菠萝(Ananas conous L.Merr.)又名凤梨,是典型的热带、亚热带水果,其果形美观,汁多味甜,富含多种氨基酸、维生素和矿物质,具有清热、解暑、利尿、消食等生理功效[1-3]。但因含水量较高,果肉组织结构疏松、质地脆弱、耐贮性差、采后易损伤而腐烂变质等,导致菠萝的鲜食消费受地域限制严重,造成资源大量浪费[4-5]。 因此,提升菠萝鲜食质量,完善菠萝的罐藏、干制与发酵加工技术,强化菠萝延链产业发展,已成为改善我国目前菠萝产业现状,提高果农收益和积极性,实现乡村振兴的必要措施。
菠萝香气浓郁,糖酸比协调,是优良的果酒酿造原料。关于菠萝果酒酿造工艺优化[3-4,7]、复合菠萝果酒研制[8-9]、果酒酵母优选[10]与挥发性成分鉴定[6,11]的研究报道较多,意味着目前菠萝果酒发酵加工技术相对成熟。但众所周知,菠萝中存在大量蛋白酶和果胶类物质,发酵前对菠萝汁进行澄清处理可吸附大量的氧化酶和不利于酒体风味形成的涩味物质,有利于改善菠萝果酒风味的积累并提高其氧化稳定性[12]。 烫漂是果蔬加工中较成熟的预处理技术,在钝化酶活性、稳定色泽、减少微生物数量以及增加生物活性成分提取率等方面发挥重要作用[13]。
本研究以新鲜菠萝为试材,采用恒温(22±1)℃发酵工艺制备菠萝果酒。通过测定菠萝果浆发酵过程中糖/酸含量、总酚和抗氧化能力、菠萝果酒中挥发性物质含量及其感官特征等指标,探讨果浆烫漂处理(95 ℃,120 s)对菠萝果酒发酵性能与风味品质的影响,以期为菠萝果酒品质提升技术优化提供数据与方法参考,并进一步完善菠萝精深加工技术体系,推动全产业链条提质增效发展,助力乡村振兴。
“巴厘”品种菠萝:海南市售;酿酒活性干酵母SIHAActive-Yeast 3:德国Eaton Technologies GmbH公司。 果胶酶(1×105 U/g):德国E.BEGEROW GmbH 公司;白砂糖、焦亚硫酸钾(均为食品级):市售。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,4,6-三 吡 啶 基 三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ)(纯度≥99%):上海源叶生物科技有限公司;56种白酒标样、叔戊醇、乙酸正丁酯、2-乙基丁酸(均为色谱纯):中国食品发酵工业研究院有限公司;其他试剂均为国药集团(上海)化学试剂有限公司分析纯试剂。
LRH-250生化培养箱:上海一恒科学仪器有限公司;UV-2600分光光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司;ME104分析天平、FE20酸度计:梅特勒-托利多(上海)(仪器有限公司;GC-2010 Plus气相色谱仪:岛津企业管理(中国)有限公司;VWRI444-0635集热式恒温加热磁力搅拌器:美国VWR公司。
1.3.1 菠萝果酒加工工艺流程及操作要点
操作要点:
预处理:新鲜菠萝经去皮(果肉得率约为75%)后与等质量的纯净水混合打浆,得到菠萝果浆。
烫漂处理:菠萝果浆加热至95 ℃保持120 s[14]。
酶解:经过漂烫处理菠萝果浆冷却后添加50 mg/L的SO2和50 mg/kg的果胶酶,常温条件下静置12 h。
成分调整:向菠萝果浆中添加白砂糖,调整总糖含量至220 g/L[15]。
控温发酵:按0.4 g/L添加酿酒活性干酵母,(22±1)℃控温发酵。每2 d取样测定发酵液中总糖、还原糖、总酸、总酚含量,以及pH值、DPPH自由基清除率、FRAP值等指标至糖不再变化为止。
过滤除渣:使用四层纱布过滤分离菠萝果渣,得到菠萝原酒。
