Process optimization and flavor composition analysis of tea-flavor distilled liquor
茶叶在亚洲和非洲广泛种植，是一种重要的经济作物，含有丰富的次生代谢物，如茶多酚、芳香化合物、儿茶素和多糖[1]。据统计，2023年我国茶园面积和产量持续稳定增长，全国茶园总面积约为34 300 km2，干毛茶总产量约为334万t[2]。但在茶叶深加工的过程中会产生大量的茶梗，约占毛茶总量的18%左右[3]。 研究表明，茶梗中的醛类、醇类和酯类以及茶多酚、茶氨酸、茶多糖和茶色素等物质含量占比高，具有较高的利用价值和营养价值[4]。但消费者没有直接利用茶梗泡茶的习惯，因此只有小部分茶梗被利用，而绝大部分被丢弃，造成资源浪费的同时对自然环境造成了一定程度的负影响[5]。因此如何挖掘茶梗产品来提高茶产业的整体效益，是茶产业发展面临的重要课题。
茶酒是以茶叶、茶粉等茶制品为主要原料，经微生物发酵或调和而成的兼具茶香和酒香的功能性酒精饮料[6]。茶酒中含有儿茶素、没食子酸等强效抗氧化剂，适量摄入有益于身体健康[7]。因此，近年来国内外愈加重视对茶酒的研发。 LIANG Z J等[8]用红茶和绿茶为主要原料，通过液态发酵工艺，生产出茶香风味典型葡萄酒；魏鑫等[9]用枳椇和红茶为原料，通过液态发酵工艺，制作出了一款果香和茶香兼具的发酵型茶酒。但是这些产品大部分都是以茶叶为原料通过简单的配制得到的液态发酵酒，其口味单薄，鲜少有人利用茶梗为原料进行固态发酵。 相比液态发酵，固态发酵的培养基简单，无菌要求低，酶系丰富、操作简单、污染小，风味复杂多变，口感醇厚[10]。 经实验室前期研究，使用新鲜麦芽（发芽大麦）为主要原料，可与绿茶梗的茶香融合得更加协调，因此将新鲜麦芽与绿茶梗进行混合发酵生产茶香风味蒸馏酒，可以有效发挥传统蒸馏酒固态酿造工艺的优势，将茶梗的有机酸类和多酚类化合物融合到酒中，增加茶酒的风味成分和香气特征，同时还能提高茶梗的利用率，一定程度提高茶产业的效益。
本研究以新鲜麦芽（发芽大麦）与绿茶梗为原料进行混合固态发酵，制备茶香风味蒸馏酒，通过单因素试验和中心组合设计（central composite design，CCD）试验，人工神经网络（artificial neural network，ANN）分析结合遗传算法对其发酵工艺进行优化，并采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析其挥发性风味成分。 旨在开发出具有茶香风味的蒸馏酒产品，提升茶梗的附加价值，促进蒸馏酒行业的创新与变革。
大麦：山东枣庄；绿茶梗：湖北黄冈；安琪酿酒曲：安琪酵母股份有限公司；乙酸戊酯（色谱纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；MJP-250恒温培养箱、MSI微型振荡器：上海精宏实验设备有限公司；QHZ-98A全温振荡培养箱：江苏省太仓市华美生化仪器厂；HTY-800g电动食品加工机（切药机）：永康市红太阳机电有限公司；FOCUS 8890气相色谱仪：德国FOCUS公司；DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、5977B-7890B气相色谱质谱联用仪：美国安捷伦科技（中国）有限公司；DMA 35便携式密度计：安东帕（上海）商贸有限公司。
1.3.1 茶香风味蒸馏酒加工工艺流程及操作要点
操作要点：
大麦发芽：选取无虫无杂害的优质大麦，以料液比1∶5（g∶mL）加入清水浸泡，重复3次，每次30 min，之后均匀铺在通风阴凉处，每日适量浇水，适当翻动，持续3 d，直至90%的大麦发芽，且芽长接近1 cm，完成发芽。
初蒸：将发芽大麦清洗之后，于0.1 MPa、127 ℃条件下蒸煮30 min。
焖粮复水：发芽大麦初蒸结束后，将其置于料液比1.0∶1.5（g∶mL），80～85 ℃的热水中焖粮复水20 min。
复蒸：焖粮复水后并将发芽大麦沥干之后，于0.1 MPa、127 ℃下复蒸30 min。
摊凉：复蒸结束后的发芽大麦摊凉至室温（即为熟粮），备用。
酒曲活化：取0.6%安琪酿酒曲加10倍水在35 ℃条件下活化30 min。
