食醋作为一种古老而又广泛应用的食品调味品,在人们的日常生活中扮演着重要的角色。浙江传统半固态自然发酵醋,是以大米为原料,利用天然微生物在特定环境条件下,将谷物等原料通过多步生化反应转化为醋酸和其他风味物质的过程。 随着生物工程技术的不断发展,液态深层发酵法制醋工艺的出现标志着我国传统的食醋业进入了工业化生产模式[1],液态深层发酵是以酒精类为原料(食用酒精、黄酒等),在大型发酵罐内进行,机械化程度高、占地面积少、微生物和底物接触充分、发酵条件便于控制、劳动生产率高、原料出醋率多、产品卫生条件好[2]。 然而,液态深层发酵是醋酸菌纯种发酵,使产品风味单一,且设备投资成本较高[3]。此外,过度依赖单一微生物菌种会增加产品对特定环境因素的敏感性,从而增加生产过程中的风险。曾玉等[4]对多种发酵工艺进行比较,发现深层液态发酵工艺在原料利用率上和生产效率方面比传统发酵工艺更有优势。 孙娜[5]研究发现,液态深层发酵醋的化学成分和风味物质相较于固态发酵和液态表面发酵较少,且其氨基酸和总酚含量较低,但发酵周期最短。 LI C等[6]通过高通量测序技术探讨山西成熟醋半固态发酵过程中微生物群的动态演替和季节特征,发现夏季由于特定真菌导致发酵不稳定,质量下降。GULLO M等[7]使用纯种生物菌种制备液态深层发酵醋,认为液态深层发酵具有多项优势,主要体现在产量高、工艺速度快。
本研究分别采集浙江传统半固态自然发酵及深层液态发酵工艺生产的生醋,分析两类食醋在理化性质、挥发性风味物质、活性物质(有机酸、氨基酸、总黄酮、总多酚等)、抗氧化活性[1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)及2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺 酸(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)自由基的清除率]及感官特性等方面的差异,探究浙江传统半固态自然发酵醋与液态深层发酵醋的主要特征和产生差异的原因,为浙江传统玫瑰醋产业的工艺改进和行业发展提供理论基础和技术支持。
传统半固态自然发酵醋生醋(M1、M3):新昌天姥食品有限公司;深层液态发酵醋生醋(M2、M4):宁波佐餐王调味有限公司。
磷酸二氢钠、葡萄糖、氢氧化钠、酚酞、无水乙醇、硫酸铜、草酸、β-苯乙醇、乙酸乙酯、苯甲醛、2-乙基丁酸、乙酸,乙腈、甲醇、异硫氰酸苯酯、三乙胺、无水乙酸铵、正己烷、冰乙酸、浓盐酸(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司;乳酸、丙酸、甲酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、L-酒石酸、α-酮戊二酸、没食子酸、芦丁标准品(纯度均>98%):上海阿拉丁生化科技股份有限公司。DPPH、ABTS:上海麦克林生化科技股份有限公司。
LC-2010A HT高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪、Spursil C18-EP色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、7890A-5975C气相色谱质谱联用仪:美国安捷伦科技有限公司;QExactive HFX质谱仪:美国Thermo Fisher Scientific;Hitachi L-8900全自动氨基酸分析仪:日本日立有限公司。
1.3.1 传统半固态自然发酵及深层液态发酵食醋制备
传统半固态自然发酵将大米浸泡1~5 d后,蒸30 min,然后在室温下自然冷却。冷却后的大米被转移到陶瓷罐中进行搭窝,大约20 d内通过环境微生物发生糖化。 糖化后,加水启动主发酵阶段,进行后续的酒精发酵和醋酸发酵。经过4~6个月的发酵,酸度不再变化,即得传统半固态自然发酵食醋生醋(M1和M3)。
M2以食用酒精为醪液,M4以黄酒为醪液,将纯培养的醋酸菌种子液接种到醪液中,温度控制在28~35 ℃,通过机械搅拌供氧,直接进入醋酸发酵。经过7~10 d,酸度不再上升,即得液态深层发酵食醋生醋(M2和M4)。
1.3.2 理化指标的测定
