Research progress on the utilization of caproic acid bacteria for pit mud maintenance
中国白酒因为其独特的酿造工艺及其呈现的特殊风味,白酒有十二种香型,其中主要有酱香型、浓香型、清香型等[1]。浓香型白酒占白酒总产量的50%以上,而浓香型白酒特有的泥窖发酵赋予其独一无二的风味。谚语云:“千年老窖万年糟”,窖泥是微生物的载体,在浓香型白酒发酵过程中起到了关键作用。 长期的酿造过程中,优质的窖泥持续富集到多种厌氧微生物,这些微生物是形成浓香型白酒独特风味的主要原因。 己酸菌是窖泥中的主体菌株,且优质老窖泥中己酸菌属的相对丰度较高[2]。己酸菌能够代谢生成的己酸能与酵母代谢生成的乙醇反应生成己酸乙酯[3]。己酸乙酯作为国标中规定的浓香型白酒的主体香气成分,其含量直接影响浓香型白酒的品质。因此,优质窖泥、己酸菌群、与浓香型白酒品质三者息息相关。 当窖泥使用年限增长,操作不当或养护不足时,窖泥出现老化退化,导致己酸菌群死亡消退,最终影响白酒品质。
利用己酸菌应用于窖泥是防止窖泥老化退化的研究重点。 目前,主要通过分离出高产己酸菌制成培养液应用于新人工窖池培养和老化窖池养护,菌株利用窖池环境中的糖类、乙醇、乳酸起到维持合适的pH,产生己酸,增产己酸乙酯,保持窖泥内稳态稳定和提升风味物质浓度的作用[4],以达到有效缓解老化问题和提高浓香型白酒质量的目的[5-6]。
本文介绍了窖泥中产己酸菌的来源、己酸合成代谢途径及窖泥质量指标及己酸菌之间的关系,重点论述了己酸菌在新人工窖泥和窖泥养护中的应用。以期找到更加科学合理的养窖、护窖方法,为微生物于浓香型白酒生产中的应用提供理论指导。
窖泥中的产己酸细菌是浓香型白酒窖泥中极其重要的产酸功能菌,代谢产物己酸乙酯是浓香型白酒的特征风味物质[7]。研究表明,最好的白酒往往来窖池底部,窖池底部由窖壁、窖泥、黄水及糟麸构成,微生物丰度较高,己酸菌数量最多,但目前所分离到的单菌普遍存在需要严格厌氧环境,产酸周期较长,适应性低、己酸产量较低等问题[8]。陈茂彬等[9]于湖北某酒厂的优质老窖泥中分离出一株速生梭菌(Clostridium celerecrescens)JSJ-1,其发酵12 d后己酸产量达9.79 g/L。目前,研究分离出的己酸菌来源于各浓香型白酒窖池中的优质底层窖泥。窖泥筛选出的己酸菌主要集中芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和产己酸杆菌属(Caproiciproducens)等。 窖泥中筛选得到的己酸菌中最为常见的是梭菌属(Clostridium)和芽孢杆菌属(Bacillus),主要集中在梭菌科(Clostirdiaceae)。 目前研究集中于己酸菌的发酵特性和耐受性,探究己酸菌株的能够生存和发酵产酸所需的条件范围,通过优化培养基和培养条件来提高己酸产量。芽孢杆菌属中分离得到过纺锤芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)A17、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)a57、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)C78及环装芽孢杆菌(Bacillus circulans)LZ312等,在培养基中发酵5~10 d后己酸产量维持在1.0~2.5 g/L左右[10-14]。相较于梭菌属的己酸菌株,芽孢杆菌属的己酸产量偏低,但芽孢杆菌属的菌株发酵时间较短,产酸速度更快。梭菌属中分离得到速生梭菌(Clostridium celerecrescens JSJ-1)、酪酸梭菌(Clostridium butyricum)GD1-1、梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)M1NH及克氏梭菌(Clostridium kluyveri)A-3等,于培养基中发酵7~14 d,己酸产量维持在1.30~9.79 g/L[15-18]。