Effect of Meyerozyma caribbica on the quality of'Cabernet Sauvignon'dry red wine
赤霞珠（Cabernet Sauvignon）是葡萄科、葡萄属植物葡萄的一个品种，因植株具有风土适应性强，产量较高，易早期丰产等特点[1]，在中国各葡萄酒产区均有栽培[2]，是世界著名的酒品种之一，主要用来酿造陈酿型干红葡萄酒（残糖量≤4.0 g/L）。赤霞珠干红葡萄酒色泽较深、具有浆果气味，并有橡木芳香，入口圆润饱满，口感平衡愉悦，香气优雅纯正的特点而闻名世界，受到消费者喜爱。
干红葡萄酒的品质不仅受到葡萄果实的种类和酿造工艺的影响，同时与所选酵母代谢活动密切相关。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有酒精产率高、发酵完全等酿造特性，但单一接种酿酒酵母会出现产品同质化、风格单一、缺乏典型性等问题[3]。而非酿酒酵母能够通过自身独特的代谢途径或释放胞外酶，催化分解挥发性香气物质前体，以及促进酿酒酵母降解发酵底物，产生酯类、醇类等常见挥发性香气化合物，丰富酒体香气[4]，WEI J P等[5]证实毕赤酵母X31-10会产生乙酸、戊酯和乙酸酯等特征挥发性化合物；VARELA C等[6]研究发现，美极梅奇酵母生产的葡萄酒中乙酸乙酯含量增加。但大部分非酿酒酵母菌的酒精代谢能力较差、发酵力不足、存活时间短，难以独立完成酒精发酵过程[7]。因此，利用非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵以改善葡萄酒品质具有重要意义。
本研究以‘赤霞珠’葡萄为原料，利用卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbica）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以 单 一 发 酵（CK、MC），同 时 发 酵（TS1、TS2、TS3），顺序发酵（SX1、SX2）接种方式进行葡萄酒酿造，分析酒样理化指标、挥发性风味化合物和感官品质，以期优化混菌发酵工艺，为改善干红葡萄酒品质提供理论依据。
赤霞珠葡萄（还原糖含量为247 g/L，酸度为5.11 g/L）：2023年9月采摘自内蒙古自治区包头土默特右旗；商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ES488：法国英纳帝斯公司；卡利比克迈耶氏酵母（Meyerozyma caribbic）：经前期实验室筛选鉴定并保存。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基、营养琼脂（nutrient agar，WL）培养基：青岛海博生物技术有限公司；酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、果胶、半乳糖醛酸、3,5-二硝基水杨酸（均为分析纯）：天津福晨化学试剂有限公司；4-辛醇（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司。
SX-700高压灭菌锅：上海莱瑞科学仪器有限公司；7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；VERSA1100MPS多功能样品前处理平台：德国Gerstel公司；65μmPDMS/DVS固相萃取纤维：美国Sigma-Aldrich Supelco公司；synergyHIMF+Take3全功能酶标仪：美国伯藤仪器有限公司；DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦科技有限公司。
1.3.1 干红葡萄酒制备工艺流程及操作要点
葡萄分选→除梗破碎→成分调整→酶解→接种酵母→酒精发酵→皮渣分离→后发酵（加入偏重亚硫酸钾抑制微生物生长）→静置澄清→成品
操作要点：
原料处理：挑选成熟度较好的、颗粒饱满、无害病的‘赤霞珠’葡萄果实，除梗、破碎。
成分调整：将除梗破碎后的葡萄浆液装入10L玻璃罐中，需留1/3的顶空间隙，加入50 mg/L偏重亚硫酸钾和600 mg/L二甲基二碳酸盐（又称维果灵）进行过夜灭菌处理[8]，24 h后按60 mg/L原料质量加入果胶酶，常温浸渍24 h，保证果胶酶活性充分发挥。
