图1 酿酒酵母内源谷胱甘肽增香途径
Fig.1 Aroma enhancing pathway of endogenous glutathione from Saccharomyces cerevisiae
Research progress on aroma-enhancing effect of glutathione in fruit wine brewing
谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，是生物体中（包括植物、动物和真菌）最普遍存在的细胞内巯基物质，具有很强的抗氧化性。 酵母可产生GSH，同时也可以利用外源GSH作为营养物质，从而提高酵母抗逆性。其次，GSH也可作为脂质和多酚氧化反应中的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）清除剂，增强酵母抗氧化性，保护果酒香气。 基于此，GSH在果酒中作为抗氧化剂和增香酿造辅料被广泛应用。在葡萄酒酿造中，GSH已被国际葡萄与葡萄酒组织（International Office of Vine and Wine，OIV）列为合法添加剂，目前主要用于抗氧化和增香发酵。 近年来，国外对于GSH增香酿造的研究和应用较多，主要从抗氧化、前体物、酶促等方面讨论了GSH的作用。目前已有研究表明，GSH的添加显著提高了果酒中的某些硫醇类香气物质含量，以及增强了果酒的还原性香气特征[1-2]，但其作用机制尚不清楚。
本文从谷胱甘肽的抗氧化、酶促香气合成反应通路以及作为香气前体物等角度，对谷胱甘肽特别是酵母内源谷胱甘肽在增强果酒香气方面的研究进行了系统论述。 本文阐述了谷胱甘肽在果酒增香发酵过程中的“底物”和“酶促”双效应，综述了谷胱甘肽对果酒关键香气物质的保护和调控机制，讨论了谷胱甘肽调控下酿酒酵母、非酿酒酵母、富含谷胱甘肽的非活性干酵母、活性酵母细胞衍生物对香气物质的积极作用，为更加全面认识GSH调控果酒重要香气物质生成的分子机制，开发果酒酿造增香技术，提高果酒品质提供了理论基础和参考依据，以期为谷胱甘肽在果酒酿造中增香的进一步研究提供理论依据和参考。
香气是果酒风味品质的核心组成部分，果酒中已知的香气化合物有近1 000种，主要包括酯类、醇类、萜烯类、硫醇类、醛酮类等[3]。据现有文献研究报道，在酵母酒精发酵过程中，GSH可以通过以下三种方式影响果酒香气化合物形成（见图1），从而提高果酒香气质量。
图1 酿酒酵母内源谷胱甘肽增香途径
Fig.1 Aroma enhancing pathway of endogenous glutathione from Saccharomyces cerevisiae
高级醇、酯、酸、醛等是果酒中重要的香气物质[4]。在葡萄酒陈酿过程中，过度氧化会降低葡萄酒中重要芳香化合物含量，如酯类、酚类等。同时，其他不良化合物也会在处于低氧环境下的葡萄酒中积累，这些因素都会导致葡萄酒的感官特征发生变化，如香气减弱，发生褐变等[5]。GSH在酿酒过程中可作为强抗氧化剂抑制酚类化合物聚合以及限制葫芦巴内酯和邻氨基苯乙酮形成[6]，这两种物质分别与葡萄酒中的褐变反应和异味感知有关，有利于保护果酒香气质量。研究发现，在葡萄破碎过程中添加GSH可以增强葡萄酒抗氧化性，从而更好的保留葡萄酒中的香气物质[7-8]。
GSH的游离巯基部分赋予其独特的氧化还原和亲核性质，使其在葡萄酒储存期间对某些酯类和萜烯具有一定的保护作用[9]。此外，向葡萄酒中添加GSH可以有效减少醇类化合物的氧化。GSH的半胱氨酰残基可作为硫源，通过与反-2-己烯醛反应，形成谷胱甘酰-3-巯基己醛（gluthathione-3-sulfydryl-hexanal，Glut3SHal），从而增加多功能硫醇的浓度[2，10]。同时，GSH还可以减少储存期间多功能硫醇的降解[8]，并抑制部分芳香酯和萜烯醇的减少，如乙酸异戊酯、己酸乙酯、芳樟醇和α-萜品醇等。此外，GSH还可以减少储存过程中乙醛的积累[11]。
