Research progress of solid-state pure culture equipment and technology
固态发酵（solid-state fermentation，SSF）技术常用于工业微生物的发酵生产，是在近乎无水的固态基质上进行的发酵活动，在此过程中，微生物在固体物料表面或内部生长繁殖，对底物进行分解与转化[1]。工业微生物是指那些在工业生产中被用于生产各种产品如食品、饮料、药品、生物燃料、化工原料等的微生物，包括细菌和真菌，如芽孢杆菌、酿酒酵母和黑曲霉等。相较于液态发酵，SSF不仅有助于生成次级代谢产物、单细胞蛋白、蛋白酶、糖化酶等高价值的生物活性产品[2]，还可作为一种高效环保的生物工艺[3]。但在工业生产中，莫纳克林K（Monacolin K，MK）[4]、酱油曲精[5]以及黑曲霉孢子制种等[6]SSF生产技术目前大多处于人工塑料瓶发酵阶段或小规模的托盘发酵阶段。随着工业生产规模增大，采用固态发酵反应器生产是目前限制固态纯培养技术用于现代生物反应工程的一个重要因素[7]。
固态生物反应器是一种模拟生物生长环境的工程设备，为细胞或酶提供适宜的生长和反应条件，广泛应用于生物制药、食品工业、环境工程等多个领域。 固态生物反应器的核心功能在于控制和优化生物过程，包括温度、pH值、氧气供应和外加营养物质等的精确调控。 本文介绍了适合纯培养的不同固态发酵反应器的种类及原理，总结了影响发酵效果的因素（温度与传热过程、通风与传质过程、灭菌和接种过程及物料含水量和pH），阐述了固态纯培养技术在发酵类食品中的应用，并展望了未来固态发酵反应器的研究前景。 旨在通过不断优化和改进固态纯培养技术，提高发酵产物的产量和质量，推动固态发酵技术在实际工业中的应用。
固态发酵反应器是纯培养的基础，适合纯培养的反应器主要有5种：托盘式反应器、转鼓式反应器、搅拌式反应器、旋转圆盘式发酵反应器和压力脉动固态发酵反应器。根据通气方式和搅拌情况，反应器可以分为四类：无通风无搅拌、强制通风无搅拌、无通风连续搅拌、强制通风连续搅拌。 根据基质的运动情况可以分为两类：静态固态发酵反应器和动态固态发酵反应器[8]。 其中，传统的托盘式反应器的结构设计最简单，物料经过灭菌和冷却后被放置在托盘中，在罐内进行灭菌处理。但其空间利用率不高，只能通过增加托盘表面积和托盘数量实现，规模扩大时效率受限[9]。PORTILHO L C D等[10]使用托盘生物反应器在长米中生产昆虫病原真菌分生孢子菌Anisopliae ICB 425的分生孢子，使用一相传热模型预测床内的最高温度发现，7 cm的床深度是塔盘生物反应器的极限，对大规模生产分生孢子非常有利。但托盘式反应器传热主要依赖于空气的对流机制，发酵物料的层厚受限，适用于培养种曲和真菌孢子等。
转鼓式反应器、搅拌式反应器、旋转圆盘式反应器以及压力脉动固态发酵反应器的原理依然是“三传一反”，即包括微生物和发酵基质之间的代谢反应，固体物料、液态水膜、空气和微生物之间的热质传递，以及在通风和混合过程中的动量传递[11]。在这些过程中，传质和传热是两个关键的挑战。由于固态物料在传热和传质方面的阻力，发酵床中的温度、湿度、营养物质和代谢物的浓度在空间和时间上的分布不均匀。 随着反应器体积的增加，这种不均匀性会变得更加显著[12]。