接种酵母、酒精发酵：将菌株按6%接种量接种酵母种子液（106CFU/mL），启动酒精发酵（发酵温度维持在25 ℃），发酵过程中每日检测还原糖和酒精度变化，并在早、中、晚进行压帽操作，当还原糖含量≤4 g/L，视为酒精发酵结束。
倒罐陈酿：皮渣分离后加入偏重亚硫酸钾（50 mg/L）终止发酵，恒温（25℃）静置澄清1个月后即得干红葡萄酒成品。
1.3.2 葡萄酒样品制备
在上述工艺流程基础上制备葡萄酒样品，设置对照组及混合发酵组，以菌株S.cerevisiae、M.caribbica单独发酵为对照组，编号分别为CK、MC；混菌发酵组分别为：S.cerevisiae与M. caribbica 1∶1接种发酵（TS1）；S. cerevisiae与M.caribbica 1∶10接种发酵（TS2）；S.cerevisiae与M.caribbica 10∶1接种发酵（TS3）；先接种M.caribbica 48 h后接种S. cerevisiae发酵（SX1）；先接种M. caribbica 72 h后接种S.cerevisiae发酵（SX2）。
1.3.3 葡萄酒理化指标检测
酒精度：参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]方法，采用蒸馏—酒精法测定酒精度；采用直接滴定法测定还原糖；采用电位滴定法测定总酸。花色苷：参照pH示差方法[10]。
1.3.4 挥发性风味成分分析
采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）检测挥发性风味物质[11]。
HS-SPME萃取条件：准确量取3 mL待测葡萄酒样于装有磁力搅拌转子的15 mL顶空瓶中，加入0.6 g的NaCl及4-辛醇内标溶液（5 μL），即刻旋紧顶空瓶瓶盖。 将装有待测酒样的顶空瓶置于磁力加热搅拌器工作台上，于45 ℃恒温条件下平衡15 min，然后将已活化好的65 μm PDMS/DVB固相微萃取纤维头插入顶空瓶内，注意调整好萃取纤维头与酒样之间的距离，避免接触到液面，于45 ℃恒温条件下萃取45 min。完成后取出萃取头立即插入GC-MS进样口解吸5 min，同时启动仪器进行数据采集。
GC条件：选用DB-WAX色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）；检测器及进样口温度分别为230 ℃和250 ℃；升温程序为初始温度40 ℃保持3 min，以2 ℃/min升至140 ℃，然后以7.5 ℃/min升至270 ℃，保持6 min；载气为高纯氦气（He）（99.999%）；色谱柱流量为1.78 mL/min，不分流进样。
MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源；电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度270 ℃；全扫描模式，质量扫描范围为30～450 m/z。
定性方法：根据美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14质谱数据库通过匹配度、保留时间及保留指数定性，并选择匹配度＞85%的成分为有效香气成分。保留指数（retention index，RI）根据以下公式计算，其中正构烷烃的碳原子数为C7～C30。
式中：n和n+1分别为待测组分前后正构烷烃的碳原子数，个；tn和tn+1为相应的正构烷烃出峰保留时间，min；tx为待测组分出峰保留时间，min，其中tn＜tx＜tn+1。
定量方法：采用内标法进行定量分析，挥发性风味物质含量计算公式如下：
1.3.5 气味活性值计算
衡量单一香气化合物对葡萄酒整体香气贡献程度常用的指标是挥发性香气化合物的气味活性值（ador active value，OAV），是挥发性香气化合物的浓度与嗅觉阈值的比值。 OAV＞1的香气化合物可能直接影响酒体香气，为关键挥发性风味化合物，0.1＜OAV＜1的香气化合物作为葡萄酒的潜在香气能增强酒体的香气及协调性[12]。OAV计算公式如下：
式中：Xi为香气物质的质量浓度，μg/L；OTi为香气物质的气味阈值，μg/L。