不同的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株会产生不同的香气化合物，酵母菌株的选择对果酒的风味和香气有重要影响[12]。发酵醪中的GSH浓度取决于酵母菌株和果汁初始的GSH浓度。 在酒精发酵期间，酵母菌产生或利用GSH，发酵醪中GSH浓度会相应的增加[13-14]或减少[15-16]，谷胱甘肽还原酶也可将氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG）还原为GSH，维持GSH水平[17]。
非酿酒酵母（non-Saccharomyces）在酿造过程中可以产生酶类物质，如果糖基转移酶、木聚糖酶等酶类[18]，有利于水解糖苷类成分释放出芳香化合物，赋予果酒花香和果香味，增强果酒香气复杂性。如美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）可显著表达β-葡萄糖苷酶和β-裂解酶活性，从而促进游离萜烯和挥发性硫醇的释放，同时还可以提高GSH浓度[19]。
诱导酿酒酵母高表达香气物质合成酶以及提高其活性是提高香气物质生成量的有效手段，GSH浓度会随酒精发酵期间酵母活性的增强而增加[20-21]。研究表明，GSH可调控酵母活性，以3-巯基己醇（3-sulfanyl hexanol，3SH）的酶促合成为例，在3SH合成通路前体物解离释放相关酶的催化作用对于其生成量起决定性作用[22]，其合成路径见图2。其中谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase，GST）的主要功能是催化亲核性的GSH与反-2-己烯醛的结合反应生成Glut3SHal[23]，但GST在葡萄汁以及酒精发酵过程中进行的酶促反应机制研究还未见报道。有关β-裂合酶在解离C-S键释放3SH的研究显示，外源添加半胱氨酸β-裂合酶能够促进半胱氨酰-3-巯基己醇（cysteinyl-3-sulfydryl-hexanol，Cys-3SH）解离释放，而且过表达STR3p基因的酿酒酵母合成3SH能力显著提高[24]，此外，有研究发现[25]，酿酒酵母IRC7p基因的失活突变很常见，会降低C-S键β-裂合酶的表达与活性从而导致挥发性硫化合物的产生量减少。 嗅觉阈值更低的3-巯基己基乙酸酯（3-sulfanyl hexyl acetate，3SHA）是3SH的乙酸酯，在酿酒酵母作用下由3SH与乙酸酯化形成，受醇乙酰转移酶的调控，后者由ATF1基因编码，敲除CYS3、CYS4或MET17基因的酿酒酵母菌株3SH和3SHA的产量显著提升，而单独敲除SER1或SHM2基因的菌株3SH和3SHA产量有所降低[26-27]。 由此说明GSH通过调控酿酒酵母合成3SH关键酶的表达与活性来调控3SH的生成，从而影响果酒质量。
图2 酿酒酵母代谢合成3-巯基己醇和3-巯基己基乙酸酯酶促调控路径
Fig.2 Enzymatic regulatory pathway for the metabolic synthesis of 3-sulfanyl hexanol and 3-sulfanyl hexyl acetate in Saccharomyces cerevisiae
1.3.1 硫醇类香气化合物
