世界酱香型白酒核心产区主要分布在北纬28°赤水河流域，主要坐落在仁怀产区和习水产区[1-3]。至2023年，酱香型白酒总销售收入约2 300亿元，同比增长约7.1%，利润为940亿左右，已成为国内外最受欢迎的白酒之一[4]。酱香型白酒工艺复杂，遵循“12987”工艺进行生产，各产区酒体风味感官层次分明，经多年存储后，形成“微黄透明、酱香突出、酒体醇厚、回味悠长、空杯留香持久”的典型特征[5-7]。酱香型白酒中98%左右的成分主要是乙醇和水，其余2%的成分是微量或痕量的香气成分，涵盖酸类、酯类、醇类及醛酮类等物质[8-10]，各种物质的含量及相互之间的量比关系共同决定了酱香型白酒的独特风格及复杂的酒体结构。截止目前，关于酱香型白酒特征风味成分的研究尚未见统一的定论，因此，对酱香型白酒的组分剖析仍是研究的热点问题。
目前，获取白酒风味组分数据的仪器主要有气相色谱（gas chromatography，GC）仪[11-13]、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪[14-16]、高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）仪[17-19]及液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）仪[20-22]等，研究通常利用仪器所收集数据并结合现代分析技术对目标酒体特征风味进行解析和挖掘。如许忠平等[23]采用GC-火焰离子检测器（flame ionization detector，FID）技术对不同工艺酱香型白酒中的挥发性风味成分进行定性定量分析，并结合主成分分析（principal component analysis，PCA）等化学计量学手段探究不同工艺酱香型白酒品质特征；罗兰等[24]采用GC-FID、HPLC及LC-MS对酒样中的几十种挥发性风味成分进行定量，并结合偏最小二乘-判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）实现目标酒样中挥发性风味成分的判别分析，找到对油味缺陷型酱香型白酒贡献度较高的特征风味化合物；刘家欢等[25]采用感官定量描述性分析（sensory quantitative descriptive analysis，SQDA）、气相色谱-嗅闻（gas chromatographyolfactometry，GC-O）、顶空-固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）等多方法联用技术分析不同产区酱香型白酒的风味特征。 由此可见，成熟的检测和研究方法是白酒特征风味解析、酒体差异判别等研究的关键。
在白酒检测中，气相色谱/气相色谱-质谱主要测定白酒中的挥发性组分，王金龙等[26]应用GC-FID建立了同时定量白酒中45种挥发性成分的检测方法，但该方法主要检测的是白酒的挥发性骨架组分。为了深入剖析一些量微香大的白酒组分，本研究通过色谱柱、萃取剂种类及萃取时间的优选，采用分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME） 结合气相色谱-质谱联用技术建立酱香型白酒微量挥发性香气成分的检测方法，并进行方法学考察。将该方法应用于仁怀和习水产区酱香白酒中微量挥发性香气成分的检测，以期为检测技术发展及白酒的质量控制提供参考和支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
酱香型白酒样品RH-A、RH-B、RH-C产自仁怀产区，XS-A、XS-B、XS-C产自习水产区，均购买于白酒销售市场。
1.1.2 试剂
氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙醚、正己烷、无水乙醇（均为色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；2-辛醇、2-甲氧基-3-甲基吡嗪（纯度均≥99.0%）：默克化工技术（上海）有限公司；乙酸异丁酯、2-甲基丁酸乙酯、1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷、2-庚酮、3-己醇乙酸己酯、4-甲基戊醇、二甲基三硫、2-壬酮、3-辛醇、2-羟基丁酸乙酯、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、壬酸乙酯、辛醇、5-甲基-2糠醛、DL-2-羟基己酸乙酯、2-十一烷酮、己酸乙酯、戊酮酸乙酯、2-乙酰基-5-甲基呋喃、糠酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙醛、壬醇、2-糠醇、丁二酸二乙酯、（2,2-二乙氧基乙基）-苯、十一酸乙酯、2-十三烷酮、乙酸苯乙酯、十二酸乙酯、苯甲醇、苯丙酸乙酯、十三酸乙酯、2-乙酰基吡咯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、十七酸乙酯、十八酸乙酯、二甲基二硫、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、四甲基吡嗪、乙酰苯、苯甲酸乙酯、愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚等标准品（纯度均≥98.0%）：阿拉丁试剂（上海）有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