1.3.6 干红葡萄酒感官评价
参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]，选取经过感官培训的品评人员从色泽、澄清度、香气、滋味和典型性5个方面进行打分，满分100分。干红葡萄酒的感官评价标准见表1。
表1 干红葡萄酒的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of dry red wine
项目 评分要求 分数/分色泽（10分）澄清度（10分）香气（30分）滋味（30分）呈紫红色，富有光泽，酒体透亮呈宝石红色，具有光泽，整体较为协调，较为透亮呈暗红色，不具备色泽，不透亮澄清透明，无悬浮物略微暗淡，无明显悬浮物暗淡无光，有悬浮物香气丰满优雅，具有葡萄酒典型香气具有葡萄酒香气，味道淡，无异香不具有葡萄酒香气，有异香酒体醇厚协调、回味绵长酒体酸涩适中，柔和爽口酒体略显单薄，口味较纯正酒体寡淡、口感差、柔和度低具有明显典型性、优雅无缺、风味独特典型性（20分）典型性较好、有独特风味典型性一般、不够优雅不具有明显典型性7～10 4～6 0～3 7～10 4～6 0～3 20～30 10～19 0～9 26～30 19～25 9～18 0～8 16～20 10～15 6～9 0～5
1.3.7 数据处理
所有实验均重复3次，采用IBM SPSS（version 27）对葡萄酒理化指标和挥发性香气成分进行单因素方差分析；对气味活性值（OAV）＞0.1的17种香气成分进行主成分分析；采用软件Origin 2022绘图。
不同处理组酒样理化指标检测结果见表2。 由表2可知，对照组（CK）酒精度最高（14.20%vol），MC处理组酒精度最低（10%vol）；混菌发酵组同时接种酒精度的范围为13%vol～13.7%vol；混菌发酵组顺序接种酒精度的范围为12%vol～12.2%vol；顺序接种混菌发酵显著降低了酒精含量，与尤雅等[12]研究结果相似。混菌发酵酒样中酒精降低的原因可能是由于非酿酒酵母的氧化代谢消耗葡萄糖不完全形成酒精，通过其他途径转化为其他物质[13]。
表2 发酵结束后葡萄酒酒样的基本理化指标
Table 2 Basic physicochemical indexes of wine samples after fermentation
注：同一指标不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
处理单一发酵组CK MC SX2顺序接种SX1 TS1同时接种TS2 TS3还原糖/（g·L-1）酒精度/%vol总酸/（g·L-1）花色苷/（mg·L-1）3.58±0.01cd 14.20±0.20a 4.95±0.06a 353.88±0.02e 4.60±0.50a 10.00±0.10d 4.59±0.41b 366.66±0.57d 3.68±0.02c 12.20±0.50c 4.61±0.39ab 468.17±1.87a 3.71±0.11b 12.00±0.03c 4.57±0.03b 468.23±0.19a 3.57±0.43cd 13.50±0.1b 4.14±0.06c 378.05±0.05c 3.15±0.10e 13.00±0.10b 4.15±0.15c 366.76±0.25d 3.27±0.03d 13.70±0.20b 4.59±0.41b 450.91±0.93b
CK组和混菌发酵组还原糖含量均符合GB 15037—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]干红葡萄酒还原糖≤4 g/L的要求，其中顺序接种（SX1、SX2）处理组还原糖显著高于对照组CK（P＜0.05）。M.caribbica单一发酵组（MC）还原糖最高，为4.6 g/L，可能由于整个发酵过程中M.caribbica在葡萄酒生产中完全发酵的能力不够，还原糖代谢较慢的原因[14]。
7个组别中，对照组（CK）总酸含量最高，为4.95 g/L；其他发酵组总酸范围为4.14～4.61 g/L，总酸含量相差不大。总酸降低可能会改善葡萄酒的酸味，使得酸味协调，提升感官品质。 因此，M.caribbica参与发酵可以降低葡萄酒的总酸含量。
