Effect of Lactobacillus paracasei ALAC-4 with fungal inhibitory effect on the quality of yogurt during storage
酸奶是由鲜牛乳经乳酸菌发酵后得到的奶制品，其不仅口感好，且富含蛋白质、钙、维生素等多种营养成分，具有增强人体免疫力、维护肠道健康等作用[1]。 传统酸奶发酵菌株主要由嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）组成[2]。 由于酸奶中营养物质丰富，为霉菌和酵母菌腐败菌的生长创造了条件，其中真菌生长可以产生霉菌毒素等次级代谢物，对人类健康构成潜在风险[3-5]。目前，酸奶的防腐手段主要采用物理方法，如低温储存、高压杀菌等。 然而，这些方法都有其局限性，增加了生产成本，且对能源有一定消耗[6]。 因此，开发一种新型、安全的生物防腐剂已成为当务之急。
乳酸菌被广泛认为是一种“生物绿色防腐剂”，已被用作食品工业的发酵剂，特别是在乳制品和发酵产品的生产中，可以有效替代食品中的化学防腐剂，抑制食品腐败菌的生长，延长货架期[7-8]。张恩馨等[9]研究发现，瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）AJT在发酵乳中可延长货架期；张颖等[10]研究发现，乳酸菌F32-2应用于发酵乳起到防腐保鲜的效果。某些乳酸菌虽然具有抑制食品腐败菌生长的作用，但是发酵性能不如传统发酵剂，应用到酸奶发酵中会导致酸奶感官及理化品质下降[11]。所以寻找到既能延长酸奶货架期，又具有良好发酵特性的乳酸菌至关重要[12]。
副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）ALAC-4分离自内蒙古传统发酵食品，具有广谱抑菌活性，尤其是可抑制致腐霉菌和酵母的生长，但对嗜热链球菌L-1无拮抗作用，且发酵性能良好[13]。本课题组前期研究已将该菌株应用于酸奶中，并通过单因素试验和响应面分析确定了酸奶的最佳发酵工艺[14]。在此基础上，本研究采用副干酪乳杆菌ALAC-4代替传统保加利亚乳杆菌L-14与嗜热链球菌L-1按照1∶1的接种比例发酵酸奶，以传统发酵酸奶（保加利亚乳杆菌L-14∶嗜热链球菌L-1=1∶1）为对照组，通过测定发酵结束后28 d贮藏期内两组酸奶的感官品质、理化性质、质构、微生物活菌数及风味等探讨副干酪乳杆菌ALAC-4对贮藏期间酸奶品质的影响，以期为该菌株作为保鲜发酵剂的应用潜力及其对延长酸奶货架期的贡献奠定科学依据。
1.1.1 菌株
副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）ALAC-4、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）L-14和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）L-1：均由内蒙古农业大学食品科学与工程学院食品微生物资源开发与应用创新团队提供。
1.1.2 试剂
全脂鲜牛乳：蒙牛乳业有限责任公司；白砂糖（食品级）：内蒙古大江糖业有限公司；氢氧化钠、酚酞（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基MRS固体培养基、MC固体培养基、孟加拉红培养基：广东环凯微生物科技有限公司。
KDC-140HR高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学有限公司；IKARRV10 digital旋转蒸发仪：广州仪科实验室技术有限公司；P8-10 pH计：赛多利斯科学仪器有限公司；DV-E型黏度计：美国Brookfield公司；TA-XT plus质构仪：英国Stable Micro System公司；PEN3电子鼻：德国Air Sense公司；SA402B电子舌：日本Insent公司。
