山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是葡萄科葡萄属落叶藤本植物，原产于中国、俄罗斯及远东地区，有极强的抗寒、抗病能力[1]，在中国主要分布于东三省和内蒙古等地区。‘北冰红’山葡萄是中国农业科学院特产研究所以‘左优红’作为母本，以山欧葡萄杂交品系86-24-53作为父本，进行种间杂交选育，于2008年审定的酿酒葡萄新品种[1-2]，其具有糖高、酸低等特点，是目前唯一一个不用外加糖源即可酿制成干酒和冰酒的山葡萄品种[3]。‘北冰红’干红葡萄酒是由9月下旬采摘的新鲜葡萄发酵酿制而成，具有酒体醇厚、口味柔和、营养丰富及香气浓郁等优良特性，是新型山葡萄酒中的优秀代表之一，深受广大消费者喜爱[4]。
在葡萄酒酿制过程中需要添加一定量的SO2，起到杀菌、澄清、抗氧化、护色和改善口味等作用[5-6]，但添加过量的SO2会影响酵母发酵以及葡萄酒的色泽和风味，并且具有一定毒性，GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂用标准》中规定了各类食品中SO2最大使用量，其中葡萄酒中SO2最大使用量为0.25 g/L。目前，很多研究者试图寻找与SO2同效果、对人体无害的物质，如抗坏血酸、蜂蜜和山梨酸等，但效果并不好[7-8]。因此，SO2在葡萄酒生产过程中仍然起重要作用。ZHANG B X等[9]考察了不同SO2添加量对‘北冰红’冰酒品质的影响，结果表明，SO2添加量为30 mg/L时，‘北冰红’冰酒的整体风味最佳。
本研究以2019年在同一果园采收的‘北冰红’山葡萄果实为原料，在相同条件下，添加不同质量浓度的SO2酿造干红葡萄酒，通过测定酒样的残糖、总酸、有机酸、花色苷含量、色泽并进行感官评定，考察不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒品质的影响，确定适合酿造‘北冰红’干红葡萄酒的二氧化硫最佳添加量，以期为酿造优质干红葡萄酒提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
‘北冰红’山葡萄鲜果（可溶性固形物含量为（25.0±1.0）%）：采自集安市鸭江谷酒庄有限公司葡萄园，无霜期达150～170 d，年均降水量882 mm（主要集中在6～8月份），山葡萄生长季节降水充沛，无需灌溉，而果实成熟季节降水稀少，光照充足，温差较大，葡萄果实病害少，品质高。选取葡萄园不同位置无病虫害、无发霉、完全成熟的果穗作为取样对象，样品装入保温箱中，当天带回实验室进行‘北冰红’干红葡萄酒酿制。
酵母RV171：安琪酵母有限公司。
1.1.2 试剂
果胶酶RF（30 000 U/g）、果胶酶RCO（80 000 U/g）：德国AB酶制剂公司；焦亚硫酸钾（纯度97%）：法国SOFRALAB公司；硫酸、盐酸、磷酸、氯化钾、无水乙醇、氢氧化钠（均为分析纯）：北京化工厂有限责任公司；蒽酮、邻苯二甲酸氢钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水乙酸钠、柠檬酸钠（均为分析纯）：上海沪试化工有限公司；葡萄糖（分析纯）：广州金华大化学试剂有限公司；酚酞（分析纯）：天津市华东试剂厂；苹果酸、酒石酸、琥珀酸（均为色谱纯）：上海源叶生物科技有限公司；柠檬酸、冰乙酸、乳酸（均为色谱纯）：天津光复精细化工研究所。
1.2 仪器与设备
Agilent 1200高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、Cary60UV-Vis紫外分光光度计：美国安捷伦科技有限公司；Milli-Q Advantage A1超纯水器：美国密理博公司；HWS-24电热恒温水浴锅、DHG-9240恒温干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；BSA224S-CW赛多利斯电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；NH310高品质便携式电脑色差仪：深圳市三恩时科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 ‘北冰红’干红葡萄酒酿造工艺
果实采收→挑选、除梗、破碎→添加二氧化硫→低温浸渍→回温→添加果胶酶→添加酵母→醪液发酵→分离→压榨→粗滤→二次发酵→干红葡萄酒原酒
操作要点[4]：