转鼓式反应器适用于大规模生产，能够提供良好的物料混合和通风条件，但设计和操作较为复杂。转鼓式反应器是一种多相反应系统，由基质层、气相空间和转鼓壁等组成，通常采用水平圆柱形设计。内部可能配备有刮板以增强固态物料的混合，通过整体旋转来提高物料的均匀性[13]。在实验室规模下，它们通常围绕水平轴旋转；而在工业规模的发酵中，其设计类似于回转窑和转筒干燥机，使用托轮支撑并驱动[14]。
转鼓式发酵器的转速范围较广，对于有氧发酵，其转速一般为2～3 r/min，最快可到40～50 r/min。 由于真菌菌丝体对转速有敏感性，操作时需根据发酵需求调整转速，以确保发酵效率和产物的品质[15]。 DHILLON G S等[16]在12L转鼓式生物反应器中进行柠檬酸固态发酵，采用响应面法得出最佳条件为：萃取时间20 min，搅拌速度200 r/min，萃取剂体积15 mL。在此优化条件下，柠檬酸萃取量最高（294.19 g/kg）。ALKOAIK F N等[17]考察转鼓式反应器的隔热条件对番茄植物残渣堆肥性能的影响，结果表明，隔热层能提高抵抗生物反应器热量损失的总体阻力，将温度提高至55～67 ℃，获得了成熟、稳定、老化且高品质的堆肥。在非保温生物反应器中，堆肥温度不超过37 ℃，这导致微生物活性下降，堆肥过程仅处于中温范围，最终可能导致未成熟的堆肥中含有杂草种子和病原体。
搅拌式反应器通过机械搅拌改善基质的混合和传质，适用于需高剪切力的发酵过程。 通常分为两种主要类型：立式和卧式。卧式反应器根据其搅拌机制可进一步细分为转轴式和转筒式[18]。这种反应器集混合、灭菌、冷却、接种和发酵等步骤于一身，通过搅拌和通气操作，可以显著提升氧气的传递效率，满足微生物对氧气的需求。此外，搅拌还能提供良好的混合效果，确保发酵物料的一致性，从而提高发酵的整体效率[19]。然而，在设计和操作搅拌式反应器时，必须考虑剪切力对真菌菌丝体可能产生的负面影响，防止因搅拌过度而导致菌丝受损。 通过精心选择搅拌器的类型、调整搅拌速度以及优化反应器的操作参数，可以显著提升产物的产量和品质，满足工业化生产的标准。JOHNSON M等[20]推导了一个非绝热传热模型，用于研究实验室0.5～40 L的夹套搅拌式分批反应器的传热过程。通过考虑总冷凝器从过程中除去的热量以及过程盖的损失，该模型能够在实验测量的不确定性范围内预测过程温度曲线。 夹套负荷测量表明，反应堆容器内的蓄热量比预期大，相当于40 L规模的过程流体蓄热量的60%，对夹套搅拌式分批反应器内过程温度的准确建模具有减轻热失控风险和增强过程控制的潜力。 ESCAMILLA-RUÍZ I A等[21]设计了一种方形搅拌式反应器，使用计算流体动力学和非侵入式激光多普勒风速仪研究了搅拌器的阻力以及系统的几何参数对流体动力学行为的影响，并基于对三个转速（180 r/min、1 000 r/min和2 000 r/min）的时间序列分析，用于检测油箱内部的宏观不稳定性。 结果表明，由于雷诺数和圆柱搅拌器产生的料流排放，在罐的上部形成了流型和大涡旋结构。 此外，增加气缸直径对再循环回路的数量以及整个系统的能量消耗均有影响，整个系统在存在湍流的情况下表现出更好的性能。
旋转圆盘式反应器能提供良好的氧气传递和热量分布，适用于对剪切敏感的微生物。其具有出色的密封性，能有效防止外部微生物的污染，可以精确控制发酵所需的温度和湿度条件。 该设备还便于自动化监控和调节温度、湿度，是国内固态发酵领域的先进设备之一。 发酵床通常采用动力驱动的旋转圆盘设计，这不仅消除了发酵过程中的死角，而且与进料、铺平和出料等环节相结合，实现了机械化操作，简化了生产流程[22]。此外，旋转圆盘式发酵反应器能够与生产线上的其他设备无缝集成，构建了一个自动化程度较高的生产系统。 