发酵乳具有促进肠胃蠕动,调节肠道内菌群生态平衡,帮助肠胃消化,抵御有害菌对肠道的入侵等功能[1]。发酵乳产品一般分为发酵乳和风味发酵乳,风味发酵乳在发酵乳的基础上添加了营养强化剂、果蔬制品等[2-3]。相对于原味发酵乳,更具有保健价值的风味发酵乳越来越受到消费者的喜爱[4-5]。研究表明,果蔬在发酵过程中能够产生具有天然抑菌功能的物质[6]。同时,果蔬经发酵后不仅提高了其营养价值,还更具有保健功能[7-8]。目前,常见市售的风味发酵乳有蓝莓味、草莓味、巧克力味、哈密瓜味和白桃味等。
蓝莓被誉为“水果皇后”、“浆果之王”,富含花青素、维生素C等抗氧化成分[11],具有明目、抗癌、延缓衰老等独特功效[9]。怀山药作为河南“四大怀药”之首,具有消渴生津、提高免疫力、抗衰老、降糖降脂等药理功效[10],其某些成分还可能促进乳酸菌的生长,从而改善发酵乳的质地与口感,使产品更加细腻滑润,两者搭配营养互补,可以提供更全面的营养价值[12-13]。 蓝莓的酸甜与怀山药的甘甜可以相互衬托,创造出口感层次丰富、风味独特的产品,提升消费者的食用体验[14]。怀山药与蓝莓相结合可满足消费者口味多样化的需求[15-16]。
本研究以蓝莓、怀山药和牛奶为原料制备蓝莓怀山药风味发酵乳,以感官评分为考察指标,利用单因素试验、模糊数学综合评价并结合响应面法对其发酵工艺进行优化,并对发酵乳的理化指标、微生物指标及抗氧化性进行检测分析,以期为风味发酵乳的新产品开发提供更多的理论参考。
蓝莓:云南省昆明市;怀山药:焦作市温县;牛奶:蒙牛乳业(焦作)有限公司;白砂糖:云南省昆明市;安琪酵母发酵剂:安琪电子商务(宜昌)有限公司;植物乳植杆菌(菌种编号GDMCC 1.2685):广东微生物菌种保藏中心。
磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、酚酞:天津化学试剂有限公司;三氯乙酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、氯化钾、乙酸钠:上海麦克林生化科技有限公司;无水乙醇、硫酸亚铁、硫酸钾:天津市科密欧化学试剂有限公司;水杨酸、硫酸铜:天津市风船化学试剂科技有限公司;氢氧化钠:天津市永大化学试剂有限公司;氯化钠:天津市鼎盛鑫化工有限公司;盐酸:安徽金粤冠新材料科技有限公司;过氧化氢:烟台市双双化工有限公司;三氯化铁:无锡市亚泰联合化工有限公司;铁氰化钾:天津聚恒达化工有限公司。所用试剂均为分析纯。
C21-WK2102型电磁炉:广东美的生活电器制造有限公司;JA2003A型电子分析天平:上海精天电子仪器有限公司;DHP-600型酸奶发酵箱:北京市永光明医疗仪器有限公司;JYL-C23型榨汁机:杭州九阳生活电器有限公司;TDL-50B型离心机:上海安亭科学仪器厂制造;2WAJ型阿贝折光仪:上海申光仪器仪表有限公司;KDL-08B型凯式定氮仪:上海洪纪仪器设备有限公司;UV-4802H型紫外分光光度计:尤尼柯上海仪器有限公司;LDZX-50KBS型灭菌锅:上海申安医疗器械厂;JM-LM50型胶体磨:温州恒强机械设备有限公司;KDL-04型消化炉:上海洪纪仪器设备有限公司。
1.3.1 蓝莓怀山药风味发酵乳发酵工艺流程及操作要点
操作要点:
制备蓝莓汁:选用果实饱满、外表完好及味道纯正的优质新鲜蓝莓,洗去表面灰尘污垢,蒸煮10 min,按照料液比1∶2(g∶mL)的比例,将蒸煮后的蓝莓于打浆机中打碎成汁。
制备怀山药浆:选取无霉变且无损坏的山药,用清水清洗后去皮切块,蒸煮15 min,按照料液比1∶2(g∶mL)加水,将蒸煮后的山药于打浆机中打碎成浆。
过滤:用过滤筛分别过滤蓝莓汁和山药浆,得到澄清的蓝莓汁和山药浆。
混合、调配:在牛奶中,以100 g发酵乳为基准,添加10.5%的蓝莓汁、6%的山药浆、6%的白砂糖以及0.2%的发酵剂,并进行均匀混合。
均质:将预备好的混合液升至55 ℃,经过胶体磨转动3 min,使发酵乳质地均匀且细腻。
灭菌、冷却:将混合液体加热至90 ℃进行灭菌处理15 min,随后将其冷却至45 ℃。
接种、发酵:灭菌后的混合物料冷却至45 ℃后,将发酵剂(安琪酵母与植物乳植杆菌体积比1∶1)按照0.2%接种量接种,于42 ℃恒温培养箱内发酵6 h。
后熟阶段:将经过发酵的乳制品置于4 ℃的冷藏环境中,进行11 h的后熟,即得蓝莓怀山药风味发酵乳成品。