葡萄酒的色泽是衡量其品质的重要指标，而花色苷则是影响色泽的主要物质之一[15]。干红葡萄酒中花色苷含量通常在200～500 mg/L之间[16]。对照组（CK）花色苷含量最低，为353.88 g/L，M.caribbica参与发酵的处理组花色苷含量均显著高于对照组CK（P＜0.05），其中，SX2处理组花色苷含量最高，为468.23 mg/L，说明M.caribbica发酵有利于提高葡萄酒中花色苷的含量。
因此，M.caribbica参与发酵能够降低葡萄酒酸度，对提升葡萄酒中花色苷含量的提升具有积极作用。
干红葡萄酒中挥发性风味化合物检测结果见表3。 由表3可知，干红葡萄酒出检出挥发性风味化合物25种，包括酯类9种、醇类7种、酸类4种、醛酮类3种以及其他类2种。单一发酵组CK、MC分别检出挥发性风味化合物23种、21种，总含量分别为3 109.04 μg/L、3 227.86 μg/L；顺序发酵组SX1、SX2分别检出挥发性风味化合物22种、24种，总含量分别为3 101.91 μg/L、3 322.01 μg/L；同时接种组TS1、TS2、TS3分别检出挥发性风味化合物22种、22种、23种，总含量分别为2 997.26 μg/L、2 281.69 μg/L、2 612.48 μg/L，其中酯类化合物和醇类化合物种类较多。
表3 葡萄酒中挥发性风味化合物检测结果
Table.3 Determination results of volatile flavor compounds in wine
注：同一指标不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
序号 化合物 阈值/（μg·L-1） OAV 气味描述含量/（μg·L-1）CK MC SX1 SX2 TS1 TS2 TS3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 1 2 3 1 2酯类丁酸乙酯3-甲基丁酸乙酯己酸乙酯乙酸己酯庚酸乙酯丁二酸二乙酯月桂酸乙酯2-己烯酸乙酯辛酸乙酯小计醇类异丁醇1-辛醇1-壬醇香茅醇苯乙醇月桂醇3-甲基-1-戊醇小计酸类乙酸己酸辛酸正癸酸小计醛酮类4-辛酮β-大马酮癸醛小计其他十一烷苯乙烯小计总计56.80±2.59ab-549.63±166.73c 14.63±8.89bc 12.43±1.41ab 44.13±21.54a 8.60±14.89b 2.00±0.78ab 576.53±499.29e 1264.75±681.22b 72.33±11.20a-400.63±343.40d 4.76±6.53c 14.80±3.71ab 21.56±3.33a 30.70±7.35ab-1370.83±319.25b 1 915.61±201.26a-1.02±0.15a 616.0±303.56b 27.45±4.04a 21.92±3.23a 27.70±4.09a 44.28±15.08a-1313.01±192.69b 2 051.38±359.04a 41.70±6.44b 78.28±32.99ab 567.84±460.25 15.10±7.22b 17.33±4.35ab 33.56±8.02a 43.61±9.79a 0.49±0.02c 1 515.63±49.13a 2 313.54±346.74a 36.90±8.28b-751.5±169.80a 11.53±2.86bc 15.63±9.46ab 32.56±14.81a 41.66±17.47a-1 148.26±27.35c 2 038.04±157.12a 62.10±35.49ab-785.90±333.42a 16.93±2.30b 14.20±1.95ab 40.66±14.53a 33.33±17.62ab 2.20±0.30a-955.32±28.91c 67.34±5.42a 3.81±0.05a 641.47±129.32b 12.86±2.71bc 9.10±6.92b 47.23±0.74a 45.35±9.65a 1.57±0.02b 794.88±0.02d 1 623.61±154.75ab 20 0.2 8 150 2.2 15 500 0.02 2＞1＞0.1＞1＞1＞1＞1＜0.1＞1＞1酸果、草莓[17]菠萝甜香[18]香蕉、草莓[19]果香、梨香[20]菠萝、果香[20]葡萄、水果清香[19]花香、奶香[20]辛香料[15]玫瑰香，橙子花香[20]52.80±0.66b 