8890A-5795B型气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司；QT-1旋涡混合器：上海琪特分析仪器有限公司；OEM型电子精密天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 内标溶液及标准溶液的配制
内标溶液：分别准确称取一定质量的2-辛醇和2-甲氧基-3-甲基吡嗪于烧杯中，用体积分数53%的乙醇溶液溶解，转至100 mL容量瓶中，采用体积分数53%的乙醇溶液定容，配制成终质量浓度分别为23.62 mg/L的2-辛醇和20.24 mg/L的2-甲氧基-3-甲基吡嗪内标溶液。其中，2-辛醇用于定量混合组分1（乙酸异丁酯、2-甲基丁酸乙酯、1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷、2-庚酮、3-己醇乙酸己酯、4-甲基戊醇、二甲基三硫、2-壬酮、3-辛醇、2-羟基丁酸乙酯、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、壬酸乙酯、辛醇、5-甲基-2糠醛、DL-2-羟基己酸乙酯、2-十一烷酮、己酸乙酯、戊酮酸乙酯、2-乙酰基-5-甲基呋喃、糠酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙醛、壬醇、2-糠醇、丁二酸二乙酯、（2,2-二乙氧基乙基）-苯、十一酸乙酯、2-十三烷酮、乙酸苯乙酯、十二酸乙酯、苯甲醇、苯丙酸乙酯、十三酸乙酯、2-乙酰基吡咯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、十七酸乙酯、十八酸乙酯），2-甲氧基-3-甲基吡嗪用于定量混合组分2（二甲基二硫、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、四甲基吡嗪、乙酰苯、苯甲酸乙酯、愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚）。
标准溶液：分别准确称取组分1和组分2中的各标准物质于100 mL容量瓶，用体积分数53%的乙醇溶液溶解并定容至刻度线，得到组分1的混标母液（各标准物质的终质量浓度为18.58～60.62 mg/L）和组分2的混标母液（各标准物质的终质量浓度为8.26～12.50 mg/L）。
系列标准溶液：分别将组分1和组分2的混标母液，用体积分数53%的乙醇溶液逐级稀释2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍和500倍，得8个系列标准溶液。
1.3.2 样品前处理
使用移液枪准确吸取2 mL酒样置于25 mL刻度试管中，加入8.6 mL饱和食盐水，再分别加入2-辛醇和2-甲氧基-3-甲基吡嗪内标溶液各10 μL，最后加入2 mL萃取剂（乙醚-正己烷（1∶1）），盖上试管塞并涡旋萃取2 min，静置分层后，吸取上层清液于进样小瓶，待上机检测。
1.3.3 气相色谱-质谱检测条件
（1）混合组分1气相色谱检测条件：DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气（He），流量1.0 mL/min，不分流，升温程序为初始温度40 ℃，保持2 min；以2.5 ℃/min升至100 ℃，保持1 min；再以5 ℃/min升至160 ℃，保持1 min；再以7 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。
（2）混合组分2气相色谱检测条件：DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），载气He，流量1.0 mL/min，不分流，升温程序为初始温度40 ℃，保持2 min；以8 ℃/min升至80 ℃；再以2.5 ℃/min升至120 ℃；再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。
（3）质谱分析条件：电子电离（electronionization，EI）源，电子能70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度250 ℃，传输线温度250 ℃，扫描范围m/z 30～500 amu，扫描速度5.6 spestra/s。
1.3.4 前处理及检测条件优化