1.3.2 发酵条件优化单因素试验
以发酵乳的总质量100 g为基准,固定怀山药浆添加量6%、发酵剂添加量0.2%、白砂糖添加量6%、发酵时间6 h,发酵温度42 ℃,分别考察蓝莓汁添加量(4%、6%、8%、10%、12%)、山药浆添加量(2%、4%、6%、8%、10%)、白砂糖添加量(3%、4%、5%、6%、7%)、发酵剂添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)、发酵时间(4 h、5 h、6 h、7 h、8 h)对蓝莓怀山药风味发酵乳感官评分的影响。
1.3.3 发酵条件优化响应面试验
在单因素试验结果的基础上,固定发酵剂添加量为0.2%,以蓝莓汁添加量(A)、怀山药浆添加量(B)、白砂糖添加量(C)及发酵时间(D)为影响因素,以感官评分为响应值。 采用Design-Expert 13.0 软件设计4因素3水平的响应面试验,试验因素与水平见表1。
表1 蓝莓怀山药风味发酵乳发酵条件优化响应面试验因素及水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process conditions optimization of blueberry and Chinese yam flavored fermented milk
水平 A 蓝莓汁添加量/%B 怀山药浆添加量/%C 白砂糖添加量/%D 发酵时间/h-1 0 1 8 10 12 46 8 56 7 56 7
1.3.4 模糊数学感官评价模型
(1)确定发酵乳的因素集
发酵乳的因素集即反映发酵乳感官品质指标的集合,滋味、色泽和气味和组织状态4个因素能够决定蓝莓怀山药风味发酵乳的品质,因此该因素集以A={A1,A2,A3,A4}表示,其中,A1代表滋味;A2代表色泽;A3代表气味;A4代表组织状态。
(2)确定发酵乳的评语集
评语集指对每个因素的评价的集合,蓝莓怀山药风味发酵乳的评语集就是表示其感官质量的评语的集合。该评语评定域用V={V1,V2,V3,V4}表示,其中V1表示优;V2表示良;V3表示中;V4表示差。
(3)确定发酵乳的权重集
权重反映每个因素在感官评定中的重要性,确定发酵乳的权重集K={0.3,0.2,0.2,0.3},即滋味0.3,色泽0.2,气味0.2,组织状态0.3。各级评语集对应的感官评定标准见表2。
表2 蓝莓怀山药风味发酵乳感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation criteria of blueberry and Chinese yam flavored fermented milk
项目 评分标准 评分/分 等级色泽A1(20分)状态A2(30分)滋味A3(30分)色泽均匀一致,颜色均一,有光泽色泽较均匀,颜色均一,光泽暗淡色泽太深或者太浅,颜色比较均匀,无太多光泽色泽比较差,颜色均匀不一,光泽差无分层质地好,无乳清的析出,无沉淀出现无分层,有较少量乳清析出,少量沉淀出现有少量分层出现,少量乳清析出,有一部分的沉淀出现较多沉淀出现,不均匀,大量乳清析出,质地很差口感顺滑,酸甜合适,无任何异味口感顺滑,酸甜比较合适,较甜或较淡,无任何异味口感顺滑,酸甜基本合适,较甜或较淡,无异味口感不顺滑,酸甜不平衡,过甜或过酸,有异味出现16~20 11~15 6~10 0~5 21~30 16~20 11~15 0~10 21~30 16~20 11~15 0~10优V1良V2中V3差V4优V1良V2中V3差V4优V1良V2中V3差V4气味A4(20分)蓝莓、山药香气协调,香味纯正浓郁,具有发酵乳风味蓝莓、山药香气协调,香味稍淡,发酵乳风味淡蓝莓、山药香气不协调,或无二者香味,发酵乳风味较淡蓝莓、山药的香气,风味不佳,有涩味和苦味,气味不协调16~20 11~15 6~10 0~5优V1良V2中V3差V4
(4)确定发酵乳的评价等级集
本研究中各因素按优、良、中、差4个等级评定。为了得到模糊数学评价的总分,划分感官评价等级分值区间为:优95~100分,良85~94分,中75~84分,差65~74分。因此建立感官评价评语集H=(95,85,75,65)。 则蓝莓怀山药风味发酵乳模糊数学评价总分即评价等级集Q=(优,良,中,差),等级分数集H=(95,85,75,65)。
1.3.5 理化指标的测定