总酸含量:参照国家标准GB 12456—2021《食品中总酸的测定》测定;还原糖含量:参照国家标准GB/T 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》中的斐林试剂滴定法测定;氨基酸态氮含量:参照国家标准GB/T 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》测定。
1.3.3 活性成分的测定
(1)有机酸
有机酸含量测定参照国家标准GB/T 5009.157—2016《食品中有机酸的测定》中的高效液相色谱法[8]。 HPLC色谱条件:Spursil C18-EP色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为5%甲醇-95%磷酸二氢铵溶液(6 g/L,pH值2.60);流速0.8 mL/min;进样体积5 μL;柱温30 ℃;紫外检测器(ultraviolet detector,UVD);检测波长210 nm。
定性分析:分别配制1 mg/mL草酸、丙酮酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、焦谷氨酸,按照有机酸出峰时间进行定性。
定量分析:准确称取草酸10 mg,丙酮酸20 mg,酒石酸32 mg,苹果酸32 mg,乙酸640 mg,乳酸300 mg,琥珀酸100 mg,焦谷氨酸20 mg。将混标按梯度稀释,绘制标准曲线。 按照混标标准曲线回归方程计算样品中有机酸含量。
(2)游离氨基酸
游离氨基酸含量测定参照轻工行业标准QB/T 4356—2012《黄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法》[9]。HPLC色谱条件:C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为称取1.64 g无水乙酸钠,适量水溶解,加入0.5 mL三乙胺,用水定容至1 000 mL,用20%乙酸溶液调节pH至6.20,0.45 μm水系滤膜过滤;流动相B为80%的乙腈混合20%的水;等度洗脱,流速1.0 mL/min;进样体积10 μL;柱温40 ℃;检测波长254 nm。氨基酸含量通过氨基酸的标准校准曲线回归方程进行计算,并以nmol/mL表示。
(3)总多酚
总多酚含量:采用Folin-Ciocalteu法[10]测定。 以没食子酸质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标,绘制标准曲线,得到标准曲线回归方程y=1.421 2x-0.025 9,相关系数R2=0.993 9,根据标准曲线回归方程计算样品中总多酚含量。
(4)总黄酮
总黄酮含量:采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法进行分析[10],以芦丁质量浓度(x)为横坐标,吸光度值(y)为纵坐标,绘制标准曲线,得到标准曲线回归方程y=0.3267x+0.031 1,相关系数R2=0.994 9,根据标准曲线回归方程计算样品中总黄酮含量。
1.3.4 挥发性风味物质测定
利用顶空固相微萃取气质联用技术(headspace solidphase microextraction gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)进行成品醋中挥发性风味物质的测定[11]。取醋样12.5 mL置于20 mL顶空瓶中,加入100 μL 2-乙基丁酸内标物(18.4 mg/mL),用带有硅橡胶隔垫的瓶盖密封。 将顶空瓶放入50 ℃水浴锅平衡10 min,然后将已在240 ℃进样口老化至无杂峰的萃取头插入顶空瓶中距离液面1 cm处,50 ℃下吸附30 min,取出后插入GC进样口,240 ℃下解吸2 min,进行GC-MS分析。
GC条件:使用DB-WAX色谱柱(60m×0.25mm×0.5μm),进样口温度设置为240 ℃,采用不分流进样方式,载气为高纯氦气(He),且使用恒流模式。柱流速设定为1 mL/min。程序升温的过程为:将柱温设定为30 ℃并保持6 min,以2 ℃/min的速度升温至140 ℃,接着以4 ℃/min的速率升高至220 ℃,并在220 ℃下保持10 min。
MS条件:采用电子电离(electronic ionization,EI)源,离子源温度为230 ℃,四极杆温度控制在150 ℃,质量扫描范围设定为33~500 m/z。