22.83±1.45bc 13.50±5.38a 3.86±12.27a 729.66±29.44a 432.67±20.4b 7.53±0.28c 1 262.85±209.93a-24.36±4.3abc 6.23±0.94bc 21.93±11.42ab 522.90±152.58b 18.47±11.78c 7.80±1.38c 604.69±174.48bc 50.37±7.47b 35.24±4.68a 5.52±0.80bc 17.64±7.25ab 364.37±4.36b 30.46±3.11c 9.92±1.46abc 513.52±6.23c 42.89±11.18b 35.81±2.33a 10.85±1.37ab 22.66±17.64ab 556.56±35.21b-9.60±2.95abc 678.37±49.08bc 40.93±4.6b 29.90±10.3ab 10.10±4.78abc 17.30±5.31ab 362.56±14.37b 20.73±3.89c 12.16±2.29ab 493.68±17.90c 45.73±8.32b 16.93±7.83c 4.50±2.38c 13.10±6.17b 322.63±285.37b 511.57±9.24a 8.86±2.31bc 923.32±303.91ab 73.13±18.99a 32.64±6.97ab 8.05±1.68abc 17.42±3.70ab 477.71±11.59b 24.25±5.14c 13.60±2.77a 646.80±11.73bc 40 000 40 600 40 14 000 1 000 50＜1＞0.1＞0.1＞0.1＜0.1＞0.1＞0.1淡甜味、醇香[20]茉莉、柠檬香[20]水果香、蔷薇香[15]青草、柠檬、蔷薇[20]清甜的玫瑰花香[21]花香[20]青草、蘑菇[15]39.63±15.77a 53.03±31.84a 210.23±179.21a 157.83±7.16ab 460.72±138.78a 35.73±5.27a 95.56±29.44a 334.93±166.19ab 126.06±19.47a 592.28±180.18a 27.80±4.09a 62.17±30.56a 211.76±132.42ab 96.93±53.93b 398.66±212.83ab 34.93±2.36a 67.87±25.63a-106.21±33.49ab 209.01±138.78c 34.63±3.83a 44.33±28.90a 157.53±71.61b 99.56±18.58ab 336.05±86.06bc 40.30±5.50a 59.63±8.15a 144.40±0.6b 26.73±3.65c 271.06±17.91bc 28.26±6.002a 72.11±15.31a-120.73±45.72b 221.10±67.10bc 200 000 420 1 500 1 000＜1＞0.1＜1＞0.1醋酸味[19]奶酪、腐臭[20]奶酪、脂肪、腐臭[22]脂肪酸、不愉快味[19]13.23±5.26a-5.43±2.64b 18.66±2.70b 11.36±1.27a-4.53±0.29b 15.89±1.18bc 8.88±1.31a 11.20±0.52a——0.05 10＞1＞0.1甜苹果、李子、桃子[15，19]肥皂味、橘皮香[17]8.88±1.32d 9.93±0.20a 14.03±0.28a 5.63±0.26b 29.59±0.60a 10.63±1.97a-7.87±1.42a 18.5±3.40b 8.96±6.61a-2.47±0.35c 11.43±6.69cd 11.20±0.53cd 102.06±46.36a-102.06±44.70a 3 109.04 94.33±13.48a 5.06±2.13d 99.39±16.40a 3 227.86 114.47±62.20a 15.00±2.22a 129.47±62.20a 3 101.91 81.31±23.20a 10.19±0.95bc 91.50±28.48a 3 322.01 99.33±39.89a 11.66±5.82abc 110.99±22.13a 2 997.26 112.80±29.85a 7.76±1.05cd 120.56±31.64a 2 281.69 95.73±23.08a 14.04±2.98ab 109.77±37.22a 2 612.48 100＞0.1汽油、矿物质[15]