酸度的测定:参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[17];持水力的测定:参照文献[18];蛋白质的测定:参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[19];可溶性固形物的测定:参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》[20];菌落总数:按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数》[21];花青素:参照文献[22]pH示差法计算花青素含量。
1.3.6 抗氧化活性测定
(1)DPPH自由基清除率
参考LI J M等[23]的方法并稍作修改,用无水乙醇配制质量浓度为0.11 g/mL的样品溶液。0.2 mmol/L DPPH溶液需保存在冰箱内,在使用前恢复至室温。 取2 mL的样品溶液与2 mL的0.2 mmol/L DPPH自由基溶液混合,并在避光条件下放置30 min。 之后,在波长517 nm处测量该混合溶液的吸光度值,记为(A1)。 空白吸光度(A0),用2 mL蒸馏水替代样品溶液与0.2 mmol/L DPPH自由基溶液进行反应,同样条件下测量其吸光度值。 为了测定样品本底吸光度值(A2),使用2 mL无水乙醇与样品溶液进行反应,并在同样的波长下测量其吸光度值。 以原味发酵乳为对照,实验步骤与上述相同。按下式计算:
(2)羟基自由基清除能力
参考WIS′NIEWSKA L S等[24]的方法并稍作修改,首先取2 mL样品溶液,随后分别加入2 mL的9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、9 mmol/L硫酸亚铁溶液以及8 mmol/L过氧化氢溶液,并充分混合。将混合溶液避光放置30 min,并在510 nm波长下测定其吸光度值(A1)。同时,为获取空白对照吸光度值(A0),采用相同步骤但将样品溶液替换为蒸馏水。通过加入蒸馏水替代H2O2溶液,测得样品吸光度值(A2)。以原味发酵乳为对照,操作步骤与上述相同。按下式计算:
(3)还原能力
参考乔艳艳等[25]的方法并稍作修改,在试管中加入2 mL样品溶液、2 mL pH 6.6 0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液和2 mL 1%铁氰化钾溶液,在50 ℃水浴中反应20 min,之后加入2 mL 10%三氯乙酸溶液,混匀后3 000 r/min离心10 min,取0.1 mL上清液,加入9 mL蒸馏水和0.9 mL 0.3%三氯化铁溶液混匀,待反应完全后在波长700 nm处测定吸光度值。吸光度值越大,样品还原能力越强。以原味发酵乳为对照,步骤同上。
1.3.7 感官评价
请10位经过培训的感官评价人员,从发酵乳的色泽、状态、滋味及气味四个方面进行感官评分,满分100分。 感官评分标准详见表2。
1.3.8 数据处理
所得实验数据用Origin 2018 64 Bit软件进行绘图,利用Design-Expert 13.0软件进行结果分析。
2.1.1 蓝莓汁添加量的确定
由图1可知,随着蓝莓汁添加量在4%~10%范围内的增加,感官评分逐渐增加;当蓝莓汁添加量为10%时,感官评分达到最大值,此时复合发酵乳蓝莓、山药香气协调,香味纯正浓郁;继续增加蓝莓汁添加量,感官评分逐渐下降。因此,确定最佳蓝莓汁添加量为10%。
图1 蓝莓汁添加量对蓝莓怀山药风味发酵乳感官评分的影响
Fig.1 Effect of blueberry juice addition on sensory score of blueberry and Chinese yam flavored fermented milk
2.1.2 怀山药浆添加量的确定
由图2可知,随着怀山药浆添加量在2%~6%范围内的增加,感官评分增加;当怀山药浆添加量为6%时,感官评分最高,此时复合发酵乳色泽均匀一致,口感细腻润滑;继续增加怀山药浆,感官评分下降。因此,确定最佳怀山药浆添加量为6%。
图2 怀山药浆添加量对蓝莓怀山药风味发酵乳感官评分的影响