定性定量方法:GC-MS数据通过美国国家标准技术研究所(National Institute of Standards and Technology,NIST)14.0数据库进行初步比对和鉴定,结合样品组分的保留时间和质谱特征进一步确认其定性。采用内标法定量,各挥发性风味物质含量计算公式如下:
式中:C为内标物质量浓度,mg/mL;S1为各风味物质的峰面积;S2为内标物的峰面积;C1为各挥发性风味物质含量,mg/mL。
1.3.5 抗氧化活性测定
参照ROY S等[12]的方法测定DPPH自由基清除率;参考CHEN W D等[13]的方法测定ABTS自由基清除率。
1.3.6 感官特征分析[14]
采用定量描述分析(quantitative descriptive analysis,QDA)对不同工艺发酵醋进行感官评价。评价小组由10名经过培训的成员(5名男性和5名女性,18~30岁)组成。成员首先独立形成醋的感官特征描述词,随后进行组合讨论,确定11个感官描述特征:色泽、透明度、酯香、醋香、焦香、酸味、甜味、咸味、苦味、鲜味、涩味。小组成员被要求在0~9分的范围内记录每种特征强度(0=没有,5=中等,9=极强)。对食醋的感官特征逐项进行评定打分,收集每一位评定人员对不同醋样的评价结果,进行统计分析,绘制不同发酵醋的感官评分雷达图。
1.3.7 数据分析
实验数据结果均以“平均值±标准差”表示,采用SPSS 22.0进行单因素方差分析(P<0.05为差异显著)和Spearman相关性分析。
氨基酸态氮的含量可以较好地评价醋的品质,品质较好的醋样通常氨基酸态氮含量也较高[15]。两种发酵工艺食醋醋样中总酸、还原糖和氨基酸态氮测定结果见表1。 由表1可知,4个醋样的理化指标均满足国标GB 2719—2018《食品安全国家标准食醋》要求。M1和M3的还原糖和氨基酸态氮含量显著高于M2和M4,但是总酸含量(58.29 g/L、45.38 g/L)显著低于深层发酵醋(60.79 g/L、70.26 g/L)(P<0.05)。 深层醋采用大罐发酵,能更好地控制温度、氧气供应等,促进醋酸菌的生长,从而使醋酸发酵更加充分,产生更多乙酸,所以酸度更高[16]。但由于工艺的简化,深层醋氨基酸态氮和还原糖含量都不如传统发酵醋,推测是因为传统发酵醋中由于大米原料持续存在并参与发酵,糖分和氮源得以保留并通过多样化微生物反应转化,而深层醋直接使用酒精发酵,缺少原料和多样化微生物,因此氨基酸态氮和还原糖含量较低。M4中氨基酸态氮含量(0.16g/100mL)显著高于M2(0.13 g/100 mL)(P<0.05),由此可以看出黄酒为酒醪替代食用酒精的M4可以提高食醋氨基酸态氮含量。结果表明,传统自然半固态发酵醋相较于深层液态发酵醋具有更高还原糖、氨基酸态氮含量,理化品质更高。
表1 传统半固态自然发酵醋与液态深层发酵醋醋样理化指标测定结果
Table 1 Determination results of physicochemical indexes of vinegar samples with traditional semi-solid natural fermentation and submerged fermentation
注:同行不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。
项目 M1 M2 M3 M4总酸/(g·L-1)还原糖/(g·100 mL-1)氨基酸态氮/(g·100 mL-1)58.29±0.57a 0.89±0.01b 0.33±0.00a 60.79±1.34b 0.03±0.00c 0.13±0.01d 45.38±0.41c 1.92±0.01a 0.21±0.00b 70.26±0.11d 0.03±0.00c 0.16±0.00c