2.2.1 酯类化合物
酯类化合物是葡萄酒中最主要的一类挥发性化合物，是酵母发酵的副产物，会赋予酒体果香和花香[23]，对酒体香气有积极的影响[24-25]。 由表3可知，酯类化合物种类最丰富，CK样品酯类化合物为8种，SX2和TS3样品检出酯类化合物种类最多，均为9种；MC、SX1、TS1和TS2样品酯类化合物种类最少，为7种，其总含量为955.32～2 051.38 μg/L，且酒样间酯类化合物的含量存在显著差异（P＜0.05）。检出5种共有酯类化合物，为己酸乙酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯和月桂酸乙酯，其中，7组酒样中己酸乙酯浓度较大，会赋予酒体草莓、香蕉香气[23]，但月桂酸乙酯因阈值较大（OAV＜0.1）对酒样风味影响较小。处理组SX1、SX2、TS1的酯类物质含量显著高于对照组（CK）（P＜0.05），其中样品SX2酯类化合物含量最高（2313.54μg/L），表明顺序接种方式能够促进M.caribbica产生更多的酯类化合物。与样品SX2相比，样品SX1未检测出丁酸乙酯和2-己烯酸乙酯；样品TS1未检出3-甲基丁酸乙酯和2-己烯酸乙酯；样品TS2未检出3-甲基丁酸乙酯和辛酸乙酯。此外，处理组MC酯类物质含量显著高于对照组（CK）（P＜0.05），李旋等[14]研究表明，非酿酒酵母会比酿酒酵母产生更多的酯类，因此对葡萄酒香气化合物产生了影响。
2.2.2 醇类化合物
醇类化合物是酒类发酵过程中含量最高的一类化合物，多为糖类或氨基酸经酵母代谢产生，适度提高醇类物质含量能赋予酒体更丰富的香气，促进酒体香气的协调性[19]。各处理组中醇类物质含量为493.68～1 262.85 μg/L，占风味物质总含量的16%以上，是葡萄酒中的重要风味物质之一。
高级醇是果酒中重要的香气化合物，在总量低于300 mg/L时能增加香气的复杂性，赋予酒醇厚感，但高于300 mg/L时不仅会破坏饮料酒的口味，导致酒体辛辣苦涩，增添油臭味、汗臭味和腐败味等不良气味[26]。所有处理组葡萄酒高级醇含量均＜300 mg/L。 组别CK、SX1、SX3、TS1、TS2、TS3醇类化合物最多，均为7种；MC和SX2醇类化合物最少，均为6种。 混菌发酵组（SX1、SX2、TS1、TS3）醇类物质含量显著低于对照组（CK）（P＜0.05），TS1醇类物质含量最低（493.68 μg/L），WHITENER M E B等[27]研究表明，非酿酒酵母会降低醇类含量。 在7个组别中，一共检测出7种醇类化合物，而苯乙醇和异丁醇虽然浓度较大会赋予葡萄酒果香和花香[28]，但其阈值较大对酒体风味贡献较少（OAV＜0.1）。 除苯乙醇外，还检测出4种共有醇类物质，为1-辛醇、1-壬醇、香茅醇和3-甲基-1-戊醇，其中，1-辛醇含量最高，该物质在组别SX2中含量最高显著高于对照组CK（P＜0.05），因阈值较小对酒体风味具有协调作用（OAV＞0.1）；与对照组CK相比，MC未检测出异丁醇，SX2未检测出月桂醇。
2.2.3 酸类化合物
酸类化合物是葡萄酒发酵过程中酵母代谢的副产物，其浓度主要取决于酒的初始成分和发酵条件[23]。脂肪酸作为葡萄酒香气化合物中重要成分，浓度较低时呈奶油和奶酪香，浓度太高则会产生腐臭和酸涩味[29]。在本研究中，7个组别共检测出4种酸类化合物，含量为209.01～592.28 g/L，其中MC酸类化合物含量最高（592.28 μg/L），混菌处理组含量均显著低于对照组CK、MC（P＜0.05），SX2含量最低（209.01 μg/L），混菌发酵能够有效降低酸类化合物带来的不良气味。
2.2.4 醛酮类及其他类化合物
醛酮类化合物可为酒体提供水果香，但这类化合物不稳定，易进一步氧化成羧酸，使其含量降低[30]。由表3可知，SX2处理组醛酮类化合物含量显著高于对照组CK（P＜0.05），为29.59 μg/L。葡萄酒酒样中均检出4-辛酮，其中，CK组4-辛酮含量最高，混菌发酵组与对照组（CK）无显著差异（P＞0.05）；β-大马士酮是SX2酒样特有的风味物质，其具有强烈干果香气，增加了葡萄酒样的特征香气。 M.caribbica参与的发酵组中均检测出苯乙烯化合物，具有汽油、矿物质等不良香气，对葡萄酒香气有影响[15]。