Fig.2 Effect of Chinese yam pulp addition on sensory score of blueberry and Chinese yam flavored fermented milk
2.1.3 白砂糖添加量的确定
由图3可知,随着白砂糖添加量在3%~6%范围内的增加;感官评分增加;当白砂糖添加量为6%时,感官评分达到最高值,此时复合发酵乳口感顺滑,酸甜合适,无任何异味;继续增加白砂糖添加量,感官评分下降。 因此,确定最佳白砂糖添加量为6%。
图3 白砂糖添加量对蓝莓怀山药风味发酵乳感官评分的影响
Fig.3 Effect of sugar addition on sensory score of blueberry and Chinese yam flavored fermented milk
2.1.4 发酵剂添加量的确定
由图4可知,随着发酵剂添加量在0.1%~0.2%范围内的增加,感官评分逐渐增加;当发酵剂添加量为0.2%时,感官评分最高,此时复合发酵乳风味怡人,酸甜适度,无异位产生,无砂状颗粒;继续增加发酵剂添加量,感官评分下降。因此,确定最佳发酵剂添加量为0.2%。
图4 发酵剂添加量对蓝莓怀山药风味发酵乳感官评分的影响
Fig.4 Effect of starter addition on sensory score of blueberry and Chinese yam flavored fermented milk
2.1.5 发酵时间的确定
由图5可知,随着发酵时间在4~6 h范围内增加,感官评分逐渐增加;当发酵时间为6 h时,感官评分最高,此时复合发酵乳酸甜适宜,无分层,无乳清的析出,无沉淀出现;继续增加发酵时间,感官评分下降。 发酵时间偏短时,菌种还处在自身发展阶段,代谢产物较少,产酸不足;发酵时间偏长会导致蓝莓怀山药发酵乳酸度偏高,也会导致代谢产物积累,从而产生异味,影响蓝莓怀山药发酵乳的品质[26]。因此,确定最佳发酵时间为6 h。
图5 发酵时间对蓝莓怀山药风味发酵乳感官评分的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on sensory score of blueberry and Chinese yam flavored fermented milk
2.2.1 模糊数学感官评价试验及响应面试验
在单因素试验结果的基础上,固定发酵剂添加量为6%,选择蓝莓汁添加量(A)、怀山药浆添加量(B)、白砂糖添加量(C)、发酵时间(D)为自变量,感官评分(Y)为响应值,使用Design-Expert 13.0软件设计3因素3水平的Box-Behnken响应面试验。 根据感官评价标准对29组样品进行感官评分,各个等级的各项指标票数统计结果见表3。
表3 模糊数学感官评价指标统计
Table 3 Fuzzy mathematical sensory evaluation index statistics
样品 1234567891 0滋味优 良 中差色泽优 良 中差气味优 良 中差组织状态优 良 中 差11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 03143023111322222313022169999 12123013111452131213116131110 45343343333225444433441310001 50501731555111313151531500000 24252024222400202222220279999 01115211021253141524025130011 23122114201246353203224101100 62621761666211414161641600000 13143015111255252313125189999 12123223121411213313141121011 01303222323322322333012300100 84541650555122323151832500000 01022013000422222202022079999 34343023333510202424323331110 23225232222134242434221200001 52520842555044444050544500000