以习水产区酒样为研究对象，以每个峰与最大峰的面积比作为相对峰面积，选择相对峰面积≥1%的有效峰进行统计，在1.3.3的基础上，对色谱柱（DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-WAX毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm））、萃取剂（乙醚、正己烷、乙醚-正己烷（1∶1））及萃取时间（0.5 min、1.0 min、1.5 min、2.0 min、2.5 min）进行优化。
1.3.5 方法的定性定量
定性：未知化合物经美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）20谱库检索、标准品比对及保留指数（retention index，RI）法[27]进行定性。
定量：采用2-辛醇和2-甲氧基-3-甲基吡嗪分别作为组分1和组分2的内标物。以目标化合物含量与内标物含量的比值（x）作为横坐标，以目标化合物峰面积与内标物峰面积比值（y）作为纵坐标建立标准曲线，进而对酒样中的成分进行半定量。
1.3.6 方法学考察
微量组分的检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）按照GB/T 27415—2013《分析方法检出限和定量限评估》执行[28]；选择习水产区XS-A样品，分别添加100 μg/L、500 μg/L、1 000 μg/L 3水平的59种混标进行加标回收实验，按照GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》计算加标回收率；同一样品间隔进样6次，按照最优前处理及检测条件测定各微量挥发性香气组分的含量并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）[29]。
1.3.7 方法的拓展应用
按照最优前处理及检测条件对酒样RH-A、RH-B、RH-C、XS-A、XS-B、XS-C中的微量挥发性香气成分含量进行检测，并基于结果进行PLS-DA。
1.3.8 数据处理
利用MassHunter查看色谱图、绘制标准曲线及整理检测结果；利用Tbtools v1.047绘制热图；利用SIMCA-P14.1进行层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、偏最小二乘判别分析；利用Origin 2022进行绘图。
2 结果与分析
2.1 前处理及检测条件优化
2.1.1 色谱柱的优选
色谱柱差异通常会影响白酒风味组分的分离效果[30]，因此，考察不同色谱柱对习水产区酒样中微量挥发性香气化合物的分离效果，以酚类物质分离效果进行对比，结果见图1。 由图1可知，使用DB-WAX毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）时，在保留时间34.7～35.5 min之间，峰b3（4-甲基愈创木酚）和b4（4-乙基愈创木酚）存在重叠的现象，且整体出现集中出峰的现象；而使用DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）时，各物质分离效果良好，主要原因是色谱柱的极性差异导致的，其中DB-FFAP毛细管色谱柱是极性柱，适用于分离酚类物质。因此，选择DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）为最优色谱柱。
图1 不同色谱柱对酱香型白酒中酚类成分分离效果的影响
Fig.1 Effect of different chromatographic columns on the separation of phenolic components in sauce-flavor Baijiu
a-1、b-1：愈创木酚；a-2、b-2：4-甲基愈创木酚；a-3、b-3：苯酚；a-4、b-4：4-乙基愈创木酚；a-5、b-5：4-甲基苯酚；a-6、b-6：4-乙基苯酚。
2.1.2 萃取剂的优选
萃取剂使用的原理是物质之间的相似相溶[31]。考察乙醚、正己烷、乙醚-正己烷对习水产区酒样中微量挥发性香气化合物的萃取效果，选择相对峰面积≥1%的有效峰进行统计，结果见图2。由图2可知，单独使用乙醚能够萃取酒样中57个组分，单独使用正己烷能够萃取酒样中43个组分，而使用乙醚-正己烷（1∶1）混合萃取剂能够萃取出酒样中85个组分，表明不同性质的萃取剂对酒样中微量组分具备选择性萃取差异。 此外，正己烷与乙醚混合使用能够抑制乙醚的挥发，保障了萃取样品的稳定性。因此，选择最佳萃取剂为乙醚-正己烷（1∶1）混合萃取剂。
图2 不同萃取剂对酱香型白酒中微量挥发性香气成分萃取效果的影响
Fig.2 Effect of different extractants on the extraction of trace volatile aroma components in sauce-flavor Baijiu
2.1.3 萃取时间的优选