与芽孢杆菌属的菌株相比,梭菌属的己酸菌产酸能力强,发酵时间长,产酸速度更为缓慢。 窖泥环境复杂,pH范围为5~7,过低pH和高浓度的乙醇条件不适宜微生物生长,研究分离出高产己酸和高耐受的菌株,能更好地适应窖池环境,提升白酒中己酸乙酯的含量,更好地应用于窖池之中。芽孢杆菌属和梭菌属的己酸菌都具有消耗乙醇和葡萄糖产生己酸能力,相比于近几年报道中的其他细菌属的己酸菌株,不同属间的己酸菌菌株的差异集中在可消耗的底物上面,比如瘤胃菌(Ruminococcaceae bacterium)CPB6 利用乳酸产出16.6 g/L的己酸[19-21]。 目前的研究也越来越注重于己酸菌消耗底物能力,拓宽利用的碳源谱系,以期探究其在实际的生产环境中的生长代谢情况。
以梭菌为代表的产己酸菌的代谢途径见图1。由图1可知,己酸菌的代谢主要是通过乙醇降解成乙醇,其中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)吸附H后再转化为乙酰辅酶A(acetyl-coenzyme A,acetyl-CoA);其他底物如葡萄糖和乳酸则是先降解成丙酮酸,再转化成乙酰辅酶A(acetyl-CoA),最后被转化成乙酸,再经过丁酰辅酶A转化形成丁酸,最终形成己酸。通过反向β-氧化循环链延长反应,利用乙酸和乙醇或乳酸合成丁酸和己酸,典型的菌株C.kluyveri合成己酸是通过乙醇作为底物和电子供体通过反向β-氧化循环链延长机制实现的[21-22]。当pH维持在正常范围(pH 5~7)内,己酸菌代谢将通过乙酰辅酶A的作用形成丁酸辅酶A来生成己酸;当pH失调时(pH<5),己酸菌将变更原有的代谢途径,在代谢的过程中形成H2S,导致培养中的己酸菌液颜色变黑产生臭味,己酸菌的生长代谢将受到严重影响,最终导致窖泥的老化问题[23]。人工窖泥中,乙酸和乳酸含量较高,会严重抑制微生物的生长,部分可利用乳酸的己酸菌能够帮助降低窖泥中的乳酸含量。 其中,乳酸代谢产生己酸的过程与乙酸和乙醇的过程类似,乳酸通过丙酮酸氧化成乙酸形成必要的乙酰辅酶A[24]。 乳酸含量会显著降低pH,影响己酸菌的生长。不同的碳源下的己酸菌产酸能力也有差异,而能利用多种碳源的己酸菌在复杂的酿造环境中更占据优势地位[25-26]。
图1 以梭菌为代表的产己酸菌的代谢途径
Fig.1 Metabolic pathways of caproic acid bacteria production represented by Clostridium
行业通行的窖泥检测标准中,常用检测指标主要包含水分、pH、氨基酸态氮、总氮、有效磷、腐殖质等,此外还有窖泥中的挥发性风味成分和感官评价。优质窖泥通常要求观感上黄褐色或灰褐色,有较浓郁的酯香和酒香,香味持久无其他异味。 优质窖泥的含水量达到38%~42%,pH范围要求在5~7之间,腐殖质在4%以上。
水分通常被视为窖泥的重要指标,因为水分直接影响己酸菌等窖泥中微生物的生长,水分含量少和水质过低都会导致土壤板结失活,是导致窖泥老化退化的重要因素[27]。窖泥中的pH直接关系到己酸菌群的生长,浓香型白酒发酵体系中的复合己酸菌群适宜在pH4~8之间生长,过低或过高都会直接抑制己酸菌的生长、影响其产酸[28],pH降低抑制生长,己酸菌群大量死亡衰退致环境不稳定,致使pH持续下降引发恶性循环,最终导致窖泥腐臭酸败。窖泥中的氮的含量直接关系窖泥中微生物菌群的生长,而氨基酸态氮的含量与窖泥质量呈明显正相关[29]。腐殖质含量与所产的原酒中己酸乙酯含量有关,对窖泥酸度的调节、窖泥水分的保持以及己酸菌的驯化具有重要作用[30]。 研究表明,总氮含量随着窖龄增加(窖泥质量提升)呈上升趋势,而窖泥质量又和己酸菌的丰度息息相关,理论上窖泥中总氮含量的差异可以表征窖泥真实的质量[31-32]。 吴浪涛等[33]研究表明,有效磷的含量与梭菌属等己酸菌呈正相关,是形成己酸和己酸乙酯的关键成分。这几种理化指标都与己酸菌的生长代谢息息相关。