在工业生产中，这种反应器特别适用于发酵周期较短的产品。ZAHAN K A等[23]采用4 L转盘反应器（rotary disc reactor，RDR）进行木醋杆菌0416生产微生物纤维素的实验，结果表明，影响RDR中微生物纤维素生产的最主要因素是pH值，其次是接种量浓度、圆盘旋转速度和发酵周期。在圆盘旋转速度7 r/min，pH值5.0，发酵周期4 d，接种量10%（V/V）的条件下，微生物纤维素的最高干质量为28.30 g。SHARMA C等[24]以细菌和酵母共生菌群的经济红茶肉汤作为培养基，使用静态、静态间歇补料批次和旋转圆盘式反应器3种模式生产细菌纳米纤维素。结果表明，在旋转圆盘式反应器中，细菌纳米纤维素产量最高，为（1.0±0.2）g/L，而水保留值（86%～93%）和含水量（85%～93%）在3种模式下均较高。
压力脉动固态发酵反应器通过周期性压力变化改善传质和传热，适用于需强制通风的发酵。 压力脉动固态发酵反应器的设计消除了传统机械搅拌和动密封的需求，增强了系统的密封性能，提升了操作的安全性，尤其适合于纯种固态发酵过程，是一种先进的生物发酵设备。该反应器通过在封闭的低压容器内周期性地施加气相压力脉动，促进了固态发酵过程中的传质和传热效率。 这种周期性的压力变化使得固态培养基中的气相传质从分子扩散转变为强制对流扩散，有效解决了SSF中常见的传热和传质问题[25]。压力脉动固态发酵反应器已在多个行业中得到应用，包括生产抗生素、酶制剂、有机酸、食品添加剂、生物农药和生物肥料等[26]。LIU J等[27]在由麦麸和玉米芯制成的固体培养基中培养康宁木霉，研究压力脉动对固态发酵反应器固体多孔床的冷却作用。 结果表明，压力脉动可增强介质中的水分蒸发，从而提高散热效率；通过改变压力脉动方向，能够减轻生物反应器中的温度梯度；压力脉动可以为微生物提供最佳温度和中等含水量的生长环境。YANG G等[28]研究了在压力脉冲生物反应器中气压振幅对嗜热菌（Thermomyces lanuginosus）SD-21产耐高温木聚糖酶的影响。研究表明，在周期性压力SSF过程中，空气压力幅值是关键的控制参数，得出最佳周期压力下限幅值为0.05 MPa，上限幅值为1.5 MPa。与常规托盘发酵罐相比，压力脉冲生物反应器中嗜热菌SD-21产酶量提高了45.13%。
在SSF过程中，传热是指由温度差引起的热能传递过程，主要分为对流、传导和蒸发。三种传热方式具体操作分别为：向设备中引入无菌空气，或者通过设备内部的滚动和搅拌，促进空气对流，实现热量的有效传递；通过控制夹套中流体的温度，可以对固态发酵系统进行热传导，以维持所需的温度条件；通过向物料喷洒无菌水，并引入无菌干燥空气，通过调节空气湿度和水的蒸发速率，可以对物料的温度进行精确控制。
微生物的生长和代谢活动对温度非常敏感，过高或过低的温度都会影响微生物的活性 （除嗜冷嗜热微生物外），进而影响发酵效率和产物质量。在红曲菌SSF过程中，通过将发酵温度从30 ℃转移到23 ℃，MK产量提升近20倍，其原因可能是，30 ℃是菌体的最适生长温度，而不是生成MK的最适生长温度，低温刺激红曲从生长期转变为稳定期，从而大量生成次级代谢产物[29]。
固态基质的导热系数通常较低，导致传热效率不高，容易造成热量积累和温度分布不均。 为了提高传热效率，PESSOA D R等[30]通过传热数学模型和基于计算流体动力学（com-putational fluid dynamics，CFD）的模拟方法，描述和预测发酵过程中的温度分布和传热特性。这样可以减少发酵实验的数量，降低中试和生产规模的实验开发成本。此外，改进反应器设计、使用高效的传热介质、调整操作参数等措施也有助于实现热量的均匀分布，从而提高发酵效率和产物质量。