两种发酵工艺食醋醋样中有机酸种类及含量测定结果见表2。 由表2可知,共检测出8种有机酸,分别为草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、焦谷氨酸、乙酸、琥珀酸。 四种醋样有机酸含量排序依次为M4[(6 850.67±0.37)mg/100 mL]>M1[(6 139.80±0.60)mg/100 mL]>M2[(5 866.43±0.32)mg/100 mL]>M3,其中M2和M4乙酸含量显著高于M1和M3(P<0.05),而M1和M3中乳酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸含量均显著高于M2和M4 (P<0.05)。液态深层发酵的过程中氧气供应更加充足,使得醋酸菌能够更有效地将乙醇氧化为乙酸,而传统发酵由于氧气供应相对不足,导致乙酸生成速率较低。然而,传统半固态自然发酵工艺更有利于乳酸菌等其他微生物的生长,这些微生物能够产生乳酸、苹果酸、酒石酸和琥珀酸等多种有机酸,乳酸对风味有显著影响,过低的乳酸含量不利于风味形成[17],苹果酸表现出锐利的酸味,酒石酸带有苦涩感[18],而琥珀酸则具有清新的味道[15],这些有机酸的存在可以缓解发酵醋中醋酸的刺激,使其口感柔软,回味悠长[19],从而使传统发酵醋形成更复杂的风味。结果表明,传统自然半固态发酵醋相较于深层液态发酵醋具有更高的乳酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸含量,风味更加丰富。
表2 传统半固态自然发酵醋与液态深层发酵醋醋样中有机酸含量测定结果
Table 2 Determination results of organic acids contents in vinegar samples with traditional semi-solid natural fermentation and submerged fermentation mg/100 mL
注:“ND”表示未检出。
种类 M1 M2 M3 M4草酸酒石酸丙酮酸苹果酸乳酸乙酸焦谷氨酸琥珀酸总含量ND 8.19±0.00c 173.77±0.01a 706.13±0.33a 354.62±0.02a 3 873.88±0.15c 13.14±0.00a 1 010.08±0.21a 6 139.80±0.60b 3.97±0.01b 7.12±0.00d 92.75±0.00b 19.23±0.01c ND 5 638.99±0.37b 0.93±0.00d 186.91±0.04c 5 866.43±0.32c 1.08±0.00c 14.23±0.00a 9.18±0.00b 333.16±0.10b 102.00±0.03b 3 416.64±0.32d 1.66±0.00c 426.11±0.24b 4 386.69±0.69d 20.41±0.02a 9.97±0.00b 9.68±0.00b 35.85±0.00c 68.79±0.01b 6 427.72±0.05a 9.74±0.00b 217.73±0.33c 6 850.67±0.37a
两种发酵工艺食醋醋样中游离氨基酸种类及含量测定结果见图1。由图1可知,两种发酵工艺食醋醋样中共分析出17种游离氨基酸,其中包括异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、苏氨酸和赖氨酸等8种必需氨基酸。 四种醋样游离氨基酸总含量排序依次为M1(0.0193mmol/L)>M3(0.0123mmol/L)>M4(0.0066mmol/L)>M2(0.001 4 mmol/L)。 传统自然半固态发酵醋中各氨基酸含量均显著高于深层液态发酵食醋(P<0.05),M4氨基酸含量比M2高。 自然半固态发酵醋在游离氨基酸含量上优势明显,这是由于液态深层发酵过程中原料简略,发酵调控过程追求效率,导致氨基酸的生成量显著减少。 在滋味贡献上,不同发酵醋样中呈现苦味和甜味的氨基酸占主要成分,其中呈现甜味的丙氨酸含量最高(M1高达0.0378 mmol/L)。 M1和M3中呈现甜味和苦味氨基酸含量显著高于M2和M4,尤其是M1在甜味丙氨酸和苦味亮氨酸上表现最突出。结果表明,传统自然半固态发酵醋相较于深层液态发酵醋具有更高的氨基酸含量含量,风味更加丰富。
图1 传统半固态自然发酵醋与液态深层发酵醋醋样中游离氨酸含量及其贡献主要滋味
Fig.1 Free amino acids contents in vinegar samples with traditional semi-solid natural fermentation and submerged fermentation and their contribution to the main taste