陈酿、澄清:菠萝原酒自然静置陈酿1~2个月,分离酒脚后澄清处理。
过滤、灌装:澄清酒液经0.45 μm滤膜过滤后灌装,即得成品菠萝果酒。
1.3.2 分析检测
(1)基础理化指标分析
总糖、还原糖、总酸、pH、酒精度、挥发酸:参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[16];总酸(以柠檬酸计):参照国标GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》[17];总酚:采用福林酚比色法[15];维生素C(vitamin C,VC):采用2,6-二氯靛酚滴定法[18]。 菌落总数:参考GB 4789.2—2022《食品微生物学检验 菌落总数测定》[19];大肠菌群:参考GB 4789.3—2016《食品微生物学检验 大肠菌群计数》[20]。
(2)抗氧化能力分析
DPPH自由基清除率[15,21]:分别以0.10 g/L的VC、0.05 g/L的没食子酸作对照,待测样品0.6mL加入0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液3.9 mL,混匀后37 ℃避光水浴1 h,波长517 nm处测定吸光度值A。DPPH自由基清除率计算公式如下:
式中:A0为用蒸馏水代替样品溶液时的吸光度值,A1为被测样品的吸光度值,A2为用无水乙醇代替DPPH溶液时的吸光度值。
FRAP值[15,21]:以0.1 g/L的VC、0.05 g/L的没食子酸作对照,待测样品0.1 mL、FRAP溶液(pH=3.6、0.3 mol/L的醋酸盐缓冲液25 mL、10 mmol/L的TPTZ溶液2.5 mL、20 mmol/L的FeCl3溶液2.5 mL混合,现用现配)4 mL混匀,37 ℃反应10 min,波长593 nm处测定吸光度值。以1.0 mmol/L的FeSO4为标准,样品FRAP值以达到同样吸光度值时所需FeSO4的毫摩尔数表示。
(3)挥发性风味成分分析
以叔戊醇、乙酸正丁酯、2-乙基丁酸为内标物,采用气相色谱-氢火焰离子检测器(GC-FID)法测定菠萝果酒蒸馏液中的挥发性风味组分[15,22]。 GC-FID测试条件:Agilent CP-wax57色谱柱(50m×0.25mm,0.2μm),氮气流速1mL/min,分流比40∶1,起始温度35 ℃,恒温4 min,以4 ℃/min升温至60 ℃,再以10 ℃/min升温至130 ℃,然后以15 ℃/min升温至205 ℃,恒温15 min;进样口温度240 ℃,检测器温度260 ℃;进样量1 μL。
定性定量方法:根据白酒标样中已知标准风味组分的保留时间定性,采用内标法定量[23]。
(4)感官评价
按照国标GB/T 16291.1—2012《感官分析.选拔、培训与管理评价员一般导则 第1部分:优选评价员》中的方法组建10人品鉴小组[24]。参照国标GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[16]和HE W J等[25]的方法制定菠萝酒感官评分标准见表1,满分100分。
表1 菠萝果酒感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of pineapple fruit wine