糖化：活化后的安琪酿酒曲与摊凉后的发芽大麦（1 500 g/坛）充分混匀，并糖化24 h。
原料混合：将绿茶梗粉碎，经40目过筛后，以添加量15%与完成糖化的发芽大麦混合均匀。
入坛发酵：将完成糖化的含水率为55%的物料装入陶坛之中，25 ℃发酵7 d，发酵过程酒醅中酒精度不再变化，发酵结束。
蒸馏取酒：待发酵结束后，将酒醅中拌入适量稻壳，开始加热蒸馏，去除酒头和酒尾，截取中间段酒样，即得茶香风味蒸馏酒成品。
1.3.2 茶香风味蒸馏酒发酵工艺优化
（1）单因素试验
固定发酵温度为25 ℃，发酵时间为7 d，绿茶梗添加量为15%，熟粮含水率为55%，酒曲添加量为0.6%，改变单一条件，分别考察绿茶梗添加量（5%、10%、15%、20%、25%）；熟粮含水率（45%、50%、55%、60%、65%）；酒曲添加量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）对茶香风味蒸馏酒乙酸乙酯含量与感官评分的影响[11]。
（2）中心组合设计试验
根据单因素试验结果，选取绿茶梗添加量（A）、熟粮含水率（B）、酒曲添加量（C）为自变量，以感官评分（Y）为响应值，进行3因素3水平的中心组合设计试验，确定茶香风味蒸馏酒的最佳发酵工艺。中心组合设计试验因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化中心组合设计试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of central composite design tests for fermentation process optimization
水平 A 绿茶梗添加量/% B 熟粮含水率/% C 酒曲添加量/%-1 5 0 1 10 15 50 55 60 0.6 0.7 0.8
1.3.3 神经网络结合遗传算法优化
为得到更贴合试验结果的拟合效果，通过Matlab 2019设计神经网络对结果进行优化。神经网络包含1个输入层、1个隐藏层和1个输出层，输入层包含3个神经元（绿茶梗添加量、熟粮含水率、酒曲添加量），隐藏层包含11个神经元，输出层包含1个神经元（感官评分）。将单因素试验数据和CCD试验数据导入数据集，以其中70%的数据作为训练集，30%的数据为测试集，设置最大迭代次数为10 000，误差为10-3。神经网络构建完成后，输入数据迭代至最终误差小于10-3，此时神经网络已学习完成[12]。 最后运用遗传算法对神经网络分析得到的模型进行最优值求解[13]。
1.3.4 分析检测
（1）感官评价
参照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》[14]制定茶香风味蒸馏酒的感官评分标准，见表2。由8名国家品酒师（5男3女）对试验酒样的色泽、香气、口味与风格进行感官品评，满分100分，最终得分为去掉一个最高分和一个最低分后的平均值。
表2 茶香风味蒸馏酒感官评分标准
Table 2 Sensory score standards of tea-flavor distilled liquor
项目 评分标准 得分/分色泽（10分）香气（35分）口味（35分）风格（20分）无色或微黄，清亮透明，无悬浮物，无沉淀无色或微黄，透明，无悬浮物，无沉淀黄色，浑浊，有沉淀具有蒸馏酒及茶香，酒香和茶香较浓郁具有蒸馏酒及茶香，酒香和茶香香味淡薄酒香和茶香比例不协调，酒香过重或茶香过重酒体细腻丰满，香味协调，爽净，余味悠长酒体醇和丰满，香味协调，有余味酒体醇和柔顺，较协调酒体不协调，稍有异杂味具有典型协调的茶酒混合香风格茶酒混合香风格较典型无茶酒混合香风格7～10 4～6 0～3 23～35 11～22 0～10 27～35 17～26 9～16 0～8 14～20 7～13 0～6
（2）乙酸乙酯检测
茶香风味蒸馏酒乙酸乙酯含量的测定：利用气相色谱（GC）法[15]。
内标溶液的配制：准确吸取200 μL乙酸戊酯，用体积分数60%乙醇溶液定容至10 mL，低温、避光、密封保存备用。
样品前处理：将蒸馏得到的原酒用0.22 μm滤膜过滤，加入内标物质乙酸戊酯后定容，最终质量浓度为35.024 mg/L，之后进行气相色谱检测。