果实采收：选择成熟度一致，无病虫害、无变质的优质‘北冰红’山葡萄果实进行采收。
挑选、除梗、破碎：选择大小一致，表皮无破损、无霉变的葡萄果实除梗、破碎。
添加二氧化硫：葡萄破碎后立即加入焦亚硫酸钾（1 g的焦亚硫酸钾可以产生约0.56 g的SO2），使得SO2添加量分别为0、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg和50 mg/kg。
低温浸渍：搅拌均匀后在低温（8～10 ℃）条件下浸渍24 h。
添加果胶酶：待回温至15～18 ℃后按0.1 mL/kg加入果胶酶，继续浸渍12 h。
添加酵母：按0.4 g/kg加入活化酵母RV171，在（18±2）℃条件下发酵7 d，发酵过程中每天搅拌1次，发酵7 d后进行压榨、粗滤。
二次发酵：粗滤液于15 ℃条件下进行二次发酵20 d，精滤除杂得到‘北冰红’原酒，根据SO2添加量（0、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg），样品依次编号为1#～6#。
1.3.2 基本理化指标的检测
‘北冰红’干红葡萄酒残糖（以葡萄糖计）、总酸（以酒石酸计）含量的测定：参考国家标准GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
1.3.3 有机酸含量的检测
参照舒楠[10]的方法采用HPLC测定有机酸（酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸）含量。
1.3.4 色泽指标的检测
采用NH 310高品质便携式电脑色差仪测定‘北冰红’干红葡萄酒的色泽（L*值、a*值、b*值、C*值、h*ab值）。 其中L*值代表明度，L*值越大明度越大；a*代表红绿色度（a*值为正值时表示红色度，为负值时表示绿色度）；b*值代表黄蓝色度（b*值为正值时表示黄色度，为负值时表示蓝色度）；C*值为色泽饱和度；h*ab值为色调角[11]。
1.3.5 花色苷含量的检测
参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定北冰红干红葡萄酒中的花色苷含量。
1.3.6 感官评价
选取13名经过培训的品酒师（包括7女6男，年龄20～55 岁，平均年龄36 岁）组成感官评价小组，参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》从颜色、澄清度、香气、滋味和典型性5个方面对‘北冰红’干红葡萄酒进行感官评价，满分100分[4]。
1.3.7 数据处理与统计分析
每个试验重复3次，采用SPSS 27.0处理数据，结果用“平均值±标准差”表示，采用Origin 2021软件绘图；采用SIMCA14.1进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。
2 结果与分析
2.1 不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒基本理化指标的影响
残糖、总酸等是判断葡萄酒质量是否达标的基础指标，因此，考察不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒残糖及总酸含量的影响，结果见图1。
图1 不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒残糖（a）及总酸（b）含量的影响
Fig.1 Effect of different SO2 addition on residual sugar (a) and total acid (b) contents in 'Beibinghong' dry red wine
由图1a可知，6个酒样的残糖含量在4.74～5.78 g/L之间，且随着SO2添加量的升高，酒样中的残糖含量呈下降趋势，可能是因为发酵过程中二氧化硫可以有效地控制发酵醪液中各种杂菌的生长，保证发酵的顺利进行，从而使其发酵更彻底，残糖含量更低。由图1b可知，6个酒样的总酸含量在5.45～6.31 g/L之间，且随着SO2添加量的增加，总酸含量呈现先下降后上升的趋势。 其中，4#酒样的总酸含量最低。 值得注意的是，“北冰红”干红葡萄酒本身具有较高的酸度[4]。 此外，研究表明，二氧化硫在葡萄酒基质中可能转化为酸，从而影响葡萄酒的整体酸度[12-13]。在此背景下，4#酒样所表现出的较低酸度，对于降低“北冰红”干红葡萄酒原本较高的酸度具有积极作用。