萃取时间长短影响萃取剂对微量组分的萃取效率[32]，因此，考察不同萃取时间对习水产区酒样中微量挥发性香气化合物的萃取效果，选择相对峰面积≥1%的有效峰进行统计，结果见图3。由图3可知，萃取时间＜2 min时，萃取不完全，萃取组分未达到最佳；萃取2 min时，萃取组分数量最多，有效峰数达到85%；萃取时间＞2 min之后，萃取剂存在挥发情况，萃取组分略有降低，且直接增加了前处理时间。因此，选择最佳萃取时间为2 min。
图3 不同萃取时间对酱香型白酒中微量挥发性香气成分萃取效果的影响
Fig.3 Effect of different extraction time on the extraction of trace volatile aroma components in sauce-flavor Baijiu
2.2 方法学考察
2.2.1 定性分析结果
按照最优前处理及气相色谱-质谱检测条件对混标母液进行测定，GC-MS总离子流色谱图见图4。由图4可知，两个组分的色谱图基线平稳，各峰之间具有较好的分离效果，峰形对称完整，组分1的出峰顺序依次为乙酸异丁酯、2-甲基丁酸乙酯、1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷、2-庚酮、3-己醇乙酸己酯、4-甲基戊醇、二甲基三硫、2-壬酮、3-辛醇、2-羟基丁酸乙酯、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、壬酸乙酯、辛醇、5-甲基-2糠醛、DL-2-羟基己酸乙酯、2-十一烷酮、己酸乙酯、戊酮酸乙酯、2-乙酰基-5-甲基呋喃、糠酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙醛、壬醇、2-糠醇、丁二酸二乙酯、（2,2-二乙氧基乙基）-苯、十一酸乙酯、2-十三烷酮、乙酸苯乙酯、十二酸乙酯、苯甲醇、苯丙酸乙酯、十三酸乙酯、2-乙酰基吡咯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、十七酸乙酯、十八酸乙酯；组分2的出峰顺序依次为二甲基二硫、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、四甲基吡嗪、乙酰苯、苯甲酸乙酯、愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚。
图4 目标微量挥发性香气物质的GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.4 Total ion chromatogram of target trace volatile aroma compounds analyzed by GC-MS
2.2.2 标准曲线、检出限及定量限
按照最优前处理及气相色谱-质谱检测条件对标准曲线溶液进行测定，各目标挥发性香气物质的保留时间、特征离子、标准曲线回归方程、相关系数（R2）及检出限、定量限见表2。由表2可知，组分1中各种微量挥发性香气组分的保留时间在9.687～61.122 min之间，组分2中各种微量挥发性香气组分的保留时间在8.787～36.764 min之间，各组分的质量浓度与峰面积成良好的线性关系，相关系数（R2）为0.996 3～0.999 9，检出限为0.15～2.43 μg/L，定量限为0.28～6.07 μg/L。此外，二甲基三硫、2-乙酰基吡咯等组分所呈现的标准曲线回归方程相关系数低于其他物质，究其原因可能是溶剂对组分萃取差异所导致。
表2 目标微量挥发性香气物质的保留时间、特征离子、标准曲线回归方程、相关系数、检出限和定量限
Table 2 Retention time, characteristic ions, standard curve regression equation, correlation coefficient, detection limit, and quantitation limit of target trace volatile aroma components
组分 序号 化合物 保留时间/min 特征离子 标准曲线回归方程 相关系数（R2） 检出限/（μg·L-1） 定量限/（μg·L-1）1234567891 0 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40乙酸异丁酯2-甲基丁酸乙酯1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷2-庚酮3-己醇乙酸己酯4-甲基戊醇二甲基三硫2-壬酮3-辛醇2-羟基丁酸乙酯1-辛烯-3-醇苯甲醛壬酸乙酯辛醇5-甲基-2糠醛2-十一烷酮DL-2-羟基己酸乙酯己酸乙酯戊酮酸乙酯2-乙酰基-5-甲基呋喃糠酸乙酯癸酸乙酯苯乙醛壬醇2-糠醇丁二酸二乙酯（2,2-二乙氧基乙基）-苯十一酸乙酯2-十三烷酮乙酸苯乙酯十二酸乙酯苯甲醇苯丙酸乙酯十三酸乙酯2-乙酰基吡咯十四酸乙酯十五酸乙酯十七酸乙酯十八酸乙酯9.687 10.969 11.862 16.337 16.805 20.668 22.675 26.238 26.629 26.743 