气相色谱条件：DB-WAX气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 m）；升温程序为初始温度35 ℃保持7 min，以4 ℃/min升到60 ℃，再以6 ℃/min升到105 ℃，最后以20 ℃/min升至200 ℃，保持10 min；进样口温度200 ℃；检测器温度220 ℃；载气为高纯氮气（N2）（99.999%），氢气流速30.0 mL/min；空气流速200 mL/min；柱前压为30 kPa，载气流速为1.12～1.36 mL/min；分流进样，分流比40∶1；进样量0.6 μL。
定性定量分析：根据保留时间进行定性，采用内标法定量分析。
（3）挥发性风味成分检测
挥发性风味成分的测定：采用GC-MS法。
内标配制方法：称取乙酸戊酯0.700 9g，叔戊醇0.650 3 g，2-乙基丁酸0.7549g于10mL容量瓶，乙醇体积分数60%定容。
气相色谱条件：DB-WAX石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），升温程序为初始温度为45 ℃，保持1.5 min，以6℃/min升温至85℃，再以4℃/min升温至115 ℃，再以3℃/min升温至190 ℃，再以5 ℃/min升温至225 ℃，保持3 min，进样口温度260 ℃，载气为高纯氦气（He）（99.999%），载气流速为10.7 mL/min，分流进样，分流比10∶1。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电子能量为70 eV，发射电流为34.6 μA，倍增器电压为1 294 V，接口温度为280 ℃，扫描范围为50～600 m/z。对采集到的质谱图根据化合物峰离子对照美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）数据库检索定性。采用面积归一法对信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）＞3的挥发性风味物质进行相对定量。
1.3.5 数据处理
数据统计使用Microsoft Excel 2019软件，采用Origin 2021软件绘图，显著性分析采用IBM SPSS Statistics 26.0软件，ANN分析采用Design Expert 13.0和Matlab 2019软件。
2.1.1 绿茶梗添加量的确定
不同绿茶梗添加量对茶香风味蒸馏酒中乙酸乙酯含量和感官评分的影响见图1。
图1 绿茶梗添加量对茶香风味蒸馏酒中乙酸乙酯含量及感官评分的影响
Fig.1 Effects of green tea stem addition on ethyl acetate contents and sensory score of tea-flavor distilled liquor
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，乙酸乙酯的含量及感官评分随着绿茶梗添加量的升高呈现先上升后下降的趋势，当绿茶梗添加量为5%～10%时，乙酸乙酯含量和感官评分均上升；当绿茶梗添加量为10%时，感官评分最高（76.0分），乙酸乙酯含量达到最大值（0.38 g/L）；在绿茶梗添加量为10%～25%时，乙酸乙酯含量和感官评分下降。可能是当添加的绿茶梗的含量增加时，茶香风味蒸馏酒中的多酚物质也会随之增加，进而提高酒体的品质，而过量的多酚物质对微生物的代谢繁殖起到了抑制作用[16]，造成后续发酵中乙酸乙酯含量和感官评分降低。因此，确定最佳绿茶梗添加量为10%。
2.1.2 熟粮含水率的确定
不同熟粮含水率对茶香风味蒸馏酒中乙酸乙酯含量和感官评分的影响见图2。 由图2可知，随着熟粮含水率的升高，茶香风味蒸馏酒中乙酸乙酯含量和感官评分呈现出先升高后下降的趋势。当熟粮含水率为45%～55%时，乙酸乙酯的含量和感官评分不断上升；当熟粮含水率为55%时，乙酸乙酯含量和感官评分达到最高，为0.34 g/L和72.8分；当熟粮含水率为55%～65%时，乙酸乙酯的含量及感官评分下降。 可能是当熟粮含水率较低时，入坛时酒醅温度迅速升高，导致酒醅结块，抑制微生物繁殖[17]，酒体乙酸乙酯含量和感官评分较低。 当熟粮含水率过高时，酒醅中氧含量减少，有氧呼吸受到抑制，微生物无法进行正常的生理代谢活动，导致出酒量和酒体质量下降[18]，进而影响酒体中乙酸乙酯的含量和感官评分。因此，确定最佳熟粮含水率为55%。