综合对比，SX2处理组的酯类、醛酮类种类丰富含量较高，同时有效降低酸类含量，能够充分发挥M.caribbica的增香能力，丰富葡萄酒的香气层次。
为了进一步探究接种方式与香气化合物的相关性，选择葡萄酒酒样中OAV＞0.1的挥发性香气化合物进行主成分分析，结果见图1。
图1 基于气味活性值＞0.1的挥发性风味化合物不同酒样的主成分分析结果
Fig.1 Principal component analysis results of different wine samples based on volatile flavor compounds with odor activity value＞0.1
方差贡献率越大，越能反映样品的信息，样品间坐标距离越大，则差异越大[31]。 由图1可知，PCA能有效区分7组葡萄酒样，PC1和PC2分别占数据总方差的33.2%和27.8%，累计方差贡献率为61%。 对照组CK和混菌发酵组的数据均不在同一个象限之内，这表明混菌发酵对葡萄酒的风味产生了明显的影响。SX1和TS1处理组位于相同的象限内，并且与1-壬醇、正癸酸、癸醛、辛酸和香茅醇等化合物有很强的相关性；SX2的酒样和其他的酒样都不属于同一个象限，与3-甲基-1-戊醇、3-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、β-大马士酮香气化合物相关性大，其中3-甲基-1-戊醇赋予酒体青草、蘑菇的香气，乙酸己酯赋予酒体梨香、果香，β-大马士酮赋予酒体甜苹果、李子、桃子罐头香气；TS2、TS3和MC处理组在同一象限上，但TS3与MC、TS2处理组距离较远，TS3处理组与己酸、癸酸乙酯香气化合物相关性大，而MC和TS2处理组与己酸、癸酸乙酯香气化合物相关性大。因此，基于OAV＞0.1的挥发性香气化合物，可将不同样品区分开。
不同接种方案葡萄酒感官评价见图2。由图2可知，7个组别均存在差异。SX1、SX2样品感官评价总分分别为83分、83.67分，两组无显著性差异（P＞0.05）；在色泽、澄清度、香气三个方面，顺序接种组（SX1、SX2）感官评分较高；在典型性方面，单一发酵处理组MC与SX2表现较好。因此，SX2样品整体评价最高，其酒体色泽呈紫红色富有光泽，透亮澄清，无悬浮物，香气浓郁，酸涩适中柔和爽口，具有干红典型风味。
图2 不同接种方案葡萄酒感官评价Table 2 Sensory evaluation of wine samples with different inoculation schemes
本研究以卡利比克迈耶氏酵母与商业酿酒酵母进行混菌发酵制备‘赤霞珠’干红葡萄酒。样品SX2（先接种M.caribbica 72 h后接种S.cerevisiae）酒精度为12.00%vol，总酸为4.57 g/L，花色苷含量最高，为468.23 mg/L；挥发性风味化合物种类共检出25种，包括酯类9种、醇类7种、酸类4种、醛酮类3种以及其他类2种。5个混菌发酵组中SX2总量最高（3 322.01 μg/L），SX2处理组的酯类、醛酮类种类丰富含量较高，同时有效降低酸类含量；关键风味化合物（气味活性值OAV＞1）为己酸乙酯、乙酸己酯、庚酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯等。主成分分析（PCA）表明，基于OAV＞0.1的挥发性香气化合物，可将不同样品区分开。 感官评价表明，SX2酒样感官得分最高（83.67分），整体酒样呈紫红色富有光泽，透亮澄清，无悬浮物，香气浓郁，酸涩适中柔和爽口，具有干红典型风味。 综上所述，混菌发酵可改善‘赤霞珠’干红葡萄酒的品质，改变干红葡萄酒的香气特征，先接种M.caribbica 72 h后接种S.cerevisiae可最大程度地发挥M.caribbica的产香特征，在干红葡萄酒发酵中具有应用潜力。后期将利用转录组及代谢组学进一步分析该菌株产香机理，为其实现应用提供理论依据。
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