认为1号样品滋味优秀的0人,良1人,中4人,较差5人,即因素集色泽A1=(0,0.1,0.4,0.5)。 同理,色泽A2=(0.2,0,0.2,0.6)、气味A3=(0.1,0.1,0,0.8)、组织状态A4=(0,0.3,0.2,0.5),组成样品1的模糊数学感官综合评价矩阵A1
同理,可得样品A2~A29。
以1号样品为例,模糊感官评分U1如下:
(95,85,75,65),则样品1的最终模糊感官评分U1为71.8分。同理,可得样品U2~U29。
根据模糊数学评价结果,得到响应面试验结果见表4,方差分析见表5。
表4 蓝莓怀山药风味发酵乳发酵工艺条件优化响应面试验设计与结果
Table 4 Design and results of response surface test for fermentation process conditions optimization of blueberry and Chinese yam flavored fermented milk
序号 A B C D 感官评分/分1234567891 0-1 1-1-1-1 10000-0000-11-0000-1-1 11-1-1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 11-110000-1100000000-11-110000-1-1 11-11 -1-1 11000000000 110000-11-1100000000-1-1 1100000 11000000000 1100000 71.8 80.8 73.2 82.8 82.4 68.7 75.2 83.7 73.0 73.6 73.2 84.6 80.3 78.7 77.0 79.2 77.2 82.7 73.1 82.8 71.8 77.6 81.2 73.2 91.6 93.8 93.6 94.0 93.4
表5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注:“**”表示对结果影响极显著(P<0.01);“*”表示对结果影响显著
(P<0.05)。
来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型14 ABCDA B********AC AD BC BD CD A2 B2 C2 D2残差失拟项纯误差总误差1 518.37 174.80 0.270 0 12.00 48.00 0.090 0 4.41 29.16 3.61 47.61 123.21 409.79 425.40 263.63 557.80 18.72 14.99 3.73 1 537.09 111111111111111 4 81.12 130.74 0.201 9 8.98 35.90 0.067 3 3.30 21.87 2.70 35.61 92.15 306.50 318.18 200.17 417.21<0.000 1<0.000 1 0.660 0 0.009 6<0.000 1 0.799 1 0.090 8 0.000 4 0.122 6<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1<0.000 1**************10 4 28 108.46 174.80 0.270 0 12.00 48.00 0.09 4.41 29.16 3.61 47.61 123.21 409.79 425.40 267.63 557.80 1.34 1.50 0.932 0 1.61 0.342 6
对表4结果进行多元二次回归拟合分析,得到感官评分(Y)与蓝莓汁添加量(A)、怀山药浆添加量(B)、白砂糖添加量(C)、发酵时间(D)的二次多项式回归模拟方程:
由表5可知,该模型极显著(P<0.01),失拟项不显著(P>0.05),说明其他影响因素对实验结果干扰较小,模型和实验的拟合程度良好。决定系数R2=0.987 8,调整决定系数R2adj=0.975 6,说明建立的模型可以解释97.56%的响应值,说明模型具有更低的变异系数、更接近真实情况[27]。由P值可知,一次项A、C、D,交互项AD、BD、CD,二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著(P<0.01),其他项对结果影响不显著(P>0.05)。由F值可知,对蓝莓怀山药风味发酵乳感官评分影响从大到小顺序依次为:蓝莓汁添加量(A)>发酵时间(D)>白砂糖添加量(C)>怀山药浆添加量(B)。