硫醇是指包含巯基（-SH）官能团的化合物，GSH对硫醇具有一定的保护作用。GSH在陈化过程中可保护品种硫醇不被氧化[28]。试验表明在添加有GSH的葡萄酒在装瓶储存3年后，其3SH浓度更高[29]。挥发性硫醇可以赋予果酒果味或热带水果风味，如4-甲基-4-巯基-戊烷-2-戊酮（4-methyl-4-sulfanyl-pentan-2-pentanone，4MSP）、3-巯 基 己 醇（3SH）和3-巯基己基乙酸酯（3SHA）等化合物[30]。它们是果酒中发现的最有效的香气成分，可以使果酒呈现葡萄柚、百香果、黑加仑、番石榴、荔枝等香气特征[31-32]。 挥发性硫醇通常具有非常低的感知阈值，在某些情况下可降至万亿分之一的水平。3SH在葡萄酒中的感官检测阈值最高，为60 ng/L，其次是3SHA和4MSP[32]。 其中3SH是公认的果酒果香特征的重要贡献物质，也可作为新型香料广泛应用于食品行业，是果酒发酵增香调控的重要基础。然而，葡萄酒中存在的部分挥发性硫醇，都与难闻的气味有关。根据葡萄酒成分的不同，在储存过程中完全不受氧气影响的葡萄酒的瓶装陈酿过程中，可能会出现“还原”特征[33]。 这些香气特征主要归因于H2S和甲硫醇的存在，它们赋予了葡萄酒臭鸡蛋、污水、烧焦橡胶和腐烂的香气[34]。研究表明，在低氧环境且有铜存在的情况下，GSH更容易创造一个有利于挥发性硫化合物积累的环境。 与未经处理的葡萄酒相比，在装瓶前用谷胱甘肽处理的葡萄酒在装瓶陈酿过程中积累了更高的H2S水平[35]。因此，在酿酒的不同阶段添加谷胱甘肽可能对挥发性化合物的形成有深远的影响，这些挥发性化合物对葡萄酒的感官特性有积极或消极的影响。
GSH天然存在于葡萄中并在葡萄成熟过程中积累，其浓度受葡萄品种、葡萄栽培以及酿酒实践的影响而变化。研究表明，在粉碎后不久的长相思葡萄果汁中添加GSH可以保护硫醇不被葡萄和葡萄酒氧化过程中形成的邻醌氧化，GSH可能会与邻醌结合从而减少香气损失，并在葡萄酒中产生更多的挥发性硫醇[36-37]。
1.3.2 果酒中硫醇类香气代谢路径
硫醇前体生物合成发生在浆果中，并已有研究证明其与氨基酸和GSH的生物合成密切相关[38]。挥发性硫醇是一种具有强烈气味的分子，它们大多数不存在于葡萄汁中，主要通过两种途径形成。 其中一种形成途径是在酒精发酵过程中，酿酒酵母将半胱氨酸化和谷胱甘肽化前体转化而形成[39]。葡萄中谷胱甘肽化前体的含量一般低于半胱氨酸化前体，并且在发酵过程中，只有少量的前体会转化为相应的挥发性硫醇。如Cys-3SH对3SH和3SHA的转化率在0.1%～12%之间，而谷胱甘酰-3-巯基己醇（Cys-3SH）的转化率不到5%[40]。 半胱氨酸和谷胱甘肽偶联物也可以通过碳-硫键的裂解产生有气味的挥发性硫醇，从而将果香硫醇类香气物质释放到葡萄酒中[41]。
另一种形成途径是将酿酒酵母在酒精发酵过程中产生的H2S或者是另一种硫供体直接添加到反-2-己烯醛或4-甲基-3-戊烯-2-酮等共轭羰基化合物上[37]。果汁中GSH可以与反-2-己烯醇和反-2-己烯醛经过多步酶促反应合成3SH和3SHA。有研究表明，向完成发酵的长相思葡萄酒中添加质量浓度为10 mg/L或20 mg/L的GSH后再进行储存，待陈酿阶段完成后葡萄酒中3SH含量将明显升高，同时，3SHA的降解也得到延缓[42]。果酒发酵过程中GSH和反-2-己烯醛合成3SH以及3SHA的合成通路见图3[43-44]。
图3 果酒中以谷胱甘肽为前体物的3-巯基己醇及3-巯基己基乙酸酯的合成通路
Fig.3 Synthetic pathways of 3-sulfanyl hexanol and 3-sulfanyl hexyl acetate with glutathione as precursor in fruit wine