图2 熟粮含水率对茶香风味蒸馏酒中乙酸乙酯含量及感官评分的影响
Fig.2 Effects of cooked grain moisture content on ethyl acetate contents and sensory score of tea-flavor distilled liquor
2.1.3 酒曲添加量的确定
不同酒曲添加量对茶香风味蒸馏酒中乙酸乙酯含量和感官评分的影响见图3。 由图3可知，随着酒曲添加量的升高，茶香风味蒸馏酒中乙酸乙酯含量和感官评分呈现先升高后下降的趋势。当酒曲添加量为0.4%～0.7%时，乙酸乙酯含量和感官评分不断上升；当酒曲添加量为0.7%时，乙酸乙酯含量达到最大值（0.40 g/L），感官评分最高（80.7分）；当酒曲添加量为0.7%～0.8%时，乙酸乙酯含量及感官评分下降。 可能是酒曲添加量较低时，酒醅中碳水化合物未充分转化为挥发性风味物质[19]，而当酒曲添加量过高时，酒醅可能在发酵前期升温过快，减少后期风味物质生成并产生其他副产物，从而影响酒体品质。因此，确定最佳酒曲添加量为0.7%。
图3 酒曲添加量对茶香风味蒸馏酒中乙酸乙酯含量和感官评分的影响
Fig.3 Effects of Jiuqu addition on ethyl acetate contents and sensory score of tea-flavor distilled liquor
ANN能够普遍逼近所有阶的非线性函数，与传统的正交阵列设计和响应面方法相比，ANN具有更高的优越性和准确性[20-21]。以单因素试验结果为基础，通过Design Expert 13.0进行CCD试验，以感官评分（Y）为响应值，以绿茶梗添加量（A）、熟粮含水率（B）、酒曲添加量（C）为自变量，设计3因素3水平CCD试验对发酵工艺进行优化。 试验设计与结果见表3。
表3 发酵工艺优化中心组合设计试验及结果
Table 3 Results of center combination design tests for fermentation process optimization
编号 A 绿茶梗添加量/%B 熟粮含水率/%添加量/% 预测值 Y 感官评分/分C 酒曲1 234 567891 0 5 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 10 15 2 10 5 18 15 5 10 15 10 10 10 5 15 10 10 10 10 60 46 60 55 55 50 55 60 50 55 50 55 55 63 60 50 55 55 55 55 0.8 0.7 0.6 0.7 0.9 0.8 0.7 0.8 0.6 0.7 0.6 0.7 0.7 0.7 0.6 0.8 0.7 0.7 0.7 0.5 64.3 80.2 75.5 74.3 74.5 74.2 77.7 70.2 69.7 74.0 73.2 74.0 74.0 70.5 76.2 70.5 74.0 74.0 74.0 76.0 64.1 80.5 75.7 68.2 72.7 68.7 77.0 69.7 68.7 72.7 72.7 80.3 74.2 76.2 73.7 72.7 71.8 75.0 71.7 77.5
将试验条件与结果用于神经网络训练与测试，网络拓扑由三层组成（3∶9∶1）：输入层由3种介质成分（绿茶梗添加量、熟粮含水率与酒曲添加量）组成，中间隐藏层由9个神经元组成，输出层用于感官评分。ANN分析结果见图4。当训练周期进行了120个阶段时，预测结果和实际输出值之间的均方误差（mean-square error，MSE）（0.000 961 51）小于设定值（10-3）时，说明神经网络模型建立，可以用于茶香风味蒸馏酒发酵条件参数的预测（图4A）。 并且在中心点和边缘点，试验值与ANN预测的感官评分具有可比性，R=0.997 7（图4B），说明神经网络训练状况良好，可以用于预测。 利用遗传算法对此模型进行最优值求解，得到预测的最优发酵工艺条件为：绿茶梗添加量7.21%、熟粮含水率52.21%、酒曲添加量0.67%时，此时感官评分预测值为87.22分。 为便于实际操作，将发酵条件修正为绿茶梗添加量7%、熟粮含水率52%、酒曲添加量0.7%。 在此条件下进行3次验证试验，茶香风味蒸馏酒感官评分实际值为86.67分，与预测值相差不大，乙酸乙酯含量为0.46 g/L，酒精度为55%vol，证明该方法可以真实的反映各因素对茶香风味蒸馏酒发酵的影响。