在SSF过程中，气体（以O2、CO2为代表）传质是其主要的传质物质。 由于固态基质缺乏自由流动的水相，气体传递和物质交换面临较大挑战，这要求对通风系统进行精心设计和调控。 通风不仅为微生物提供必需的氧气，还负责移除二氧化碳和其他代谢产物，同时对发酵床的水分和温度平衡起到调节作用[31]。SHIBAI H等[32]从工业角度研究了O2和CO2对肌苷发酵的影响。结果表明，在罐式发酵罐和摇瓶中，充足的氧气供应对于维持肌苷的高产率必不可少，缺氧会导致肌苷的产生受到抑制。 除了充足的氧气供应外，通风也必不可少，因为二氧化碳的增加会降低细胞产生肌苷的能力。
传质过程涉及底物、产物和代谢物在固态基质中的扩散，其效率受基质的多孔结构和不均匀性影响。 为了提升氧气传质效率，可以采取增大通气量、增大搅拌速度、添加渗透液或使用表面活性剂等多种方法。 为了散热，可以通入潮湿的空气再配合一定程度的搅拌，通入潮湿的空气可以帮助维持培养基的湿度，而搅拌则可以提高热量的分布均匀性，从而更有效地散热[33]。 此外，通过数学建模和CFD模拟，可以预测和优化物质在发酵床中的传递路径，为反应器设计和操作提供指导。 这些措施的综合应用，有助于提高传质效率，同时避免过度干燥或温度过高，确保发酵过程的稳定性和产物质量[30]。
在反应器放大过程中，灭菌的彻底性和接种的均匀性直接影响到接种后的微生物生长和代谢产物的合成。灭菌步骤旨在彻底消除可能污染发酵过程的微生物，包括耐热性强的芽孢，从而为发酵菌株提供无菌的生长环境。李桢[34]提出生物反应器的清洁/灭菌设计要点。原位清洗（clean in place，CIP）和原位灭菌（sterilize in place，SIP）是自动化的过程，可以提高清洗和灭菌的可重现性和有效性。JUNKER B等[35]设计、构建、启动并验证了一种新的连续灭菌系统，使用高性能Process Manager控制器扩展了现有的基于霍尼韦尔Total Distributed Control 3000的控制系统，可用于次级代谢产物培养、生物转化和酶生产的培养基灭菌。
接种过程则需要精确控制接种量和接种均匀性，以确保发酵过程的一致性和产物的稳定性。在放大反应器中，接种技术通常涉及将预先培养好的微生物菌液均匀喷洒到冷却后的灭菌基质中。 为了实现这一目标，可以采用多级喷嘴系统或特殊的喷雾装置，以确保在整个反应器内实现接种均匀性。此外，接种后的初期生长阶段需要密切监控，以评估微生物的生长状况和发酵基质的物理特性，如湿度和透气性，这些因素都会对最终产物的质量和产量产生影响[7]。
物料含水量直接影响到培养基的物理性质，包括氧气和营养物质的传递效率以及微生物代谢产生的热和废物的排除速度。适宜水分条件有助于维持微生物的活性和生长速率，过高含水量会导致基质结块，孔隙率降低，不利于气体交换且容易染菌；过低的含水量会导致基质不能吸收充足的水分膨胀，微生物难以获取充足的养分[36]。同时，水分含量的变化也会影响培养基的pH值，因为水分是pH缓冲系统中的关键组成部分，水分的多少会影响缓冲能力，从而影响pH的稳定性。 此外，TORIJA M J等[37]研究发现，铵盐对培养基的pH有很大的影响，易引起基质快速酸化，可添加一些有机酸进行缓冲或用有机氮源替代铵盐。