挥发性香气物质的组成及含量与果酒品质息息相关，基于香气物质的生物合成的调控对提高果酒香气质量具有重要意义。GSH既天然存在于水果中，也可由酵母在发酵过程中代谢产生，是对酵母发酵与产香具有重要作用的功能性三肽化合物。GSH直接或间接参与的相关香气物质的合成[45]，主要包括醇类、酯类、醛类、萜烯类、酸类等。
高级醇是指具有3个以上碳原子的一元醇的混合物，普遍认为对果酒香气影响显著[46]。当果酒中高级醇质量浓度在111～200 mg/L范围内时，果酒的醇厚感明显增强，香气也会变独特；当高级醇质量浓度达到300 mg/L时，会呈现出令人愉悦的风味；而当高级醇质量浓度＞400 mg/L时，果酒会产生令人不悦的气味和粗糙感。醇类化合物的形成与酿酒酵母细胞氧化还原状态有关。 研究发现，GSH有利于维持酵母细胞的还原状态。在还原状态下，醛可以通过还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）还原成相应的醇类化合物；在氧化状态下，醇则可以被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）氧化成挥发性羧酸[47]。 葡萄酒中高级醇的含量可以根据氨基酸的组成来确定，而氨基酸是葡萄酒中可供同化氮的主要来源，GSH有利于维持游离态氮的稳定性[48]，从而有利于高级醇的形成。
酯类化合物大多数是在酒精发酵期间由酯化过程和次级酵母代谢形成的[49-50]，是果酒果香特征重要的香气物质[51-52]。酯类物质会直接影响葡萄酒的香气特征和感官，如苯甲酸乙酯、乙酸丁酯和9-癸烯酸乙酯，这些物质都可以赋予葡萄酒果香，增强果酒香气浓郁度。研究表明，其含量均随着GSH的添加而增加，但是其他大部分酯类含量都随GSH的添加而减少[52]。 如在葡萄酒陈酿和贮藏过程中，GSH的巯基基团赋予酯类物质独特的氧化还原和亲核特性，因此可以抑制某些酯类化合物减少，从而赋予葡萄酒果香和花香特征[6]，特别是玫瑰香、水果、柑橘以及香水气味。 试验表明GSH可抑制德比娜葡萄酒中乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等几种挥发物含量减少[8]。这种差异可能是由于GSH抑制乙醛被氧化成相应的羧酸，从而抑制了醇和酸的酯化反应。
醛类化合物是在发酵期间由酵母的初级代谢形成或由醇的氧化形成的重要芳香化合物，其中乙醛占果酒总醛含量的90%以上[53]，是葡萄酒中含量最高的醛类化合物。不同含量浓度醛类化合物赋予果酒不同的风味，低含量的醛能赋予果酒令人愉悦的果香，而较高浓度的醛则会带来刺激性气味[53]。研究发现，向果酒中添加GSH可以降低乙醛含量，并加快乙醛含量下降速度[22]，这可能是因为以下两个原因：一方面，GSH有利于形成还原性环境，使乙醛被还原成乙醇；另一方面，GSH的亲核残基能够与乙醛形成四面体加合物[54]，从而降低乙醛含量。
萜烯类化合物由于感官阈值偏低，花香味道很强烈，因此它对果酒的香气贡献尤为突出。尽管在一些果酒中萜烯类物质的浓度可能会低于其感官阈值，但是他们之间可以通过协同作用对果酒整体香气产生贡献。大多数萜烯在发酵期间会被相应的萜氧化物取代，芳樟醇则可以转化为α-萜品醇，嗅觉阈值更高。 研究发现在苹果酒和葡萄酒中添加GSH都可以增加果酒储存过程中芳樟醇等的产量[47]。
果酒中的酸类化合物主要来源于水果本身。它们是通过多种生物反应合成的，如通过乳酸代谢产生的乙酸、酯酶作用产生的辛酸、丁酸等短链脂肪酸。 挥发性酸类化合物于浓度低时可增强果酒香气复杂性，但其浓度升高时则会产生消极作用[55]。 研究表明，在石榴酒中添加GSH含量对挥发性酸类物质没有显著影响，不会对果酒香气产生消极作用[56]。