张宿义等[34]研究表明,在长期酿造过程中,窖泥中的挥发性风味成分会慢慢渗透进入酒糟中,丰富白酒中的风味。己酸菌在代谢过程中产生的己酸、乙酸、丁酸等有机酸不仅能给白酒带来了愉悦的香气[35],还能与多种功能微生物共同作用产生富含香味的酯类物质,增强浓香型白酒整体风格[36]。通过对优质老窖泥和新窖泥高通量测序分析,己酸菌菌属的相对丰度和绝对丰度与窖泥质量呈现正相关[37]。四川省内各酒厂的窖泥微生物群落中己酸菌群占据主导地位[38]。己酸菌为主体的菌群承担窖泥最基本的功能,维持窖泥环境内稳态,既能够提供浓香型白酒的主体风味物质己酸乙酯,又能够持续代谢生长保持窖泥品质。过往的研究中,分离得到的己酸菌耐受性差,产酸低,不能适应窖泥复杂的环境,养护效果差,窖泥质量提升不明显。窖泥中含有大量乳酸,环境pH低,抑制微生物生长,而能利用乳酸和乙酸的己酸菌则能加快升高环境pH至适宜条件,帮助构建酿酒微生物群落,改善窖泥质量。
窖泥中微生物在酿造过程中产生种类丰富的风味物质,赋予浓香型独特风味物质。功能性窖泥是基于传统人工窖泥的基础,选择性强化窖泥中所需功能微生物。针对当地环境和生产所需,特定培养适应性强的人工窖泥[39]。人工窖泥的培养流程采用当地的优质泥土,添加筛选所得的优良复合己酸菌液培养,探索菌群的最适宜环境条件,加速酿酒环境微生态构建。己酸菌产生的己酸是白酒中己酸乙酯合成的前体物质,其浓度直接影响浓香型白酒的品质[39]。
刘淼等[40]将产己酸菌株用于制造功能性人工窖泥,有效提升了新窖泥中的芽孢杆菌数,生产的新酒中己酸乙酯的含量达到210 mg/100 mL。 梁萌等[41]以优质老窖泥(己酸菌为主体)为原料制备培养己酸菌养护液,将其应用于人工窖泥培育,在三年的使用期间内,窖池窖泥中芽孢杆菌数提升200%,所产原酒中的己酸乙酯的含量可达411.1 mg/mL,白酒品质显著提升。杜礼泉等[42]通过复配己酸菌液和窖泥养护液的方法培养人工窖泥,维持水分在40%左右,达到优质窖泥标准。鲁少文等[43]分离得到瘤胃梭菌(Clostridium sp.)CPC-11并应用于人工窖泥的制作过程,该菌属于瘤胃菌科(Ruminococcaceae)中Clostridium cluster IV的一个新种。当以乳酸为碳源时,其己酸产量达3.02 g/L,窖泥中的己酸乙酯的含量提升至0.84 mg/g,相比培养前显著提高了2.74倍,这也印证了己酸菌能够利用乳酸维持pH值的结论。汪家胜等[44]使用宣酒的瘤胃梭菌(Clostridium sp.)CPB6培养新窖泥,发酵液中己酸产量能达到5.614 g/L,新窖泥中己酸菌属的相对丰度为89%,加速提升新窖泥速熟。己酸菌的应用对于人工窖泥的制备起到了助推作用,随着更优良的己酸菌株分离纯化人工窖泥制备工艺将迅速成熟。
人工窖泥功能微生物数量较少,种类单一,因此如何以高产酸适应性强的己酸菌为主体复配成复合己酸菌液是重点。己酸菌在有机人工窖泥中的地位十分重要,它可以丰富浓香型白酒的风味,改善酒体协调性和口感,加速提升白酒品质。而己酸菌的产酸能力则严重影响着在人工窖泥培养中的效果,产酸能力强的己酸菌制备养护液所培养能得到效果也更加明显。
窖泥的优劣显著影响浓香型白酒的产量和质量,而窖泥质量的好坏由窖泥中所含微生物的种类及数量决定[45]。理化指标中的pH不适宜、入池水分过少、Ca2+影响土壤板结等均会导致窖泥中己酸菌等功能性菌种的生长代谢,导致窖泥发生老化现象[46]。窖泥养护的传统方法则是通过利用黄水和曲粉混合物去培养,但是传统养护方法的养护效果不明显。国内生产常用窖泥主要是通过老泥培养新泥法和两次发酵法培养人工窖泥,新的人工窖泥质量往往不如老窖泥,需要经年累月的酿造改良[37,47]。目前,利用优质老窖泥、优质大曲等接种,培养己酸菌功能菌可以有效缓解窖泥老化问题。