1.3.1 酸奶的制备工艺流程
鲜牛乳→加热→添加白砂糖→水合→杀菌→冷却→接种→发酵→冷却后熟→酸奶成品
操作要点[15]：将全脂鲜牛乳加热至50 ℃后添加5%白砂糖，混合30 min使白砂糖充分溶解。 然后在90 ℃条件下杀菌7 min，取出冷却至室温。将乳酸菌活化至三代，菌液活菌数调节至1×106 CFU/mL，按3%的接种量接种乳酸菌。以接种嗜热链球菌L-1和保加利亚乳杆菌L-14（接种比例1∶1）为对照组，接种嗜热链球菌L-1和副干酪乳杆菌ALAC-4（接种比例1∶1）为实验组，接种后在40 ℃条件下发酵，当pH值降至4.6～4.7视为发酵终点。发酵结束后置于4 ℃条件下后熟12 h后得到酸奶成品。酸奶成品置于4 ℃条件下贮藏，分别在贮藏1 d、7 d、14 d、21 d、28 d取样。
1.3.2 感官评价
选取10名（5名男性，5名女性）专业的感官评定人员组成感官评价小组，参考RHB 104—2020《发酵乳感官评鉴细则》[16]稍作修改对酸奶样品进行感官评价，评定指标包括色泽（20分）、乳清析出程度（20分）、组织状态（20分）、香气滋味（20分）、酸甜度（20分），感官评分满分100分，具体评分标准见表1。
表1 酸奶的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of yogurt
项目 评价标准 评分/分色泽（20分）乳清析出程度（20分）组织状态（20分）香气滋味（20分）酸甜度（20分）呈均匀乳白色淡黄色浅灰色或灰白色无乳清析出或者微量乳清析出少量乳清析出大量乳清析出组织细腻、均匀、无裂纹、粘稠适宜组织粗糙、有裂纹、较稀或者较稠组织粗糙、有裂纹，太稀薄或者太粘稠香气浓郁，饱满，酸奶滋味明显香气稍淡香气淡，异味明显酸味、甜味比例适当酸甜不明显过酸或者过甜15～20 10～14＜10 15～20 10～14＜10 15～20 10～14＜10 15～20 10～14＜10 15～20 10～14＜10
1.3.3 理化指标的测定
pH：采用精密pH计于室温下测定。 可滴定酸度：根据GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》[17]测定。黏度：酸奶样品冷却至室温后，使用粘度仪测定，具体条件为采用4#转子，速度100 r/min，扭矩10%～100%，测量时间30 s[18]。持水力：称量各组酸奶样品30 g，以6 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，弃上清后测定质量，持水力计算公式如下：
持水力=（样品质量-沉淀质量）/样品质量×100%[19]
1.3.4 质构的测定
采用TA.XTPlus质构仪对酸奶样品的硬度、内聚性、弹性、咀嚼性、回复性、胶着度等参数进行测定，具体条件为选用A/BE探头，测试距离10 mm，触发力5.0 g，测前速率3 mm/s，测中速率2 mm/s，测后速率3 mm/s[20]。
1.3.5 微生物指标的测定
乳酸菌：根据GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定》[21]，利用菌落平板计数法计算乳球菌和乳杆菌的活菌数，结果取对数值。
真菌测定：将酸奶置于室温（20 ℃）分别进行封口和敞口贮藏，依据国标GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》[22]测定霉菌和酵母菌活菌数。
1.3.6 风味测定
（1）气味指标的测定
分别取不同贮藏时间的酸奶样品20 g放入50 mL的离心管内，密封。参考MORAZAVIAN A M等[23]的方法，在50 ℃恒温20 min后，使用PEN3便携电子鼻进行测量，PEN3包含10种不同的金属氧化物感应器，具体见表2。
表2 电子鼻传感器所对应的气味类型