果酒酒精发酵过程中，酵母内源GSH不仅可以作为酵母营养物质，还具有抗氧化作用等，谷胱甘肽对酵母生长及代谢的影响表1。此外，在果酒酿造过程中外源添加高产谷胱甘肽的酵母，也有利于果酒香气，提升果酒品质。
表1 果酒酿造过程中谷胱甘肽对酵母生长及代谢的影响
Table 1 Effect of glutathione on yeast growth and metabolism during fruit wine brewing
谷胱甘肽对酵母的影响 作用机制 参考文献抗氧化影响S，N代谢甲醇胁迫下协助酵母生长清除细胞体内氢过氧化物调控酵母活性解毒作用营养物质阻止由于缺乏抗氧化系统导致的酵母细胞死亡，增加香气物质合成。GSH的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶突变体对H2O2和超氧阴离子高度敏感，增加醇类物质含量。作为酵母细胞的S源和N源，增加流动率。酵母通过以谷胱甘肽作辅助因子的S-甲酰甲醛脱氢酶系统来清除甲醇，减少甲醛含量。清除体内的活性氧，增加醇类物质含量，保护细胞内含巯基酶活性。GSH可增强酵母活性，增加香气物质合成。GSH有利于减少细胞对硒（Se）和镉（Cd）的摄取，防止多种酶系统失活。与酵母菌株自身的遗传背景、代谢能力以及环境因素有关，可增加香气物质含量。[5][57-58][59-61][60-61][58-59，62][22][63][64]
酿酒酵母在发酵前期吸收发酵醪中的GSH，在酒精发酵结束后释放GSH。细胞中GSH的生物合成涉及两个连续的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）依赖性反应，由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-gluta-mylcysteine synthetase，γ-GCS）（GSH I）和谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GS）（GSH II）催化。其中第一步反应是由谷氨酸和半胱氨酸形成二肽γGlu-Cys，这一步受到GSH的反馈抑制，在转录和翻译后水平上受到控制，因此是限速步骤；第二步是由GSH II催化，将γ-Glu-Cys与甘氨酸结合形成GSH[65]。水果中天然存在的GSH含量相对较低，其果酒中GSH的含量与发酵过程中的反应以及酵母的代谢活动密切相关[66-67]。接种不同的酵母菌株，发酵结束后果酒中的GSH浓度存在一定差异。KRITZINGER E C等[68]研究表明，初始GSH浓度可能会影响葡萄酒的最终GSH浓度。 当初始浓度较低时，发酵期间的GSH浓度保持相对恒定；而当初始浓度较高时，葡萄酒中的GSH浓度则较低。然而，GSH浓度高的果汁不一定意味着葡萄酒中的GSH浓度也高[15]。这是因为不同的菌株发酵时间不同，导致酒精发酵结束时GSH浓度无法确定。GSH可以通过调控酿酒酵母的代谢影响这些香气成分的产生，有些果酒生产商就利用这一点，通过给酵母提供富含GSH的营养物质，以影响其代谢进而增强果酒的香气[69]。