在反应器放大过程中，必须确保物料含水量和pH值在整个发酵体系中的均匀性和稳定性。这要求对反应器的设计进行精细调整，以实现有效的水分和pH控制。 如可以采用多层分布的传感器网络来实时监测不同部位的水分含量和pH值，并通过自动化控制系统进行调节。此外，反应器的设计应考虑到水分蒸发和代谢热产生的影响，通过合理的通风和冷却系统来维持适宜的水分，并保持pH值在微生物生长和产物合成的最佳范围内。
传统SSF技术主要应用于食品领域，可以用于生产有机酸、固态醋、酱油等。 相比于液态发酵，固态纯培养技术为微生物提供了一个接近自然的生长环境，优势在于对环境友好、成本低、能耗小、可利用资源丰富，并且能够生产出一些在液态发酵中难以获得或产量较低的高价值产品。
柠檬酸是应用广泛的发酵有机酸之一，广泛用于饮料、食品、洗涤剂、化妆品和制药行业。 丝状真菌黑曲霉（Aspergillus niger）是柠檬酸生产的主要菌种，是工业上重要的细胞工厂[38]。WEST T P[39]考察了黑曲霉菌株支持农业加工副产物SSF生产柠檬酸的能力。 研究发现，苹果渣、香蕉皮、葡萄渣和橙皮等农产品加工副产物更有利于支持较高水平的柠檬酸合成，黑曲霉菌株在SSF过程中产生的柠檬酸水平取决于所利用的农业加工副产品的糖含量。
固态醋是一种传统的酸性调味品，相较于液态醋，固态醋具有色泽深艳、香气浓郁、酸味柔和、回甜醇厚等特点。 除了调味，食醋还具有缓解疲劳、促进食欲、软化血管等保健功效[40]。 醋酸杆菌（Acetobacter）是进行醋酸发酵的主要微生物，能够将乙醇（酒精）氧化成醋酸（乙酸），这是固态醋酿造过程中的关键生化反应。 在固态醋的生产中，选择具有高醇酸耐受性的醋酸杆菌菌株非常重要，因为这些菌株能够在较高的乙醇和醋酸浓度下生存并保持活性。郑宇等[41]结合原料、工艺对3个地区的37种食醋样品进行分析发现，乙酸和乳酸含量占总有机酸含量的80%以上，是传统食醋中含量最高且风味贡献最大的主体有机酸。
酱油是一种传统调味品，通过发酵大豆、小麦、盐和其他原料制成。 米曲霉是酱油酿造过程中的主要微生物之一，它能够分泌多种酶，包括蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，这些酶负责将大豆和小麦中的复杂有机物质分解成更简单的化合物，如氨基酸和糖类，这些是构成酱油风味的基础[42]。 LIU H等[43]探究了低盐固态发酵酱油（low-salt solidstate fermented soy sauce，LSFSS）和高盐稀释态发酵酱油（high-salt diluted-state fermented soy sauce，HDFSS）之间的差异。研究表明，鲜味、咸味和甜味是HDFSS的特征味，而酸味和苦味是LSFSS的特征味。此外，HDFSS呈现出烟熏、酒精、花香、果味和类似焦糖的香气属性，而LSFSS则主要呈现出酸味和麦芽香气属性。
近年来，固态纯培养技术应用越来越广泛，应用范围涵盖食品、制药和环保等领域。随着固态反应器规模扩大，发酵设备需克服传质、传热、灭菌和均匀接种等问题。需不断探索和揭示SSF的机理和规律，不断完善固态纯培养技术和相关的固态生物反应器。 随着对固态纯培养技术和设备的研究不断深入，可以进一步优化发酵罐结构和技术，提高发酵产物的产量和质量。新的固态纯培养发酵系统的探索有助于开发更加高效、经济、环境友好的固态生物反应器，推动反应器向着智能化、信息化迈进。
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