2.2 不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒有机酸含量的影响
有机酸是葡萄酒中重要的呈味物质，其组分与含量在一定程度上影响着葡萄酒的风味与化学稳定性，从而影响葡萄酒的品质[14]。因此，测定不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒有机酸含量的影响，结果见表1。 由表1可知，6个酒样中有机酸总量为3#＞1#＞2#＞6#＞5#＞4#。‘北冰红’干红葡萄酒样中均未检测到乙酸，主要有机酸为酒石酸和苹果酸，此外还有少量的乳酸、琥珀酸和柠檬酸，这与曹炜玉[15]的研究结果基本一致。
表1 不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒有机酸含量的影响
Table 1 Effect of different SO2 addition on organic acid contents in 'Beibinghong' dry red wine
注：N.D表示未检测到，同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
酒样编号 酒石酸/（g·L-1） 苹果酸/（g·L-1） 乳酸/（g·L-1） 乙酸/（g·L-1） 柠檬酸/（g·L-1） 琥珀酸/（g·L-1） 有机酸总量/（g·L-1）1#2#3#4#5#6#3.31±0.01c 3.29±0.03c 3.44±0.04b 3.61±0.02a 2.94±0.03d 2.88±0.04e 1.24±0.03a 1.24±0.01a 1.24±0.01a 0.15±0.02c 1.18±0.04b 1.21±0.01ab 0.82±0.02bc 0.83±0.03a 0.79±0.01d 0.89±0.02a 0.82±0.02bc 0.85±0.02b N.D N.D N.D N.D N.D N.D 0.25±0.01a 0.24±0.01b 0.26±0.01a 0.18±0.01d 0.21±0.01c 0.22±0.01c 0.58±0.01b 0.58±0.01b 0.58±0.02b 0.61±0.01a 0.57±0.01b 0.58±0.01b 6.20 6.18 6.31 5.44 5.72 5.74
葡萄酒中的酒石酸主要来源于果实，其在发酵过程中会被乳酸菌降解转化为乳酸和乙酸，呈酸涩味、酸感较强[15-16]。酒石酸在‘北冰红’干红葡萄酒中占比最高（50.17%～66.36%），其中，4#酒样中酒石酸含量最高（3.61 g/L），6#酒样中酒石酸含量最低（2.88 g/L）。 经苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）后，L-苹果酸转化为L-乳酸[15]。苹果酸酸味最强，有果味、生青味，稍有苦涩味，呈味时间长[17]；而乳酸酸性柔和、圆润，能改善酒体风味[18]。1#酒样、2#酒样和3#酒样中的苹果酸含量最高，均为1.24 g/L；4#酒样中的苹果酸含量最低（0.15 g/L），但乳酸含量最高（0.89 g/L）。柠檬酸口感清爽，主要来源于果实和酒精发酵过程中[17]。3#酒样中的柠檬酸含量最高（0.26 g/L），4#酒样柠檬酸酸含量最低（0.18 g/L）。琥珀酸味感丰富，既有酸味还有咸苦味，参与葡萄酒中酯类物质的代谢以及酒味的合成，增强葡萄酒的醇厚感[19]。 4#酒样中琥珀酸含量最高（0.61 g/L），显著高于其他5个酒样（P＜0.05）。综上，4#酒样中的苹果酸、柠檬酸及有机酸总量最低，但乳酸和琥珀酸含量最高，进而使其酒样味感丰富、口感柔和。因此，以30 mg/kg添加SO2酿制的‘北冰红’干红葡萄酒滋味最佳。
2.3 不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒色泽的影响