28.135 29.732 33.655 33.986 34.872 36.070 36.729 36.789 37.195 37.496 37.788 38.062 38.393 39.016 39.301 39.689 40.187 41.758 42.537 45.195 45.674 46.385 47.890 48.058 49.704 50.894 52.510 54.958 59.159 61.122 43、56 57、102 103、47 43、58 59、55 43、56 56、69 126、79 58、43 59、83 59、41 57、43 105、106 88、101 56、55 110、109 58、71 69、87 117、99 99、129 109、124 95、112 88、101 91、92 56、55 98、81 101、129 103、91 88、101 58、43 104、43 88、101 79、108 104、91 88、101 94、109 88、101 88、101 88、101 88、101 y=0.677 0x+0.033 1 y=0.428 9x+0.030 9 y=0.496 1x+0.018 5 y=0.856 7x-0.001 2 y=0.573 3x-0.054 1 y=0.754 2x-0.000 2 y=0.537 9x-0.001 7 y=0.639 6x-0.031 9 y=0.910 3x-0.003 4 y=0.303 1x-0.001 7 y=0.440 7x-0.001 4 y=0.952 8x-0.004 1 y=0.586 8x-0.001 8 y=0.789 4x-0.004 5 y=0.315 1x-0.001 2 y=0.275 3x-0.001 7 y=0.923 2x-0.003 2 y=0.674 9x-0.011 9 y=0.486 1x-0.003 5 y=0.213 4x-0.000 1 y=0.693 6x-0.002 8 y=0.998 7x-0.002 0 y=0.848 2x-0.050 62 y=0.801 3x-0.001 4 y=0.325 6x-0.002 6 y=0.463 5x-0.004 8 y=0.799 5x+0.001 4 y=0.764 2x-0.002 5 y=0.888 7x-0.008 1 y=0.864 9x-0.009 8 y=1.265 5x+0.033 2 y=0.913 1x-0.010 6 y=0.326 5x-0.002 5 y=0.902 6x-0.004 2 y=0.843 1x-0.005 8 y=0.501 2x-0.054 2 y=0.814 4x-0.002 2 y=0.576 1x-0.003 6 y=0.359 7x-0.008 2 y=0.403 1x-0.054 2 0.999 4 0.999 9 0.998 7 0.999 9 0.999 6 0.998 9 0.999 4 0.996 5 0.999 6 0.999 7 0.998 3 0.998 9 0.999 8 0.999 6 0.999 2 0.999 9 0.999 7 0.999 8 0.999 3 0.999 9 0.999 9 0.999 9 0.999 6 0.999 5 0.998 8 0.998 1 0.998 5 0.999 4 0.998 2 0.999 3 0.999 8 0.998 9 0.999 3 0.999 1 0.999 0 0.996 3 0.999 5 0.999 7 0.996 6 0.998 6 1.82 0.27 2.02 0.34 0.18 1.62 0.28 0.34 0.17 0.25 1.84 0.20 1.81 0.16 0.40 2.43 1.37 0.42 1.01 0.78 1.89 0.31 1.59 0.42 1.87 1.54 0.80 0.44 0.32 1.60 0.17 0.77 0.46 1.37 0.43 0.61 0.22 0.47 0.83 1.95 4.54 0.68 5.04 0.85 0.45 4.05 0.69 0.85 0.42 0.63 4.60 0.50 4.52 0.40 1.00 6.07 3.43 1.05 2.53 1.95 4.72 0.78 3.99 1.05 4.68 3.86 1.99 1.09 0.81 4.01 0.43 1.91 1.15 3.44 1.08 1.52 0.54 1.17 2.07 4.89
续表
