酸面团是利用乳酸菌和酵母长时间反复共同发酵小麦粉或玉米粉和水而形成的，被作为发酵剂用于生产发酵面制品[1-2]。淀粉和蛋白质是面制品中的主要成分。研究发现，淀粉和蛋白的消化性和许多疾病具有密切的相关性，例如淀粉类食品的消化性和胃肠消化障碍以及低血糖等问题的关联性引起了研究人员对食品和健康领域的兴趣[3-4]；蛋白质的体外消化率越高，越容易被胃肠所利用[5-7]。发酵有利于提高最终产品的淀粉和蛋白质的体外消化率。酵母菌在发酵过程中可以通过糖酵解作用产生乙醇和CO2，CO2可以使面团膨胀，从而产生疏松气孔，改善了产品的质构性，相关酶类就可以更容易和淀粉发生作用，增加淀粉的体外消化率[8]。同时，酵母菌在其自身的生长代谢过程中，可以产生各种蛋白酶，分解蛋白质，提高蛋白质的体外消化率[9]。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酸面团中的主要优势酵母菌，是人类最早实现工业化规模生产的微生物种类，也是现如今在酵母种属中应用最为广泛的菌株之一[10-12]。在酸面团的制作过程中，由于酿酒酵母被多次的传代和保藏，造成了优良菌株发酵性能的衰退，所以要对菌株进行选育，恢复其优良的性能，保证菌株的长期稳定显得格外重要。
河南省地处中原腹地，当地居民喜爱面食，有着悠久的发酵面制品历史。 本研究以郑州、南阳、安阳、周口、商丘、三门峡6地采集的传统酸面团样品为研究对象，采用传统培养分离法从中分离酵母菌，通过分子生物学技术对其进行种属鉴定，并对其发酵性能进行研究，以期为开发性状优良的直投式发酵剂菌种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
传统发酵酸面团：采自郑州、南阳、安阳、周口、商丘、三门峡6地的手工馒头店，均为自然发酵形成；安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；小麦粉：郑州金苑面业有限公司。
1.1.2 化学试剂
氢氧化钠、葡萄糖、乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；酚酞（分析纯）：天津福晨化学试剂有限公司；酵母基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物、2×San Taq PCR Mix：上海生物工程股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基[13]：胰蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，酵母浸粉10 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。YPD固体培养基：在YPD液体培养基中添加琼脂20 g/L。
1.2 仪器与设备
YXQ-LS-50S高压蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2FD双人超净工作台：海跃进医疗器械有限公司；DNP-9272恒温培养箱：上海鸿都电子科技有限公司；TDS-10 pH计：上海力辰邦西仪器科技有限公司；Super Mini Dancer调速型迷你离心机：生工生物工程（上海）股份有限公司；Master-cycler PCR仪：德国Eppendorf公司；DYY-6C型电泳仪：北京六一仪器厂；GelDoc-ItTS3凝胶成像系统：美国UVP公司；Pico-21台式离心机：美国Thermo Fisher公司。
1.3 方法
1.3.1 酵母菌的分离纯化
分别取5.00 g酸面团样品置于含有45 mL无菌生理盐水的三角瓶中，在30 ℃、150 r/min条件下振荡1 h，使酸面团中的微生物充分溶解于生理盐水中，即为菌悬液。用无菌生理盐水将菌悬液按10倍梯度依次稀释至10-6，分别选取10-4、10-5和10-6三个梯度的稀释液0.2 mL均匀涂布在YPD固体培养基上，倒置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h。待菌落长出后，挑取表面光滑湿润、中间隆起的具有典型酵母菌形态特征的单一菌落于YPD液体培养基中，30 ℃培养48 h，挑取菌液分别在YPD固体培养基上划线分离3～4次，直至得到单菌落。将分离菌株分别接种于YPD固体培养基试管斜面上，并进行编号，保藏于4 ℃冰箱中备用[13]。
1.3.2 分子生物学鉴定
按照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书的操作方法提取分离菌株的基因组DNA，以其为模板，采用真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）的通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增，PCR扩增体系：引物ITS1、ITS4（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，双蒸水（ddH2O）10.5 μL。PCR扩增条件[13]：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank数据库中，利用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性比对搜索。选取同源性较高的模式菌株的ITS基因序列，采用MEGA 6.0软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。
1.3.3 酵母菌菌株的耐受性分析
耐酸能力分析：将分离菌株划线接种于YPD固体培养基中，30 ℃条件下活化18 h。 挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，30 ℃、100 r/min条件下培养18 h，得到种子液，菌体浓度为107 CFU/mL。 以6%（V/V）的接种量将种子液接种到pH值分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的装液量为100 mL/250 mL YPD液体培养基中，在30 ℃、100 r/min条件下培养18 h，在波长600 nm处测定OD600nm值[14-15]。