Table 2 Odor type corresponding to the electronic nose sensor
序号 传感器 性能描述1234567891 0 W1C W5S W3C W6S W1S W5C W1W W2S W2W W3S芳香苯类氮氧化合物氨类氢化物甲基类烷烃含硫化合物醇类、醛酮类有机芳香硫化物芳香烷烃
（2）滋味指标的测定
分别取不同贮藏时间的酸奶样品50 g，用2倍的蒸馏水稀释后，在12 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min的，取出上清液，减压抽滤后，将每个样品倒入样品杯中，测定样品的酸味、苦味、咸味、涩味、鲜味、酸的回味、苦的回味和鲜的回味8个味觉指标[24]。
1.3.7 数据处理与分析
所有实验均进行3次平行实验，采用SPSS17.0软件处理数据，结果用“平均值±标准偏差”表示，采用Origin 8.0软件作图。
贮藏期间酸奶感官评分的变化见表3。 由表3可知，在28 d贮藏期内实验组和对照组酸奶的感官评分均呈现降低趋势。 贮藏28 d内，实验组酸奶的感官评分高于对照组酸奶，且贮藏14 d后，实验组酸奶的感官评分显著更高（P＜0.05）；贮藏28 d时，实验组酸奶的感官评分[（82.61±0.69）分]显著高于对照组[（74.88±1.01）分]（P＜0.05），对照组酸奶表现为乳清析出、组织松散、口感酸涩，而实验组酸奶感官品质较好。 可能是由于添加副干酪乳杆菌ALAC-4发酵的酸奶具有更好的黏度和持水力，改善了酸奶的感官品质。综上，副干酪乳杆菌ALAC-4代替保加利亚乳杆菌L-14可减缓酸奶感官品质的下降。
表3 贮藏期酸奶感官评分的变化
Table 3 Changes in sensory score of yogurt during storage
注：大写字母表示同贮藏时间两组间差异显著（P＜0.05），小写字母表示同组内不同贮藏时间间差异显著（P＜0.05）。 下同。
贮藏时间/d 对照组 实验组95.63±0.82Aa 93.65±0.48Ab 92.88±1.12Ab 88.04±0.44Ac 82.61±0.69Ad 1 7 1 4 21 28 95.52±0.55Aa 93.04±0.98Ab 88.02±0.78Bc 79.47±1.35Bd 74.88±1.01Be
2.2.1 pH值及可滴定酸度的变化
pH值和可滴定酸度是评价酸奶口感、保质期的重要指标，也是判断发酵稳定性的依据，对于生产稳定、优质的酸奶至关重要[25]。因此，测定酸奶在贮藏期间pH值及可滴定酸度的变化，结果见图1。
图1 贮藏期间酸奶pH值和可滴定酸度的变化
Fig.1 Changes in pH value and titratable acidity of yogurt during storage
由图1可知，发酵结束后（贮藏0 d），两组酸奶的pH、可滴定酸度无明显差异（P＜0.05），表明副干酪乳酪杆菌ALAC-4不会影响嗜热链球菌发酵，因此，可以与嗜热链球菌复配。 贮藏期间两组酸奶样品的pH值均呈下降趋势，可滴定酸度均呈上升趋势，分析原因可能是贮藏期间乳酸菌不断分解乳糖产生乳酸所致[26]。在贮藏28 d时，实验组酸奶的pH值（4.16）显著高于对照组酸奶（4.02）（P＜0.05）。 贮藏28 d内，实验组酸奶的可滴定酸度均低于对照组，且在贮藏7 d后，实验组酸奶的可滴定酸度显著更低（P＜0.05），表明副干酪乳杆菌ALAC-4控制酸度能力较好；贮藏28 d时，实验组酸奶的可滴定酸度（117 °T）显著低于对照组（123°T）（P＜0.05）。酸奶后酸化主要受乳酸菌种类、数量及发酵活力的影响，保加利亚乳杆菌是后酸化的主要菌株[27]，因此，通过调整发酵剂的配比，可以减缓酸奶的后酸化问题。有研究发现，高比例的杆菌发酵可减弱后酸化程度[28]。杜昭平等[29]在酸奶发酵中调整杆菌比例，可减弱酸奶后酸化。综上，副干酪乳酪杆菌ALAC-4比保加利亚乳杆菌L-14具有更良好的减弱后酸化的能力，与嗜热链球菌复配可以调节发酵酸奶酸度，减缓pH值下降。