果酒的香气不仅受到酿酒酵母调节，还受到非酿酒酵母的调节[70]。非酿酒酵母通常来源于原料或者酿造过程外源添加，大多数情况下，非酿酒酵母不能单独完成发酵。在发酵前期它能够产生大量的糖苷酶类，并且加快某些香气物质的生成速度，如高级醇类、酯类等，可以显著影响果酒风味质量[71]。如β-葡萄糖苷酶可水解果汁中与糖苷结合的香气前体物质，产生醇、酯、酸、萜烯等挥发性香气化合物，从而提升果酒的香气[72-73]。HU K等[74]研究表明使用葡萄汁有孢汉逊酵母这种非酿酒酵母发酵的葡萄酒中单帖含量发生了显著增加。此外，GAO Y等[75]研究表明，与单一接种酿酒酵母相比，添加非酿酒酵母进行混菌发酵可以产生更高浓度的GSH，如毕赤酵母（Pichia pastoris）在发酵过程中能够达到比酿酒酵母更高的细胞密度，从而产生更多的GSH。 KONG C L等[76]将毕赤酵母和酿酒酵母混合发酵还可以增加挥发性香气化合物的含量，包括高级醇、酯和苯乙基化合物，增强了果酒的果香味。此外，LIU J等[77]研究表明，采用贝氏酵母（Saccharomyces bayanus）与戴尔凯氏有孢圆酵母（Porulaspora delbrueckii）混合（1∶1）发酵时，苯乙醇含量显著增加，而辛酸和辛酸乙酯则显著降低。此外，通过共培养发酵，猕猴桃酒中香气成分辛酸乙酯、己酸乙酯等增加，果酒香气更加浓郁。
非活性干酵母（inactive dry yeast，IDY）是指在有氧环境中将酿酒酵母经高浓度糖培养基上培养后再经过热灭活制得的干酵母制品。研究表明，某些非酿酒酵母具有良好的GSH生产潜力，因此更适合用于活性或灭活干酵母制剂[78]。在葡萄酒中添加富含谷胱甘肽的非活性干酵母（glutathioneenriched inactive dry yeast，g-IDY）可以有效增加GSH的含量，减少H2S产生，增强果酒抗氧化性，酒的果香性、挥发性香气浓度更高，葡萄酒的口感也更好，同时可以更好地保护硫醇类及萜烯类物质[79-81]。添加g-IDY的葡萄酒可以略微增加芳樟醇含量[82]，并显著增强了其典型香气，这可能是因为非活性干酵母释放的挥发性化合物与葡萄酒本身的挥发性化合物相互作用，并对某些特定挥发性化合物有抗氧化作用，从而导致发酵过程中酵母副产物发生了变化。陈晓姣等[83]研究表明，在梨酒发酵时添加g-IDY可以显著提高其抗氧化能力，总风味物质和总酚含量也有所提高，并且有利于香气化合物的形成，从而提高了梨酒品质。 氨基酸对果酒的香气也会产生一定的影响，这是因为它是多种香气成分的前体物质。LIU D等[84-85]研究发现，在猕猴桃汁发酵时接种g-IDY对猕猴桃酒中的香气物质与氨基酸含量有积极影响，但这种影响程度因g-IDY浓度而异。
用紫外线、热、X-射线或化学损伤刺激酵母细胞，会发生应激反应，产生活性酵母细胞衍生物（live yeast cell derivative，LYCD）进行自我保护。由于酵母衍生物具有改善酒精发酵以及在发酵早期阶段保护果酒免受氧化功能，因此向果汁中添加酵母衍生物对提升果酒香气可以起到一定的积极作用[85]。GSH是LYCD中的一种重要成分，是细胞内最重要的抗氧化剂。马超颖等[86]研究发现，LYCD在过氧化氢的作用下，可以通过增强GSH I和GSH II的转录和翻译，从而提高细胞内GSH含量，最终增加果酒香气，提升果酒品质。
本文综述了谷胱甘肽特别是酵母内源GSH增强果酒香气的作用机制，总结了GSH对果酒中高级醇、酯类、醛类、萜烯类等关键香气物质的合成的影响，凝练了酿酒酵母内源GSH作为前体物参与3SH合成以及调控酿酒酵母合成3SH关键酶表达与活性的双重效应机制。在今后的研究中还应进一步对GSH在调控酶促合成香气物质方面的机制进行探究和验证，更为深入地解释GSH对果酒增香酿造的机制。 此外，大鲵低聚糖肽等其他产香肽也具有增强果酒香气的作用，在未来的研究中也可以对其他产香肽展开深层次研究，以便更加有效快捷地增强果酒香气，从而提升果酒品质，为我国果酒产业高质量发展以及果酒市场繁荣发展提供参考。
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