组分 序号 化合物 保留时间/min 特征离子 标准曲线回归方程 相关系数（R2） 检出限/（μg·L-1） 定量限/（μg·L-1）2 1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19二甲基二硫2-甲基吡嗪2,5-二甲基吡嗪2,6-二甲基吡嗪2-乙基吡嗪2,3-二甲基吡嗪2-乙基-6-甲基吡嗪三甲基吡嗪2,3-二乙基吡嗪2,3-二甲基-5-乙基吡嗪四甲基吡嗪苯乙酮苯甲酸乙酯愈创木酚4-甲基愈创木酚苯酚4-乙基愈创木酚4-甲基苯酚4-乙基苯酚8.787 13.696 15.539 15.728 15.948 16.427 17.773 18.526 20.469 20.717 21.188 26.449 26.731 30.935 32.830 33.685 34.202 35.101 36.764 94、79 94、67 108、42 108、42 107、80 108、67 122、39 122、42 121、136 135、136 136、54 105、77 105、77 109、124 138、123 94、66 137、152 108、107 107、122 y=1.303 1x-0.020 1 y=0.329 9x+0.000 4 y=0.688 1x+0.000 5 y=0.749 5x-0.000 5 y=1.161 1x-0.000 1 y=0.608 0x+0.000 4 y=1.166 8x-0.000 2 y=1.163 1x-0.000 2 y=1.594 4x-0.000 1 y=2.252 1x-0.000 3 y=1.763 8x-0.000 7 y=2.545 4x-0.000 6 y=3.587 3x-0.000 1 y=1.457 1x-0.000 6 y=1.562 0x-0.000 3 y=2.067 2x-0.000 4 y=3.366 1x-0.001 6 y=1.735 4x-0.000 2 y=3.898 3x-0.001 1 0.996 6 0.999 8 0.999 8 0.999 8 0.999 6 0.999 8 0.999 7 0.999 5 0.999 9 0.999 8 0.999 3 0.999 8 0.999 6 0.999 9 0.999 5 0.999 8 0.999 9 0.999 6 0.999 7 0.43 0.52 0.40 1.01 0.60 0.24 0.32 0.58 0.24 0.25 0.95 0.15 0.52 0.31 0.38 0.51 1.21 0.94 0.20 1.08 1.31 0.99 2.52 1.51 0.59 0.79 1.44 0.61 0.63 2.38 0.38 1.31 0.78 0.96 1.27 3.03 2.34 0.51
2.2.3 加标回收率和精密度试验
方法的加标回收率和精密度试验结果见表3。由表3可知，各微量组分的平均加标回收率为93.00%～103.94%，说明该方法的回收率较好，能满足白酒中59种微量组分的检测需求。 此外，通过间隔6次重复测试，精密度试验结果的相对标准偏差为0.34%～6.30%，表明该方法的精密度良好，能满足常规检测需求。
表3 加标回收率及精密度试验结果
Table 3 Results of spiked recovery rates and precision tests
组分 序号 化合物 本底值/（μg·L-1）加标测定值/（μg·L-1）100 μg·L-1 500 μg·L-1 1 000 μg·L-1 1 12 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18乙酸异丁酯2-甲基丁酸乙酯1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷2-庚酮3-己醇乙酸己酯4-甲基戊醇二甲基三硫2-壬酮3-辛醇2-羟基丁酸乙酯1-辛烯-3-醇苯甲醛壬酸乙酯辛醇5-甲基-2糠醛DL-2-羟基己酸乙酯2-十一烷酮1 666.62 65.87 2 013.35 256.65 103.05 1 216.19 207.65 254.54 126.65 88.25 1 081.76 49.35 1 356.98 120.31 299.74 1 421.13 87.44 59.28 1 759.58 161.82 2 104.15 351.34 205.61 1 313.21 302.33 355.11 216.69 186.85 1 175.25 146.02 1 453.78 223.32 389.78 1 517.11 189.12 158.55 2 168.35 561.45 2 510.33 753.21 602.55 1 714.58 709.32 735.96 621.35 571.33 1 586.81 546.19 1 885.46 619.83 773.99 1 968.72 586.33 563.28 2 656.11 1 061.86 3 011.35 1 250.61 1 101.12 2 206.19 1 199.15 1 244.56 1 116.63 1 052.32 2 061.66 1 041.66 2 348.98 1 110.32 1 279.33 2 436.45 1 066.44 1 038.68平均加标回收率/%97.42 98.22 96.67 97.80 100.76 98.57 98.05 98.62 95.99 97.21 97.50 98.42 100.57 100.64 94.28 102.34 99.79 99.34 RSD/%3.29 1.65 4.29 2.25 1.27 1.14 2.48 1.80 4.38 1.02 3.17 1.26 3.74 1.71 3.46 5.43 1.55 1.18