2.2.2 持水力及黏度的变化
在贮藏期间酸奶持水力及黏度的变化见图2。由图2A可知，发酵结束后（贮藏0 d），两组酸奶的持水力无显著差异（P＞0.05），说明添加ALAC-4不会对酸奶持水力造成负面影响。 随着贮藏时间的延长，两组酸奶的持水力均呈下降趋势，但实验组酸奶持水力下降相对缓慢，分析原因可能与酸奶中的蛋白水解酶活性有关[30]。贮藏28 d内，实验组酸奶的持水力显著高于对照组（P＜0.05），贮藏28 d时，实验组和对照组持水力分别下降到73.33%、65.08%，对照组酸奶乳清析出较多，严重影响了酸奶的口感。由图2B可知，对照组酸奶的黏度随贮藏时间的增加呈现先升高后降低的趋势，这是因为在发酵期间，乳酸菌大量繁殖，pH值持续下降；乳蛋白分子在酸奶中的表面活性下降，在牛乳中形成了极小的亚胶态分子，从而使酸奶的黏度持续升高；但随贮存时间的增加，胶态分子群逐步解离，导致酸奶黏度降低[31]。而实验组酸奶的黏度在贮藏期间整体呈上升趋势。 贮藏28 d时，实验组酸奶的黏度（2 622.35 mPa·s）显著高于对照组（2 289.61 mPa·s）（P＜0.05），说明添加副干酪乳杆菌ALAC-4可提高酸奶黏度，分析原因可能是由于菌株ALAC-4产胞外多糖，而胞外多糖的乳清相能提高酸奶的稠度与黏度[32]。 综上，实验组酸奶凝胶稳定性优于对照组，副干酪乳酪杆菌ALAC-4代替保加利亚乳杆菌L-14改善了酸奶贮藏期的品质，有效的减缓了酸奶持水力和黏度的下降。
图2 贮藏期间酸奶持水力（A）及黏度（B）的变化
Fig.2 Changes in water holding capacity (A) and viscosity (B) of yogurt during storage
在贮藏期间酸奶质构的变化见图3。在生产过程中，原料奶组成、加工方法和酸度都会对酸奶的弹性产生一定的影响[33]。由图3A可知，贮藏期间两组酸奶的弹性均呈先升高后下降的趋势，且在贮藏21～28 d时，实验组酸奶的弹性显著高于对照组（P＜0.05），贮藏28 d时，实验组与对照组酸奶的弹性分别为0.273、0.261。由图3B可知，贮藏期间两组酸奶的回复性均呈先升高后下降的趋势，在贮藏28 d内，实验组酸奶的回复性低于对照组，但在贮藏14 d之后无显著差异（P＞0.05），贮藏28 d时，实验组与对照组酸奶的回复性分别为0.018、0.020。由图3C可知，贮藏期间两组酸奶的胶着度均呈下降的趋势，在贮藏28 d内，实验组酸奶的胶着度低于对照组，但在贮藏28 d时无显著差异（P＞0.05），分别为1.955 N、2.051 N。 由图3D可知，贮藏期间两组酸奶的硬度均呈先升高后下降的趋势，贮藏28 d时，两组酸奶的硬度无显著差异（P＞0.05），实验组与对照组酸奶的硬度分别为10.445 N、10.899 N。内聚性是指酸奶的内部结合能力，酸度、持水性和蛋白质的结构对酸奶的内聚性有一定的影响[34]。由图3E可知，贮藏期间两组酸奶的内聚性均呈波动升高趋势，但在贮藏28 d时无显著差异（P＞0.05），实验组与对照组酸奶的内聚性分别为0.188、0.189。 由图3F可知，贮藏期间两组酸奶的咀嚼度均呈先升高后下降的趋势，且实验组酸奶的咀嚼度均低于对照组，但在贮藏28 d时，两者无显著差异（P＞0.05），分别为0.537 N、0.550 N。综上，副干酪乳酪杆菌ALAC-4代替保加利亚乳杆菌L-14对 贮藏结束（28 d）时酸奶的质构影响较小。
图3 贮藏期间酸奶质构的变化
Fig.3 Changes in texture of yogurt during storage
2.4.1 乳酸菌活菌数的变化