2.2.2 交互作用分析
由图6的等高线图和响应面图形的形状可以判断出,怀山药浆和发酵时间,白砂糖添加量和发酵时间影响显著,蓝莓汁添加量和发酵时间影响为其次,蓝莓汁添加量和怀山药浆添加量、蓝莓汁添加量和白砂糖添加量以及怀山药浆添加量和白砂糖添加量影响最小。
图6 各因素间交互作用对蓝莓怀山药风味发酵乳感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the sensory score of blueberry and Chinese yam flavored fermented milk
经过Design-Expert13.0分析可得出蓝莓怀山药风味发酵乳的最佳发酵工艺条件为蓝莓汁添加量10.53%,怀山药浆添加量5.96%,白砂糖添加量6.00%,发酵时间6.15 h。在此优化条件下,感官评分预测值为93.93分。 为便于试验的操作并结合实际情况,将发酵条件修正为蓝莓汁添加量10.5%,怀山药浆添加量5.9%,白砂糖添加量6%,发酵时间6.1 h。在此条件下进行3次平行验证试验,获得感官评分实际值为93.28分,与预测值相近。 该模型与实际操作具有较高拟合度,表明该模型具有一定的可行性。
由表6可知,蓝莓怀山药风味发酵乳的酸度为93°T,持水力为61.72,蛋白质含量为3.67 g/100 g、可溶性固形物为15.1%,乳酸菌数为1.82×106 CFU/mL,大肠菌群和金黄色葡萄球菌均未检出。各项指标均符合国家标准GB 19302—2010《发酵乳》[28]的理化指标和微生物指标要求。蓝莓怀山药风味发酵乳中的花青素含量为0.252 mg/g。
表6 蓝莓怀山药风味发酵乳的理化、微生物指标及花青素含量检测结果
Table 6 Detection results of physiochemical, microbial indicators,and anthocyanin content of blueberry and Chinese yam flavored fermented milk
项目 国标要求 检测结果酸度/°T持水力/%蛋白质/(g·100 g-1)可溶性固形物/%菌落总数/(CFU·mL-1)乳酸菌数/(CFU·mL-1)大肠菌群/(CFU·mL-1)金黄色葡萄球菌/(CFU·mL-1)花青素含量/(mg·g-1)≥70—≥2.3—≤2×106≥1×106 m=1 M=5不得检出—93 61.72 3.67 15.1 1.73×105 1.82×106未检出未检出0.252
原味发酵乳、蓝莓怀山药风味发酵乳对0.1 mmol/L DPPH自由基清除率、2 mmol/L羟基自由基清率、Fe3+还原/抗氧化能力分别为50.7%、79.0%,48.3%、72.6%,0.835、1.396。表明此工艺条件下的蓝莓怀山药风味发酵乳具有较强的抗氧化性。
本研究以蓝莓、怀山药和牛奶为原料制备蓝莓怀山药风味发酵乳,以感官评分为考察指标,利用单因素试验、模糊数学综合评价并结合响应面法对其发酵工艺进行优化,并对发酵乳的理化指标、微生物指标及抗氧化活性进行检测分析。结果表明,蓝莓怀山药风味发酵乳最佳发酵工艺条件为:牛奶77.4%,蓝莓汁10.5%,怀山药浆5.9%,白砂糖6%,菌种添加量0.2%,发酵时间6.1 h。 在此优化条件下,蓝莓怀山药风味发酵乳的感官评分达到93.28分,酸度为93°T,持水力为61.72,蛋白质含量为3.67 g/100 g、可溶性固形物为15.1%,菌落总数为1.73×105 CFU/mL,乳酸菌数为1.82×106 CFU/mL,大肠菌群和金黄色葡萄球菌均未检出,各项指标均符合国家标准。 抗氧化活性结果表明,蓝莓怀山药风味发酵乳对DPPH自由基、羟基自由基清除率及Fe3+还原/抗氧化能力分别为79.0%、72.6%、1.396。 将蓝莓和怀山药两种果蔬结合,不仅可以实现营养互相补充,口感风味相互衬托,发酵作用相互协同,文化与地域特色互相融合,也丰富了我国发酵乳品种的多样化,为乳制品的新产品的研发提供了一些基本思路。
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