续表
组分 序号 化合物 本底值/（μg·L-1）加标测定值/（μg·L-1）100 μg·L-1 500 μg·L-1 1 000 μg·L-1平均加标回收率/%RSD/%19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 2 12 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19己酸乙酯戊酮酸乙酯2-乙酰基-5-甲基呋喃糠酸乙酯癸酸乙酯苯乙醛壬醇2-糠醇丁二酸二乙酯（2,2-二乙氧基乙基）-苯十一酸乙酯2-十三烷酮乙酸苯乙酯十二酸乙酯苯甲醇苯丙酸乙酯十三酸乙酯2-乙酰基吡咯十四酸乙酯十五酸乙酯十七酸乙酯十八酸乙酯二甲基二硫2-甲基吡嗪2,5-二甲基吡嗪2,6-二甲基吡嗪2-乙基吡嗪2,3-二甲基吡嗪2-乙基-6-甲基吡嗪三甲基吡嗪2,3-二乙基吡嗪2,3-二甲基-5-乙基吡嗪四甲基吡嗪乙酰苯苯甲酸乙酯愈创木酚4-甲基愈创木酚苯酚4-乙基愈创木酚4-甲基苯酚4-乙基苯酚737.58 568.84 413.46 218.33 5 196.22 343.16 1 605.50 3 104.57 990.68 31.29 109.02 1 248.02 172.29 591.74 400.45 96.21 321.53 454.70 141.63 33.45 528.02 1 666.62 93.24 390.64 247.97 708.57 126.30 170.78 238.77 158.20 102.48 184.69 716.73 95.03 139.83 187.00 180.88 422.08 702.99 174.53 293.24 836.52 668.34 511.43 314.33 5 289.62 440.56 1 795.55 3 201.56 1 086.55 129.54 206.12 1 346.22 273.12 688.76 503.41 192.21 418.52 550.76 243.52 134.46 623.22 1 766.35 190.36 491.62 343.18 811.36 228.26 265.65 335.89 253.64 210.28 279.31 822.58 193.84 239.25 284.38 285.46 531.08 811.42 276.35 398.86 1 243.65 1 101.91 916.38 714.24 5 722.56 815.61 2 105.34 3 618.28 1 468.83 529.38 615.32 1 742.39 683.21 1 095.66 921.32 604.16 816.38 963.52 636.33 533.68 1 034.28 2 200.92 590.24 886.62 742.94 1 202.52 621.32 665.72 720.15 650.23 612.46 676.64 1 209.72 582.66 631.86 679.23 683.42 925.44 1196.99 668.66 788.48 1 717.58 1 523.84 1 413.46 1 228.33 6 111.22 1 338.12 2 595.52 4 114.52 1 988.68 1 044.29 1 111.44 2 229.27 1 153.54 1 572.99 1 381.7 1 077.46 1 302.78 1 435.95 1 122.88 1 014.7 1 509.27 2 647.87 1 074.49 1 371.89 1 229.22 1 689.82 1 107.55 1 152.03 1 259.02 1 178.47 1 122.73 1 204.94 1 736.98 1 115.28 1 160.08 1 207.92 1 201.13 1 442.33 1 723.24 1 194.78 1 313.49 99.38 100.54 99.52 98.73 96.72 97.13 93.00 100.24 97.10 99.72 99.53 98.40 100.38 98.64 101.75 98.57 98.03 98.65 99.65 99.73 98.19 101.57 98.22 99.43 97.44 99.90 99.70 97.33 98.47 98.62 103.94 98.35 102.16 99.45 99.95 99.02 102.37 103.90 103.09 100.89 102.23 1.36 4.57 1.13 2.09 6.30 2.11 5.32 2.40 1.97 1.25 1.78 0.34 1.68 1.60 2.57 2.34 0.83 2.39 1.62 1.20 2.52 3.74 0.95 1.18 1.66 2.06 1.65 1.82 2.57 2.74 2.63 3.07 2.90 1.90 1.53 2.24 1.64 3.51 3.88 1.45 2.63