在贮藏期间酸奶乳酸菌活菌数的变化见图4。由图4可知，贮藏期间两组酸奶样品中的乳球菌和乳杆菌活菌数均＞1.0×108 CFU/mL，但均呈逐渐下降趋势，分析原因可能是贮藏过程中，酸奶的pH值不断降低，使得乳酸菌活菌数减少[35]。 贮藏0～28 d，实验组酸奶中的乳球菌及乳杆菌活菌数始终显著高于对照组（P＜0.05），分析原因可能是保加利亚乳杆菌产生H2O2，抑制链球菌的生长[36]，副干酪乳杆菌ALAC-4的耐酸性较强，贮藏28 d时，实验组和对照组酸奶中乳球菌活菌数的对数值分别为8.5、8.4，乳杆菌活菌数的对数值分别为8.6、8.0。综上，副干酪乳酪杆菌ALAC-4维持酸奶中乳酸菌活性有一定优势。
图4 贮藏期间酸奶乳酸菌活菌数的变化
Fig.4 Changes in viable Lactobacillus counts of yogurt during storage
2.4.2 真菌活菌数的变化
将酸奶置于室温（20 ℃）进行封口贮藏，测定酸奶中霉菌及酵母菌活菌数，结果见表4。 由表4可知，在室温封口贮藏过程中，实验组均未检出霉菌和酵母菌，而对照组则在贮藏21 d出现霉菌污染，贮藏28 d时，霉菌活菌数达到14 CFU/g；在贮藏28 d时出现酵母菌污染，酵母菌活菌数达到10 CFU/mL，表明副干酪乳酪杆菌ALAC-4代替保加利亚乳杆菌L-14可抑制真菌污染酸奶。
表4 室温封口贮藏期酸奶霉菌及酵母菌数的测定结果
Table 4 Determination results of mold and yeast counts in yogurt during sealed storage at room temperature CFU/g
真菌 酸奶贮藏时间/d 1 7 14 21 28霉菌0酵母菌实验组对照组实验组对照组0000 0000 0000 0201 14 0 10
为验证副干酪乳杆菌ALAC-4作为生物防腐剂在酸奶体系中对霉菌和酵母的抑制效果，将酸奶置于室温条件下敞口放置，测定酸奶中霉菌及酵母菌活菌数，结果见表5。由表5可知，敞口放置5 d时，对照组酸奶的霉菌活菌数高于国标GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》的要求，酸奶表面长出了霉菌菌落，且伴随着严重的乳清析出，而实验组酸奶的霉菌活菌数数仍符合国标要求，酸奶表面保持光滑，质地均匀无明显乳清析出，到放置9 d时霉菌活菌数高于国标要求，表明副干酪乳酪杆菌ALAC-4可有效抑制酸奶中霉菌的生长，敞口贮藏期较对照组延长4 d。敞口放置6 d时，对照组酸奶的酵母菌活菌数高于国标要求，而实验组酸奶在放置8 d时酵母菌活菌数才高于国标要求，表明副干酪乳酪杆菌ALAC-4可有效抑制酸奶中酵母菌的生长，敞口贮藏期较对照组延长2 d。综上，副干酪乳酪杆菌ALAC-4代替保加利亚乳杆菌L-14可有效抑制酸奶中真菌的生长。
表5 室温暴露贮藏过程中霉菌及酵母菌活菌数的测定结果
Table 5 Determination results of mold and yeast counts in yogurt during exposed storage at room temperature CFU/g
注：“-”表示霉菌、酵母菌活菌数高于国标GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》的要求。
真菌 酸奶贮藏时间/d 1 2 3 4 5 6 7 8 9霉菌0 20酵母菌实验组对照组实验组对照组0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 15 0 36 0- 7 9 3 2- 6 2-13-87--- --- - -
2.5.1 气味的变化