图4 预测值与实际值的均方误差随训练次数的变化情况（A）、预测值与实际值的相关性（B）
Fig.4 Change of mean square error of predicted value and actual value with training times (A) and correlation between predicted value and actual value (B)
采用GC-MS对茶香风味蒸馏酒中挥发性风味成分含量进行分析，结果见表4。由表4可知，茶香风味蒸馏酒中共检出31种挥发性风味物质，其中，5种醇类、16种酯类、5种醛酮类以及5种其他类。酯类、醇类及醛酮类物质分别占所有挥发性风味物质含量的52%、16%及16%。茶香风味蒸馏酒中酯类物质中辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚麻酸乙酯、水杨酸甲酯相对含量高，赋予茶香风味蒸馏酒茶香、蜡香、果香、冬青叶香等特征[22-23]。醇类物质不仅可以呈现蒸馏酒的香气，还是醇甜和助香的主要物质来源[24-25]，其中正己醇、芳樟醇和橙花醇相对含量较高，赋予了茶香风味蒸馏酒甜香、玫瑰木香和橙花香[26]。醛酮类物质中β-紫罗酮及醇类物质中芳樟醇、橙花醇、金合欢醇等是酒体呈现茶香的重要物质[27]。醛酮类中苯甲醛是重要的香气物质，可赋予茶香风味蒸馏酒樱桃和坚果香[28]。因此，发酵工艺经过优化后的茶香风味蒸馏酒中挥发性化合物种类丰富，香气协调，感官品质较好。
表4 茶香型蒸馏酒中挥发性风味成分气相色谱-质谱分析结果
Table 4 GC-MS analysis results of volatile flavor components in tea-flavor distilled liquor
注：“-”表示未查询到该化合物的阈值或香气描述。
种类 化合物 含量/（g·L-1）阈值/（mg·kg-1） 香气描述[29-31]醇类0.006-0.08 14.00-32.55-1.12甜香-玫瑰木香玫瑰和橙花香-菠萝香，苹果香，水果香-果香正己醇异戊醇芳樟醇橙花醇金合欢醇乙酸乙酯反油酸乙酯癸酸乙酯葵酸正丙酯己酸异戊酯壬酸乙酯十八酸乙酯十三烷酸乙酯十四酸乙酯十五酸乙酯水杨酸甲酯辛酸乙酯亚麻酸乙酯乙酸异戊酯月桂酸乙酯棕榈酸乙酯正十五碳醛β-紫罗酮苯甲醛十七烷酮甲基壬基甲酮苯基苯萘2,4-二叔丁基苯酚2-乙基丁酸月桂酸0.04 0.95 0.24 0.62 0.07 0.46 0.03 7.95 0.07 0.04 0.12 0.04 0.11 0.95 0.11 0.20 2.86 0.07 1.62 3.13 3.72 0.10 0.13 0.15 0.03 0.05 0.06 1.78 0.05 2.54 0.42--3.15--果酯类-- - -香- - - -0.06 0.58-0.91 1.50 0.18冬青油香气梨、香蕉、花香-香蕉香果香、花香，肥皂香蜡香、奶油香——醛酮类4.20苦杏仁味-- -0.02-- -清其他类--香- -9.15油腻味
本研究以绿茶梗和新鲜麦芽（发芽大麦）为原料，采用固态发酵法，制备茶香风味蒸馏酒，通过单因素试验和中心设计试验、人工神经网络分析结合遗传算法对茶香风味蒸馏酒的发酵工艺进行优化。结果表明，茶香风味蒸馏酒最佳发酵工艺条件为：绿茶梗添加量7%、熟粮含水率52%、酒曲添加量0.7%。在此优化条件下，茶香风味蒸馏酒的感官评分为86.67分，乙酸乙酯含量为0.46g/L，酒精度为55%vol。通过GC-MS法共检测出31种挥发性成分，主要包括醇类5种、酯类16种、醛酮类5种以及其他类5种。本研究开发出了一款具有茶香风味的蒸馏酒产品，提升茶梗的附加价值。
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