2.3 方法的拓展应用
采用最优的前处理及GC-MS检测条件对2个产区不同酒样的59种微量挥发性香气成分进行检测，并基于检测结果对不同产区酒样进行聚类分析，结果见图5。 由图5可知，2-甲基丁酸乙酯、3-己醇、DL-2-羟基己酸乙酯、十三酸乙酯、2,3-二乙基吡嗪等物质的含量在6个酒样中相近，而其他组分均存在一定的差异。仁怀产区酒样（RH-A、RH-B、RH-C）和习水产区酒样（XS-A、XS-B、XS-C）分别聚类成一个大类，这与产区酒体间各挥发性风味组分含量及比例有关，表明准确的检测结合分析工具能够实现产地的区分。
图5 基于59种挥发性香气成分含量不同产区酱香型白酒的聚类分析热图
Fig.5 Heat map of cluster analysis based on 59 kinds of volatile aroma components in different producing areas of sauceflavor Baijiu
在此基础上，进一步基于59种微量挥发性香气成分检测结果对不同产区酒样进行HCA及PLS-DA，结果见图6。由图6a可知，仁怀产区酒样（RH-A、RH-B和RH-C）与习水产区酒样（XS-A、XS-B和XS-C）分别聚为一大类，结果与聚类分析结果一致。由图6b可知，PLS-DA模型的解释能力（R2X）为0.604及预测能力（Q2X）为0.179，说明模型具有一定的可靠性和预测能力。 仁怀产区白酒样品分布在第1和第4象限，习水产区白酒样品分布在第2和第3象限，两个产区的白酒能实现良好的区分。此外，为了验证PLS-DA模型是否过度拟合数据，进一步进行200次置换检验，由图6c可知，置换测试的截距R2为0.883，Q2为-0.031，R2＞Q2，且Q2在负截距，表明PLS-DA模型有效，不存在过拟合现象。在此基础上，进一步通过变量重要性投影（variableimportance in the projection，VIP）分析来体现各个变量对于样品分离的贡献程度，以VIP＞1的变量作为解释大曲之间差异的潜在标记物质。由图6d可知，VIP＞1的物质共有8种，分别为二甲基二硫、三甲基吡嗪、2-乙酰基-5-甲基吡咯、（2,2-二乙氧基乙基）-苯、2-糠醇、四甲基吡嗪、愈创木酚及2-乙基-6-甲基吡嗪，可作为区分两个产区酱香型白酒样品的主要微量挥发性香气成分。
图6 基于59种挥发性香气成分含量不同产区酱香白酒样品的层次聚类分析（a）、偏最小二乘-判别分析得分散点图（b）、200次置换检验结果（c）及变量重要性投影值（d）
Fig.6 Hierarchical cluster analysis (a), partial least squaresdiscriminant analysis score scatter plot(b),200 permutation test results(c)and variable importance in the projection values(d)based on 59 kinds of volatile aroma components in sauce-flavor Baijiu samples from different production areas
3 结论
本研究通过对色谱柱、萃取剂及萃取时间的优化选择，建立了有效检测酱香型白酒中59种微量挥发性香气成分的DLLME结合GC-MS法，该方法的最优色谱柱为DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），最优萃取剂为乙醚-正己烷（1∶1），最优萃取时间为2 min。在此条件下，各成分在检测范围内呈现出良好的线性关系，相关系数（R2）为0.996 3～0.999 9，检出限为0.15～2.43 μg/L，定量限为0.28～6.07 μg/L，加标回收率为93.00%～103.94%，精密度试验（n=6）结果的相对标准偏差（RSD）为0.34%～6.30%，说明该方法具备良好的精密度和回收率，可满足酱香型白酒微量挥发性香气成分的常规检测需求。采用建立的方法对仁怀和习水产区的酱香型白酒样品中的59种微量挥发性香气成分进行检测，并基于检测结果进行聚类分析和PLS-DA，发现仁怀和习酒产区酱香型白酒样品可以被有效区分，以变量重要性投影（VIP）值＞1筛选出8种主要差异微量挥发性香气成分，包括二甲基二硫、三甲基吡嗪、2-乙酰基-5-甲基吡咯、（2,2-二乙氧基乙基）-苯、2-糠醇、四甲基吡嗪、愈创木酚及2-乙基-6-甲基吡嗪。 本研究结果结果为酱香型白酒特征风味组分分析提供了研究思路。后期可通过收集检测对象的色谱骨架组分、微量组分及难挥发性组分数据，结合现代统计学技术对白酒样品进行全面剖析，实现白酒质量分级、产区区分、真假酒鉴别等，为白酒的发展提供新质生产力。
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