使用电子鼻分析酸奶在贮藏期气味的变化，结果见图5。 由图5可知，在发酵结束（贮藏0 d）时，两组酸奶的电子鼻传感器响应值相似（P＞0.05），表明副干酪乳杆菌ALAC-4代替保加利亚乳杆菌L-14不会对酸奶的气味造成影响。贮藏7 d时，两组酸奶的电子鼻传感器响应值相似（P＞0.05），但随着酸奶贮藏期的延长，两组酸奶的气味产生了显著差异（P＜0.05）。 与对照组相比，实验组酸奶的W5S（氮氧化合物）、W1S（甲基类）、W1W（硫化合物）、W2S（醇类和醛酮类）、W2W（有机芳香硫化物）传感器响应值升高，表明副干酪乳杆菌ALAC-4代替保加利亚乳杆菌L-14可使酸奶气味更丰富[37]。
图5 贮藏期酸奶气味电子鼻分析响应值的变化
Fig.5 Changes in the response values of yogurt odor analysis by electronic nose during storage
2.5.2 滋味的变化
使用电子舌分析酸奶在贮藏期滋味的变化，结果见图6。由图6可知，在发酵结束（贮藏0 d）时，两组酸奶的电子舌传感器响应值无显著差异（P＞0.05），表明副干酪乳杆菌ALAC-4代替保加利亚乳杆菌L-14不会对酸奶的滋味造成影响。贮藏7～21 d时，两组酸奶的8个滋味均没有显著差异（P＞0.05），但随着酸奶贮藏期的延长，两组酸奶的滋味产生了显著差异（P＜0.05）。贮藏28 d时，实验组酸奶的酸味、苦味和涩味显著高于对照组（P＜0.05），但鲜味显著低于对照组（P＜0.05），其他风味没有显著变化（P＞0.05），表明副干酪乳杆菌ALAC-4代替保加利亚乳杆菌L-14缓解了酸奶贮藏期滋味品质的下降，改善了酸奶的品质。
图6 贮藏期酸奶滋味电子舌分析响应值的变化
Fig.6 Changes in the response values of yogurt taste analysis by electronic nose during storage
本研究以传统发酵酸奶为对照组，选用副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）ALAC-4代替传统保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）L-14按照1∶1的接种比例进行酸奶发酵（实验组），通过测定发酵结束后贮藏期（0～28 d）内两组酸奶的理化指标、质构、微生物指标、风味并进行感官评价，探究副干酪乳杆菌ALAC-4代替传统保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus）L-14对酸奶贮藏品质的影响。结果发现，在感官品质方面，实验组酸奶在贮藏过程中，感官评分下降幅度明显小于对照组，这得益于副干酪乳杆菌ALAC-4使酸奶具有更好的黏度和持水力，有效缓解了乳清析出、组织松散及口感酸涩等问题，显著延缓了感官品质的劣变。 在理化指标方面，贮藏初始两组酸奶的pH和可滴定酸度无显著差异，但贮藏期间实验组pH下降更缓，实验组酸度始终低于对照组，表明ALAC-4对酸度调控能力强，能有效减缓后酸化；实验组持水力和黏度较高，这与副干酪乳杆菌ALAC-4产胞外多糖提升酸奶稠度有关，增强了凝胶稳定性。 在质构方面，28 后实验组与对照组在多个指标上无显著差异（P＞0.05），表明副干酪乳杆菌ALAC-4不会对酸奶质构产生不良影响。 在微生物指标方面，在室温贮藏28 d后，实验组酸奶乳酸菌活菌数显著高于对照组（P＜0.05），实验组为检出霉菌和酵母菌，表明副干酪乳杆菌ALAC-4可以有效维持乳酸菌活性，抑制真菌生长，延长货架期。 在风味品质方面，贮藏初期两组酸奶的气味和滋味无显著差异（P＞0.05），但在贮藏后期，实验组酸奶的气味更丰富，滋味虽在28 d时酸味、苦味和涩味相对较高，但鲜味降低的同时整体品质仍有改善，缓解了风味品质的下降。综上，副干酪乳杆菌ALAC-4替代传统菌株用于酸奶发酵，在提升品质、抑制真菌和延长货架期等方面表现优异，在酸奶生产领域极具应用潜力，为生物防腐和酸奶品质优化提供了有效途径。
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