颜色是葡萄酒重要的感官特性，是鉴别葡萄酒外观品质及酒龄的重要依据，与消费者接受程度密切相关[11]。根据色泽指标，可以判断葡萄酒的氧化程度以及质量好坏[20]。因此，考察不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒色泽的影响，结果见图2。 由图2可知，添加不同质量浓度SO2酿制的‘北冰红’干红葡萄酒酒样色泽存一定差异。6个酒样的L*值均比较高，在69.70～72.70之间，说明6个‘北冰红’干红葡萄酒都具有较好的光泽；其中，2#酒样和6#酒样的L*值最大，葡萄酒颜色最亮，其次是4#酒样，1#酒样的L*值最小，葡萄酒颜色最暗。6个酒样的a*值均为正值，呈红色；其中，5#酒样的a*值（37.96）显著高于其他5个酒样（P＜0.05），1#酒样的a*值最小（35.53）。 6个酒样的b*值均为正值，呈黄色；其中，1#酒样的b*值最大（7.35），2#酒样的b*值最小（7.19）。5#酒样的C*值最大（38.67），颜色饱和度最高，显著高于其他5个酒样（P＜0.05），1#酒样的C*值最小（36.28）。6个酒样的h*ab值均在0～90°之间，属于红色调到黄色调，h*ab值越接近0，则葡萄酒颜色越接近红色[21-22]，5#酒样h*ab值最小（10.93）。 综上，5#酒样的a*值和C*值均最大，h*ab值最小，酒体色泽鲜艳饱满，整体色泽品质较好。
图2 不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒颜色参数的影响
Fig.2 Effect of different SO2 addition on color parameter in'Beibinghong' dry red wine
2.4 不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒中花色苷含量的影响
‘北冰红’干红葡萄酒含有丰富的花色苷[20]。花色苷是葡萄酒中主要的呈色物质，其含量和种类决定着干红葡萄酒的颜色[21-26]。在葡萄酒酿造中添加适量SO2可以抑制酚类物质氧化，SO2会结合类黄酮，延迟稳定的花色苷和单宁有色复合物的形成[27]。因此，考察不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒中花色苷含量的影响，结果见图3。由图3可知，添加不同质量浓度SO2酿制的‘北冰红’干红葡萄酒酒样中的花色苷含量存在一定差异，且随着SO2质量浓度的升高，花色苷含量整体呈先升高后下降的趋势。其中，5#酒样的花色苷含量最高（279.43 mg/L），显著高于其他5个酒样（P＜0.05），这与其酒样色泽指标a*值最大的结果相符。
图3 不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒中花色苷含量的影响
Fig.3 Effect of different SO2 addition on anthocyanin contents in'Beibinghong' dry red wine
2.5 不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒感官评分的影响
葡萄酒的感官品质影响消费者选择[28]，因此，考察不同SO2添加量对‘北冰红’干红葡萄酒样品感官评分的影响，结果见图4。 6个酒样酒体澄清透明，呈深宝石红色，香气浓郁，均具有山葡萄酒的典型性[19]。在颜色、澄清度和典型性方面，6个酒样无明显差异（P＞0.05）；在香气和滋味方面，4#酒样显著高于其他酒样（P＜0.05），酒样酸度适中，香气浓郁。除1#酒样外，其他酒样的总分均＞90分；其中，4#酒样的总分最高（96.01分），说明以SO2添加量为30 mg/kg酿造的‘北冰红’干红葡萄酒整体感官品质最佳。
图4 ‘北冰红’干红葡萄酒的感官评价结果
Fig.4 Sensory evaluation results of 'Beibinghong' dry red wine
2.6 不同SO2添加量酿制‘北冰红’干红葡萄酒品质综合评价
基于‘北冰红’干红葡萄酒的基本理化指标（残糖含量、总酸含量）、有机酸含量（柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、乳酸）、色泽指标（L*值、a*值、b*值、C*值、h*ab值）、花色苷含量、感官评分，对不同SO2质量浓度酿制‘北冰红’干红葡萄酒进行PCA，根据特征值＞1提取主成分，结果见表2。
表2 4个主成分的特征值、方差贡献率、累计方差贡献率及成分载荷矩阵
Table 2 Eigenvalue, variance contribution rate, cumulative variance contribution rate and component load matrix of 4 principal components