评分/分4~6 7~10外观项目 0~3香味柠檬、西柚、柑橘、菠萝、香蕉、荔枝、哈密瓜、樱桃、水蜜桃、杏、桃子、梨、苹果蜂蜜、玫瑰、椴花黄油、香草、焦糖坚果香(杏仁、核桃、榛子)、烘焙香(烟熏苹果、烤面包、烤栗子)、木头(咖啡、巧克力、枫糖浆)生青、皮革、金属、霉味、蒸煮味、化学试剂等口感色泽、澄清度果香花香发酵香陈酿香风味缺陷纯正度优雅度协调性典型性棕褐色、浑浊有沉淀物果味寡淡无花香味无发酵香无陈酿香缺陷风味明显,不愉悦欠纯正欠优雅酒体淡薄,欠协调欠典型琥珀色、澄清透明果香明显花香淡薄发酵香寡淡陈酿香淡薄缺陷风味明显,不愉悦较纯正较纯正酒体较协调较典型淡黄色、澄清透明有光泽果香突出,优雅、浓郁、协调花香明显、芬芳宜人发酵香气突出陈酿香明显无缺陷味道纯正优雅酒体协调,酸甜苦味恰到好处典型
1.3.3 数据处理
所有数据为3次重复发酵试验制备菠萝果酒测试结果的平均值。采用SPSS27.0软件对数据进行相关性和差异性分析,显著性检验的置信水平为P<0.05。
由图1可知,随着酿酒酵母的生长,可发酵性糖逐渐被利用转化成酒精、二氧化碳和其他副产物,含量逐渐降低。 对照组发酵6 d时,总糖含量由初始221.9 g/L降低至3.6 g/L,此后无显著性变化。 对照组和烫漂菠萝果浆均在发酵第2~4天时表现出最大降糖速率。但与对照组相比,烫漂处理组菠萝果浆发酵过程中的降糖速率滞后,10 d时方可完成酒精发酵,总糖含量降至3.9 g/L。10 d发酵结束时,对照组和烫漂处理组菠萝果酒中总糖含量均达到干型果酒总糖含量要求(≤4.0 g/L)[15],且无显著性差异。菠萝果酒发酵过程中还原糖和总糖的变化趋势一致。对照组发酵第6天时,还原糖含量降低至3.2 g/L,此后同样无显著性变化;烫漂组发酵第10天时,还原糖含量降低至3.4 g/L。综上所述,菠萝果酒发酵2~6 d时,总糖和还原糖表现出最大变化量,此阶段酵母处于对数期生长,数量迅速增加,糖的转化率显著提高,与此前报道的蜂蜜酒[26]、仙人掌果酒[27]发酵动力学研究结果一致。果浆烫漂处理导致菠萝发酵过程中降糖速率降低、发酵时间增加,在一定程度上有利于果酒风味物质的积累,但并未影响果酒中的最终糖含量。
图1 菠萝果酒发酵过程中总糖(A)及还原糖(B)含量的变化
Fig.1 Changes of total sugar (A) and reducing sugar (B) contents during pineapple fruit wine fermentation process
由图2A可知,烫漂处理影响发酵过程中菠萝总酸含量的变化。对照组滴定酸的含量先升高后降低,发酵4 d后总酸含量无显著性变化。烫漂处理使菠萝果肉组织结构被破坏,酸组分充分释放,发酵2 d内,烫漂处理菠萝发酵液中可滴定酸含量迅速增加,但发酵2 d后,可滴定酸含量无显著性变化。对照组菠萝果肉中酸组分在初始发酵液中未完全释放,导致其缓冲性增加,使可滴定酸在发酵第2天时出现峰值(7.40 g/L)。 可滴定酸含量的高低会影响发酵液的pH值,继而改变酵母细胞的繁殖能力,营养物质的吸收与代谢速率。由图2B可知,菠萝果酒的pH值在发酵过程中呈现先升高后降低的变化趋势,烫漂处理组和对照组的pH值均在发酵第6天时达到最高值,分别为3.56和3.74。 总酸含量和pH值间并未表现出直接相关性,但总酸和pH值的变化表明,酵母代谢活动改变了发酵液中有机酸的含量和组成。总之,果浆烫漂处理使菠萝果酒中总酸含量显著增加,但未带来果酒pH值的显著性改变。
图2 菠萝果酒发酵过程中总酸含量(A)及pH值(B)的变化
Fig.2 Changes of total acid contents (A) and pH values (B) during fermentation process of pineapple fruit wine