采用HS-SPME-GC-MS技术分析两种发酵工艺食醋醋样的挥发性风味物质,结果见图2。由图2可知,四个醋样共检测出挥发性风味物质112种,其中醇类9种、醛类14种、酸类18种、酯类23种、酮类29种、酚类10种、烃类4种、杂环类5种。M1、M2、M3、M4分别共检出49种、42种、56种、70种挥发性风味物质,四种醋样挥发性风味物质总含量排序依次为M4(801.21 mg/L)>M3(615.16 mg/L)>M1(562.37 mg/L)>M2(241.03 mg/L)。M4挥发性风味物质总含量最高,这是因为其发酵原料为黄酒,而黄酒本身就含有大量的风味物质,说明液态深层发酵过程中原料的优化最显著改善醋的挥发性风味物质,使其总含量超过传统醋,但醛类和酮类仍处于较低水平,传统醋的各类风味物质分布更为均衡,尤其是酮类风味物质上的积累更加显著,其中丙酮、3-乙酰基-2-丁酮含量显著高于液态深层发酵醋。
图2 传统半固态自然发酵醋与液态深层发酵醋醋样中挥发性风味物质含量GC-MS分析结果
Fig.2 Volatile flavor substances contents in vinegar samples with traditional semi-solid natural fermentation and submerged fermentation analysis by GC-MS
在各醋样中酸类的含量最高(115.01~352.74 mg/L),主要是乙酸,其次是异丁酸、异戊酸、辛酸等。异戊酸是通过L-亮氨酸微生物降解形成[20],辛酸通常由乙醇发酵过程中产生,并在特定条件下通过氧化反应生成[21],辛酸具有特殊的香味和味道,可以增加醋的风味层次[22]。 其次是酯类,含量在92.28~288.06 mg/L,对改善醋的香气有关键作用,包括乙酸乙酯、乙酸乙烯酯等。M1和M3中酮类和醛类物质含量显著高于M2和M4(P<0.05),发酵过程中产生的酮类和醛类会增加醋的复杂风味,并且在一定程度上被认为是有益的,酮类是北京米醋的代表性香气,而醛类在山西陈醋和四川保宁醋中含量丰富[23]。结果表明,传统自然半固态发酵醋相较于深层液态发酵醋具有更高的酮类和醛类含量,风味更加丰富。
ABTS自由基清除率测定结果见表3。
表3 传统半固态自然发酵醋与液态深层发酵醋样中总多酚、总黄酮含量和抗氧化活性测定结果
Table 3 Determination results of total polyphenols, total flavonoids contents and antioxidant activities of vinegar samples with traditional semi-solid natural fermentation and submerged fermentation
项目 M1 M2 M3 M4总多酚/(mg·mL-1)总黄酮/(mg·mL-1)ABTS自由基清除率/%DPPH自由基清除率/%4.18±0.01a 0.28±0.03a 61.55±0.01a 78.09±0.55a 0.76±0.00b 0.05±0.01b 41.16±0.13b 52.47±0.09b 3.12±0.00a 0.23±0.00a 80.02±0.04b 55.95±0.34a 2.55±0.08a 0.11±0.02b 69.51±0.27a 20.58±0.24b
由表3可知,M1和M3中总多酚和总黄酮含量均高于M2和M4,且M1和M3的DPPH自由基清除率(61.55%、78.09%)、ABTS自由基清除率(80.02%、55.95%)均显著高于M2(41.16%、52.47%)和M4(69.51%、20.58%)(P<0.05)。食醋中的抗氧化物质总多酚和总黄酮,能够调节体内的氧化与抗氧化系统,防止过氧化反应,有助于预防疾病、延缓衰老和提升免疫力[24]。传统醋相较于深层醋抗氧化活性成分含量更高,说明发酵工艺不同对醋的品质和营养价值均有着显著影响。这种差异可能源自于传统自然发酵过程中利用了更多的天然微生物和酵母菌,从而产生了更多的总多酚和总黄酮等活性成分[24]。 结果表明,传统自然半固态发酵醋相较于深层液态发酵醋具有更高的抗氧化活性,品质较好。