注：X1～X14分别为a*值、C*值、花色苷含量、h*ab值、残糖含量、柠檬酸含量、琥珀酸含量、苹果酸含量、酒石酸含量、乳酸含量、b*值、总酸含量、L*值、感官评分。
指标主成分1 2 3 4 X1X2X3X4X5X6X7X8X9 X10 X11 X12 X13 X14特征值方差贡献率/%累计方差贡献率/%0.923 0.922 0.892-0.877-0.814-0.732 0.095-0.317-0.487 0.504-0.064 0.091 0.582-0.187 5.451 38.939 38.939-0.130-0.129-0.085 0.204 0.072-0.582 0.944-0.918 0.827 0.633 0.145-0.413-0.028 0.573 3.764 26.887 65.826 0.139 0.153-0.093 0.301-0.190-0.129 0.098-0.096-0.196 0.087 0.884 0.853-0.614 0.071 2.149 15.347 81.173 0.236 0.238 0.233-0.134 0.146 0.101-0.103 0.087 0.132-0.480 0.162-0.165-0.103 0.758 1.121 8.008 89.181
由表2可知，特征值＞1的主成分共4个，累计方差贡献率达到89.181%，说明所提取的这4个主成分能够较好地解释原有变量所包含的信息。 第一主成分的特征值为5.451，方差贡献率为38.939%，说明主成分1在分析评价中起主导作用。 其中，a*值、C*值、花色苷含量和L*值有较高的载荷值，分别为0.923、0.922、0.892、0.582。第二主成分的特征值为3.764，方差贡献率为26.887%；其中，琥珀酸、酒石酸和乳酸含量有较高的载荷值，分别为0.944、0.827和0.633；第三主成分的特征值为2.149，方差贡献率为15.347%；其中，b*值和总酸含量有较高的载荷值，分别为0.884和0.853；第四主成分的特征值为1.121，方差贡献率为8.088%；感官评分有较高的载荷值，为0.758。
进一步利用表2中各指标的载荷值除以主成分相对应的特征值开平方根，得到4个主成分中各指标所对应的系数（特征向量），以特征向量为权重构建4个主成分的综合得分表达式：
以4个主成分所对应的方差贡献率为权重，构建综合评价模型：F=38.939%F1+26.887%F2+15.347%F3+8.008%F4。利用该模型计算各品种的综合得分并进行排序，结果见表3。由表3可知，添加不同质量浓度SO2酿制‘北冰红’干红葡萄酒的综合品质排序为：4#＞5#＞3#＞6#＞2#＞1#，说明4#‘北冰红’干红葡萄酒品质最好，即添加30 mg/kg SO2酿制的‘北冰红’干红葡萄酒品质最佳。
表3 不同SO2添加量酿制‘北冰红’干红葡萄酒综合得分及排名
Table 3 Comprehensive score and ranking of 'Beibinghong' dry red wine brewed with different SO2 addition
酒样 综合得分/分 排序1#2#3#4#5#6#-0.756-0.275 0.147 0.805 0.192-0.113 653124
3 结论
以2019年采摘的‘北冰红’山葡萄果实为试材，添加不同质量浓度的SO2酿造干红葡萄酒，结果发现，添加50 mg/kg SO2酿制的‘北冰红’干红葡萄酒中残糖含量最低（4.74 g/L）；添加40 mg/kg SO2酿制的‘北冰红’干红葡萄酒中花色苷含量最高（279.43 mg/L），色泽较佳；添加30 mg/kg SO2酿制的‘北冰红’干红葡萄酒中总酸含量（5.45 g/L）、有机酸总量（5.44 g/L）、苹果酸（0.15 g/L）和柠檬酸（0.18 g/L）含量最低，且乳酸（0.89 g/L）和琥珀酸（0.61 g/L）含量最高，可有效降低‘北冰红’干红葡萄酒的酸度，使其酒体醇厚，酸度适中，口感柔和，感官评分（96.01分）最高。 进一步基于品质指标对不同SO2添加量酿制‘北冰红’干红葡萄酒进行PCA，结果发现，当SO2添加量为30 mg/kg时，‘北冰红’干红葡萄酒的整体品质最佳。
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