多酚类化合物包括绿原酸、表儿茶素和芦丁等,是表现抗氧化活性的主要物质。 由图3A可知,对照组与烫漂处理组菠萝果酒发酵过程中总酚含量均表现出先升高后降低,继而趋于平稳的变化规律,与仙人掌酒发酵过程中总酚含量变化趋势一致[27]。对照组总酚含量在发酵第4天时达到最大值(2.32 g/L),发酵6 d后无显著性变化。烫漂处理组总酚含量在发酵第2天时达到最大值(1.79 g/L),同样是发酵6 d后无显著性变化。 与对照组相比较,烫漂处理组发酵液中总酚含量增幅大、降幅小,到达峰值的时间短;相同发酵时间发酵液中总酚含量显著低于对照组,说明烫漂作用导致菠萝发酵液中总酚含量降低。发酵结束时菠萝果酒中总酚含量比发酵前显著增加,其中对照组菠萝果酒中总酚含量为2.05 g/L,烫漂处理菠萝果酒中总酚含量为1.64 g/L,测定结果高于先前报道的石榴酒[28]、无花果酒[15]中总酚含量,但低于葡萄酒中总酚含量[29]。
图3 菠萝果酒发酵过程中总酚(A)及抗坏血酸(B)含量的变化
Fig.3 Changes of total phenols (A) and ascorbic acid (B) contents during pineapple fruit wine fermentation process
由图3B可知,菠萝果酒发酵过程中对照组和烫漂处理组菠萝酒中VC含量的变化趋势相同,呈现先升高后降低的变化趋势。 烫漂后菠萝发酵液中VC的含量始终低于对照组。在发酵第8天时,对照组和烫漂发酵菠萝酒中VC的含量均达到峰值,分别为70.7 mg/L和59.8 mg/L。 菠萝发酵过程中VC的变化规律与在刺梨发酵果酒中的变化趋势一致[30]。 发酵过程中酒精含量增加使更多的VC溶解在发酵液中,发酵结束时酒精含量稳定,VC含量达到峰值,尔后外界环境中光、氧等因素的影响可能会导致VC降解[31],菠萝酒中VC含量开始下降。
由图4可知,菠萝果酒的DPPH自由基清除率随发酵时间先增加后趋于稳定,与龙葵果自然发酵产物清除DPPH自由基能力的变化趋势一致[32]。发酵6 d后,对照组的DPPH自由基清除率再无显著性差异,而烫漂处理发酵液的DPPH自由基清除率在发酵8 d后不再有显著性变化。 相同发酵时间烫漂处理菠萝发酵液的DPPH自由基清除率均显著低于对照组。 热作用使原本与氢过氧游离基迅速反应的抗氧化物质的反应速度变慢,难以接近DPPH自由基,对DPPH自由基的清除能力降低[33]。 与阳性对照相比,对照组与烫漂处理组菠萝发酵液的DPPH自由基清除能力均显著低于0.10 g/L VC和0.05 g/L没食子酸;其中对照组菠萝果酒对DPPH自由基的清除能力分别为VC和没食子酸的93.1%和91.0%,而烫漂处理组菠萝果酒DPPH自由基的清除能力仅为VC和没食子酸的82.8%和80.9%。
图4 菠萝果酒发酵过程中1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率的变化
Fig.4 Changes of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging rates during pineapple fruit wine fermentation process
由图5可知,对照组与烫漂处理菠萝发酵液的FRAP值均随发酵时间呈现先增加后降低的变化趋势。酒精发酵第4天时FRAP值均达到最大值,对照组为1.84 mmol/L,烫漂组为1.12 mmol/L;发酵4~8 d期间,发酵液的FRAP值无显著变化;发酵8 d后,酒精发酵结束,对照组与烫漂菠萝果酒的FRAP值开始降低,并在发酵第10天时显著下降。与DPPH自由基清除率的比较结果不同,对照组菠萝果酒的FRAP值均显著高于VC(0.10 g/L)和没食子酸(0.05 g/L);发酵4~8 d时,烫漂组菠萝发酵液的FRAP值与没食子酸的FRAP值无显著差异,发酵10 d时烫漂菠萝果酒与VC的FRAP值无显著性差异。 此外,烫漂菠萝发酵液的FRAP值均显著低于对照组(P<0.05)。