张家庆[47]开始将富集的己酸菌液应用在湖北某酒厂的退化窖池试点养护之中,己酸乙酯含量提升42.7%,已经接近正常窖池水平。杨月轮[15]将十里香酒厂窖泥中分离出的克氏梭菌(Clostridium kluyveri)SLXJNR3-1应用于窖池养护中,窖泥中己酸菌量提高了36%,达到了614.2×102个/g,有效提升了生产中的白酒风味。老化窖泥中pH值低于正常范围(pH5~7),己酸菌生长受到抑制是导致老化问题持续的原因之一。李斯琳等[48]筛出一株可以利用葡萄糖的克氏梭菌(Clostridium celerecrecns)制成养护液用于窖池,养护后窖池pH升高2.0左右,酒体中己酯含量提高0.9 g/L,有效遏制窖池老化,达到了持续养护的效果。 杨将等[49]从刘伶醉酒业窖泥中分离出己酸菌H1,将其用于制备窖泥养护液,其己酸产量最高可达5.4 g/L。
混菌发酵也开始受到广泛的关注, 研究发现, 甲烷菌、酵母菌、芽孢杆菌、放线菌与己酸菌的混菌发酵有利于提高己酸的产生,改善严格的厌氧环境,但是仍然存在低产量和低稳定性方面的问题[50],许多学者开始尝试进行多种菌株复合养护[51-52]。 桑其明等[53]将己酸菌和甲烷菌复配窖泥养护液,窖泥养护效果非常理想,显著优化了窖泥中的微生物菌群结构。 屈光伟等[54]研究发现,复合己酸菌和酯化红曲可快速增加窖泥中各大酯的含量,改善浓香型白酒酒体风味。 孙露露等[55]研究发现,己酸菌与生香酵母的复合培养,可以提高窖泥己酸菌数和代谢物质,经养护后的窖池出酒率较对照组提高2.09%,特优率提高3.01%,对于浓香型白酒窖池的养护起到了促进效果。JIANG X Y等[56]将己酸菌JSJ-1与多种菌株进行复配,复配得到的窖泥养护液在窖池中应用后所得酒体中的己酸大幅提高。与未养护的窖池相比,酒体中的四大酯类物质含量均有所增加,丰富了白酒风味,有效提高了白酒品质。综上所述,在窖池养护中,将己酸菌等优势菌群制备为窖泥养护液,能够缓解窖泥老化问题,提高浓香型白酒品质。 高产己酸的己酸菌在窖池养护中起到了举足轻重的效果。由于窖池老化复杂的因素,添加能起到稳定pH,增加产香物质等多种辅助菌株共同养护将会是更好的选择。
为了提升白酒品质,解决人工窖泥和窖池养护问题可以参考从下方法:①从相同环境中产优质酒的窖泥中筛选稳定、功能性多、能适应多种环境、利用多种碳源的高产己酸菌株。不同的菌株拥有多种碳源利用能力,于老化窖池的复杂环境中有着更强的适应性。 筛选出能稳定pH等特殊功能的己酸菌,则能在长久的生产过程中持续遏制窖池老化。 在产己酸增加浓香型酒体特征风味的同时,又能维持窖池内部微生态的平衡,可以更好地应用在窖池养护和预防老化的方面。 ②将筛选所的得到的己酸菌和其他特定功能性菌株复配培养,研究菌株之间协同或抑制作用。己酸菌与己酸菌互作可以增加代谢途径中的相关因子浓度,帮助增加己酸产量,增强白酒特征风味。通过己酸菌与酯化红曲等复配则可以增加白酒风味的丰富度,提升酒的香气。 而与高级醇降解菌复配可以减少高级醇的含量,改善白酒口感。 研究多菌株的互相协同,可以帮助构建复现优质窖泥微生态,满足窖泥养护的需求。
己酸菌是一种在浓香型白酒生产中重要的功能微生物,对于窖泥的质量起着关键性作用,直接影响浓香型白酒品质。 目前筛选出的己酸菌多是梭菌属和芽孢杆菌属,且多数菌种产酸能力不高,适应性不强。 在己酸菌正常代谢途径中,pH是非常重要的影响因素之一。pH失衡导致的己酸菌代谢途径变更,直接影响着菌株产酸,造成菌群退化消亡,是导致窖泥老化的原因之一。己酸菌作为窖泥中的主体产酸微生物,起到了维持窖泥环境内稳态的指导作用。
在人工窖泥培养和窖池老化养护中,制备己酸菌养护液是首选方案。人工窖泥常常面临着窖泥理化指标不达标,微生物种类数量缺失等问题。功能性人工窖泥培养中的己酸菌起着关键性作用,多数研究表明己酸菌培养液起作用于窖池养护效果良好。 对于窖池老化问题,复合己酸菌液不仅可以丰富白酒风味物质,还能进一步改进酒体口感,提高浓香型白酒的酒质。
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