采用QDA比较不同醋样感官特性,对其筛选出的11种感官特征进行评分,结果见图3。由图3可知,两类醋样在色泽、透明度、酯香、醋香、酸味、苦味、涩味和鲜味方面感官评分均存在显著差异(P<0.05),而在甜味和咸味上无差异(P>0.05)。M1和M3在色泽、鲜味、甜味和酯香方面感官评分都高于M4和M2,深层醋M4鲜味显著高于M2,这是由于相较于传统醋的制备工艺,深层醋发酵原料简化,工艺简单,使得制备的醋样风味单一,且苦涩味更加明显,风味口感较差[25]。 但由于M4的酿造原料为黄酒,其本身提供大量风味成分,因此M4相较于M2具有更浓郁的鲜味。
图3 传统半固态自然发酵醋与液态深层发酵醋醋样感官评价雷达图
Fig.3 Radar map of sensory evaluation of vinegar samples with traditional semi-solid natural fermentation and submerged fermentation
“*”表示差异显著(P<0.05),“**”表示差异极显著(P<0.01),“***”表示差异高度显著(P<0.001)。
两种发酵工艺食醋醋样的理化性质、活性成分、挥发性化合物及感官特性之间的相关性分析结果见图4。
图4 传统半固态自然发酵醋与液态深层发酵醋醋样理化指标、活性成分、挥发性风味物质及感官特征相关性分析结果
Fig.4 Correlation analysis results among physicochemical indexes,active components, volatile flavor substances and sensory characteristics of vinegar samples with traditional semisolid natural fermentation and submerged fermentation
“*”代表显著相关(P<0.05),“**”代表极显著相关(P<0.01),“***”代表高度显著相关(P<0.001)。
从红到蓝颜色越深代表含量越高,颜色越浅代表含量越低。
由图4可知,草酸与苦味、焦谷氨酸与醋香、苹果酸与甜味呈显著正相关,表明有机酸对醋样的感官特性有重要影响,且它们之间存在密切联系。丙酮与酯香、琥珀酸、苹果酸等挥发性化合物呈正相关,3-乙酰基-2-丁酮与甜味和酯香等呈正相关,表明丙酮和3-乙酰基-2-丁酮对醋的感官属性有积极贡献。理化指标中,氨基酸态氮与酯香、鲜味和甜味呈正相关,且鲜味与酒石酸呈显著相关性,表明氨基酸态氮和酒石酸对醋的鲜味和甜味感官属性有增强作用。挥发性化合物(如丙酮和3-乙酰基-2-丁酮)和非挥发性化合物(如有机酸)显著影响了醋的整体风味,特别是在香气和味道的层次感上。醋中的理化指标(如氨基酸态氮、酸度等),受到不同有机酸和氨基酸的影响,对醋的风味平衡和复杂性起到了关键作用。因此,发酵过程中各类化合物不仅在各自的感官属性上有所体现,还通过交互作用共同塑造醋的独特风味。
本研究比较了传统自然半固态发酵食醋与深层液态发酵食醋的理化指标、活性成分、挥发性风味物质和感官特性,结果表明,传统自然半固态发酵食醋在还原糖、氨基酸态氮、游离氨基酸、有机酸含量上显著高于深层液态发酵食醋,且具有更高抗氧化活性和更多样的挥发性风味物质。传统自然半固态发酵醋在色泽、鲜味、甜味和酯香等感官属性上优于深层液态发酵食醋。 相关性分析表明,有机酸、挥发性化合物和理化指标通过相互作用共同塑造醋的风味,草酸、焦谷氨酸和苹果酸与醋的苦味、醋香和甜味具有较强的相关性,丙酮和3-乙酰基-2-丁酮有助于提升醋的酯香和甜味,氨基酸态氮和酒石酸增强醋的鲜味和甜味。
以黄酒为醪液在风味上优于以食用酒精为醪液的深层醋,深层液态发酵食醋的醪液以黄酒替代食用酒精显著的提升了醋的挥发性风味物质和游离氨基酸含量,也一定程度上提升了总多酚含量和ABTS自由基清除率,并使深层液态发酵食醋感官上的鲜味获得较大提升。 研究结果为优化传统半固态发酵醋的现代化生产工艺和产品品质提供了重要参考。
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Quality comparison of vinegar with traditional semi-solid natural fermentation and submerged fermentation from Zhejiang