图5 菠萝果酒发酵过程中铁离子还原/抗氧化能力值的变化
Fig.5 Changes of Ferric ion reducing/antioxidant power values during pineapple fruit wine fermentation process
图6 菠萝果酒感官特征评价雷达图
Fig.6 Radar map of sensory characteristics evaluation of pineapple fruit wine
果浆烫漂处理导致菠萝发酵液及果酒的DPPH自由基清除率和FRAP值显著低于对照组,说明烫漂处理显著降低菠萝果酒的抗氧化能力,这与果浆烫漂后果酒中总酚、VC含量的降低直接相关[34-35]。
2.5.1 菠萝果酒中的挥发性风味组分
菠萝品质、酵母种类、发酵方式与果酒的贮存条件等因素均可影响酵母代谢产物(包括高级醇、有机酸、酯类等),继而改变发酵酒的风味品质与感官特征。发酵前烫漂处理菠萝果浆可实现钝化蛋白酶、多酚氧化酶等酶活性,除去不良风味,形成良好的色泽和香气,维持稳定的发酵环境等[36]。
由表2可知,采用GC-FID法从菠萝果酒样品中共检出24种挥发性成分,其中醇类11种,酯类5种,酸类5种,醛类2种,酮类1种。 烫漂处理组和对照组菠萝果酒分别共检出22种挥发性风味组分, 对照组未检出甲酸乙酯和己酸乙酯,烫漂处理组未检出糠醛和3-羟基-2-丁酮。在所有醇类组分中,菠萝果酒中异戊醇含量最高,其次是活性戊醇、异丁醇、2,3-丁二醇和β-苯乙醇,正丁醇、正戊醇和1,2-丙二醇含量相对较低;乳酸乙酯和乙酸乙酯是菠萝果酒中最主要的酯类物质,乙酸是菠萝果酒中最主要酸类物质,但远低于果酒中乙酸的限量要求(1.2 g/L)。由GC-FID测试结果可知,烫漂处理显著降低菠萝果酒中正丙醇和异丁醇含量,但正丁醇、正戊醇、异戊醇、丁二醇、糠醇和β-苯乙醇含量显著增加,这与酵母生长过程中糖代谢生成酮酸合成高级醇的速率有关[37]。 另外,菠萝果浆烫漂处理增加酯类物质种类,导致乙酸乙酯和乳酸乙酯含量显著降低,乙酸和丁酸含量显著降低,但丁酸、异丁酸含量显著增加。
表2 菠萝果酒中的挥发性风味成分含量测定结果
Table 2 Determination results of volatile flavor components contents in pineapple fruit wine
注:“--”表示该物质未检出。下同。
化合物含量/(mg·L-1)对照组 烫漂处理组正丙醇正丁醇异丁醇正戊醇异戊醇活性戊醇1,2-丙二醇2,3-丁二醇内消旋2,3-丁二醇糠醇β-苯乙醇甲酸乙酯乙酸乙酯己酸乙酯乳酸乙酯癸酸乙酯乙酸丁酸异丁酸戊酸己酸乙醛糠醛3-羟基-2-丁酮(醋翁)18.16±0.86a 0.87±0.00b 64.10±0.00a 0.50±0.00b 169.54±2.42b 58.83±2.17a 1.15±0.67ab 53.16±2.29b 9.62±11.40a 5.74±1.84b 36.77±1.46b--72.27±0.33a--156.32±9.11a 0.76±0.05b 221.29±6.21a 0.75±0.24b 1.71±0.22b 5.57±0.38a 4.17±0.60a 42.25±2.22a 11.73±2.10a 3.38±0.12a 13.41±1.66b 1.14±0.15a 52.81±2.50b 1.30±0.27a 214.99±6.99a 62.37±0.13a 1.34±0.34a 59.98±0.98a 10.34±0.38a 11.55±0.65a 43.00±1.58a 6.60±0.00a 53.40±0.50b 0.54±0.00a 12.81±0.01b 1.04±0.14a 167.95±5.70b 1.37±0.27a 3.08±0.19a 3.49±0.36b 4.07±0.19a 23.42±1.27b——
