB对西洋参枸杞甜酒酿感官评分影响不显著（P＞0.05）。 由F值可知，影响感官评分因素顺序为：枸杞浆添加量（A）＞发酵时间（C）＞甜酒曲添加量（B）。
2.2.2 响应面试验交互作用分析
枸杞浆添加量、甜酒曲添加量和发酵时间3个因素间交互作用对西洋参枸杞甜酒酿的感官评分影响的响应曲面及等高线见图5。
图5 各因素间交互作用对感官评分影响的响应曲面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on sensory score
响应曲面越陡峭，等高线呈椭圆形，则两因素间交互作用对结果影响显著；响应曲面越平缓，等高线呈圆形，则两因素间交互作用对结果影响不显著[39]。由图5可知，AC、BC响应面较陡峭，且等高线呈椭圆形，表明交互作用较显著，AB响应面较平缓，等高线近似呈圆形，表明交互作用不显著，这与方差分析结果一致。
2.2.3 响应面试验分析结果
采用Design-Expert 8.0.6软件对二次多项回归方程求解，得西洋参枸杞甜酒酿的最佳发酵工艺为：枸杞浆添加量7.59%、甜酒曲添加量1.00%，发酵时间48.08 h。在此优化条件下，感官评分预测值为93.74分。为便于实际生产操作，将发酵工艺条件修正为：枸杞浆添加量7.6%、甜酒曲添加量1.0%、发酵时间48 h。在此条件下进行3次平行验证试验，感官评分实际值为94.40分，与预测值相差不大，表明响应面法优化的西洋参枸杞甜酒酿发酵工艺条件可行。
2.3.1 理化指标及微生物指标检测结果
西洋参枸杞甜酒酿理化指标及微生物指标检测结果见表5。由表5可知，西洋参枸杞甜酒酿的总酸、可溶性固形物含量、酒精度、总黄酮含量、总多酚含量分别为4.63 g/L、22.67%、1.83%vol、127.7 mg/L、28.1 mg/L，大肠菌群未检出、菌落总数为13 CFU/g，其理化指标和微生物指标均符合Q/SZSJ 0001S—2023《甜酒酿》规定[40]。
表5 西洋参枸杞甜酒酿理化指标及微生物指标检测结果
Table 5 Determination results of physicochemical indexes and microbiological indexes of Panax quinquefolius and Lycium barbarum sweet fermented glutinous rice
注：“—”表示标准中未对该指标作规定。
项目 检测结果 标准[40]总酸/（g·L-1）可溶性固形物含量/%酒精度/%vol总黄酮含量/（mg·L-1）总多酚含量/（mg·L-1）大肠菌群／（CFU·g-1）菌落总数/（CFU·g-1）4.63 22.67 1.83 127.7 28.1未检出13≤10—≤6——≤10≤103
2.3.2 产品抗氧化性检测结果
西洋参枸杞甜酒酿对DPPH、ABTS自由基的清除能力见图6。
图6 西洋参枸杞甜酒酿对DPPH及ABTS自由基的清除能力
Fig.6 Scavenging ability of Panax quinquefolius and Lycium barbarum sweet fermented glutinous rice on DPPH and ABTS radicals
由图6可知，西洋参枸杞甜酒酿和0.2 mg/mL VC溶液对DPPH自由基、ABTS自由基均有清除作用，且随着甜酒酿样液体积分数增加，均对DPPH、ABTS自由基清除率均呈上升趋势，当西洋参枸杞甜酒酿样液体积分数为1.0 mL/mL时，DPPH、ABTS自由基清除率均达到最高值，分别为75.4%、57.4%，但均低于0.2 mg/mLVC溶液对DPPH、ABTS自由清除率（分别为95.4%、88.5%）。 甜酒酿和VC溶液对DPPH自由基清除率IC50值分别为0.27 mL/mL、0.03 mL/mL，对ABTS自由基清除率IC50分别为0.716 mL/mL、0.206 mL/mL，表明西洋参枸杞甜酒酿抗具有一定的清除自由基能力。
本研究以西洋参、枸杞和糯米为原料，甜酒曲为糖化发酵剂，制备西洋参枸杞甜酒酿，通过单因素试验与响应面试验获得其最优发酵工艺条件为：西洋参浸提液添加量5.0%、枸杞浆添加量7.6%、甜酒曲添加量1.0%、发酵时间48 h、发酵温度30 ℃。 在此最优工艺条件下，西洋参枸杞甜酒酿感官评分为94.4分，酒精度为1.83%vol，总酸含量为4.63 g/L，可溶性固形物含量为22.67%；具有甜酒酿特有的发酵香气，呈橙黄色，酸甜可口；西洋参枸杞甜酒酿总黄酮含量为127.7 mg/L，总多酚含量为28.1 mg/L，其清除DPPH、ABTS自由基的半抑制浓度（IC50）值分别为0.27mL/mL、0.716 mL/mL，该产品具有较好的抗氧化性。 本研究为枸杞、西洋参药食同源的开发利用提供了新的方向，为丰富甜酒酿产品品种，提高其保健作用具有重要的意义，但后期应对西洋参枸杞甜酒酿的其他保健作用及风味物质成分做进一步研究。
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