与对照组相比,果浆烫漂处理一方面能够丰富菠萝酒中风味物质的种类,改变其组成特征从而改善风味的协调性,另一方面有利于降低或消除果酒中乙醛、糠醛和醋翁等不良风味物质,以提高菠萝酒的风味适应性和适口性。
2.5.2 菠萝果酒的品质指标
由表3可知,菠萝果酒的酒精度均超过12.0%vol,对照组和烫漂处理组的可发酵性糖发酵转化量均占初始总糖含量的97%以上,说明本试验所选酿酒干酵母具有较好的发酵能力。 对照组与烫漂发酵菠萝果酒中总糖、还原糖、总酸、干浸出物和挥发酸等指标均符合国标GB/T 15037—2006《葡萄酒》、NY/T1508—2017《绿色食品 果酒》要求,菌落总数、大肠菌群均未检出,符合国家微生物检测标准。果浆烫漂处理并不影响菠萝果酒的酒精度和总SO2含量,但是显著降低果酒的干浸出物和挥发酸含量。
表3 菠萝果酒的品质指标分析结果
Table 3 Analysis results of quality indexes of pineapple fruit wine
项目 对照组 烫漂处理组酒精度/%vol干浸出物/%挥发酸/(g·L-1)总SO2/(mg·L-1)感官评分/分菌落总数/(CFU·mL-1)大肠杆菌/(CFU·mL-1)12.1±0.1a 16.2±0.1a 0.3±0.0a 89.0±1.4a 84.0±3.5b——12.0±0.1a 13.9±0.2b 0.2±0.0b 92.0±2.1a 89.7±0.4a——
比较2种菠萝果酒的外观色泽可知,对照组果酒色泽金黄,烫漂处理组菠萝果酒澄清剔透,色泽差异不明显。在挥发性香气特征方面,对照组果香更加浓郁突出,可能与更高的乙酸乙酯(菠萝香、水果香)、乳酸乙酯(水果香)含量有关[38]。β-苯乙醇赋予果酒花香味,因此烫漂处理组果酒的花香特征得分高于对照组[39]。 与对照组相比,烫漂处理组果酒的发酵香与陈酿香更明显,且烫漂处理可降低或消除发酵酒中部分不良风味物质,风味缺陷大大降低[40]。在口感方面,烫漂处理组尽管总酸含量较低,但其酒体更加协调醇厚,口感更纯正,平衡性更好。 在典型性方面,对照组与烫漂处理组均呈现菠萝果酒的典型风味,很好保留了菠萝果实本身的香气特征。 烫漂处理在改善菠萝酒风味、提升感官品质方面效果突出。
烫漂处理能够减缓菠萝发酵过程中降糖速率,延长发酵时间,导致发酵过程及成品果酒中总酚、VC和乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量显著降低,抗氧化能力减弱,但果浆烫漂处理同时可丰富菠萝果酒中酯类物质的种类,降低或消除菠萝果酒中的醛类和醋翁等不良风味物质。烫漂处理菠萝果酒的色泽金黄、晶莹剔透、优雅纯正、典型性好。其中对照组菠萝果酒的香气更浓郁,口感更清新,酒体更协调,口感更醇厚,总之,果浆烫漂处理可作为改善果酒风味、提升感官品质和产品安全性的有效手段应用于菠萝果酒的酿造。
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Effect of blanching on fermentation performance and flavor quality of pineapple fruit wine