耐乙醇能力分析：将分离菌株的种子液按照6%（V/V）的接种量接种于乙醇体积分数分别为10%、12%、14%、16%、18%和20%的100 mL YPD液体培养基中，在30 ℃条件下培养18 h，在波长600 nm处测定OD600nm值。
1.3.4 酵母菌发酵酸面团滴定酸度和pH的测定
酸面团的制备[16-17]：将分离菌株的种子液按照6%（V/V）的接种量接种到YPD液体培养基中，30 ℃、100 r/min条件下培养18 h，发酵液经5 000 r/min离心20 min，无菌水冲洗沉淀，重复3次，将菌泥添加到面团中（小麦粉与无CO2水的质量比是2∶1），使菌体浓度为108 CFU/g，混匀，30 ℃恒温培养。
测定不同发酵时间（0 h、40 min、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h）酸面团的滴定酸度和pH[18]。具体测定方法：取5 g酸面团放入盛有45 mL无CO2蒸馏水的三角瓶中，用磁力搅拌器搅拌30 min，静置10 min后用pH计测定酸面团的pH值；另外，用0.10 mol/L的NaOH标准溶液滴定，用pH计测定滴定终点pH为8.6，记录消耗NaOH体积的mL数即为滴定酸度。 重复3次取平均值。 以不添加酵母菌的面团作为空白。
1.3.5 酵母菌发酵酸面团发酵力的测定
以安琪酵母发酵的酸面团作为对照（CK），采用分离菌株分别发酵制备酸面团，参照曹斌辉等[19]的方法测定不同酸面团在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h体积的增加量。
1.3.6 数据处理与统计分析
每组试验设置3次重复，利用Excel2010、Origin 2021软件进行数据处理与作图，所有结果均以“平均值±标准差”形式表示。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的分离与鉴定
从6份传统酸面团样品中共分离纯化得到9株酵母菌菌株，分别为Y1-1（南阳酸面团）、Y1-2（南阳酸面团）、Y2-1（郑州酸面团）、Y2-2（郑州酸面团）、Y3-1（三门峡酸面团）、Y3-2（三门峡酸面团）、Y4-1（周口酸面团）、Y5-1（商丘酸面团）、Y6-1（安阳酸面团）。 基于ITS区基因序列，利用MEGA-X软件中的邻接法构建系统发育树，结果见图1。
图1 基于ITS区基因序列分离酵母菌菌株的系统发育树
Fig.1 Phylogenetic tree for isolating yeast strains based on ITS region gene sequence
由图1可知，菌株Y1-1与扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）聚于一支，其余8株菌均与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）聚于一支，亲缘关系最近。因此，鉴定菌株Y1-1为扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），其余8株菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。结果表明，在所采集的6份酸面团样品中，酿酒酵母是优势菌种。LANDIS E A等[20]对500份传统面食发酵剂的菌种多样性进行分析，结果显示，77%以上的样品酵母菌占比在50%以上；ZHANG G等[21]通过对河南、陕西等5个省份25份酸面团样品的真菌菌群多样性进行研究，发现其以酿酒酵母为优势菌，本研究结果与其一致。
扣囊复膜酵母是一种以淀粉为基质的子囊菌门（Ascomycota）二态型酵母，主要存在于面团、酒曲或含淀粉的发酵传统食品中[22]，具有分泌淀粉酶、酸性蛋白酶等多种酶的能力，也是酿酒前期的一大优势菌[23-25]。 SON E等[26]研究发现，在米根霉（Rhizopus oryzae）和酿酒酵母中添加扣囊复膜酵母混合发酵可以提高酒中的总酸、氨基态氮含量，并能显著降低酒体中有害物质和高级醇的含量，提高酒的质量。
2.2 酵母菌菌株的耐受性分析
2.2.1 耐酸能力分析
由于乳酸菌的存在，在面团的发酵过程中，会通过代谢产酸使面团的酸度增高，酸面团中的pH值一般在3.8～6.7之间[15]。由于面团pH值的降低，酵母菌的发酵和生长受到了抑制，所以酵母菌的耐酸能力也是酵母菌发酵性能中的一个重要的指标。 9株酵母菌菌株的耐酸能力见图2。 由图2可知，当pH为1.5～5.0之间，随着pH值的降低，所有酵母菌菌株的OD600 nm值均呈下降趋势，且8株酿酒酵母的OD600 nm值均高于扣囊复膜酵母Y1-1，以菌株Y2-1的生长最为旺盛。当pH为2.5时，扣囊复膜酵母Y1-1几乎不生长；当pH＜2.5时，8株酿酒酵母的生长均明显受到抑制，当pH为2.0时，菌株Y3-2几乎不生长；当pH为1.5时，菌株Y3-1、Y4-1、Y5-1、Y6-1几乎不生长。综上，8株酿酒酵母的耐酸性能优于扣囊复膜酵母Y1-1，扣囊复膜酵母Y1-1可耐受pH 3.0，8株酿酒酵母中，菌株Y1-2、Y2-1、Y2-2均可耐受pH 1.5，菌株Y3-1、Y4-1、Y5-1和Y6-1均可耐受pH2.0，菌株Y3-2可耐受pH为3.0。
图2 9株酵母菌菌株的耐酸能力分析结果
Fig.2 Results of acid resistance of 9 yeast strains
2.2.2 耐乙醇能力分析
酵母菌作为兼性厌氧菌，在有氧和无氧的条件下都能进行生长代谢，其中无氧条件下酵母菌的代谢产物是乙醇[17]。 乙醇的产生会抑制酵母菌的代谢，从而影响馒头的品质，所以酵母菌的耐乙醇能力是酵母菌发酵性能中的一个重要的指标。9株酵母菌菌株的耐乙醇能力见图3。由图3可知，随着乙醇体积分数的升高，所有酵母菌菌株的OD600nm值均呈下降趋势，且8株酿酒酵母的OD600 nm值均高于扣囊复膜酵母Y1-1。当乙醇体积分数为12%时，扣囊复膜酵母Y1-1几乎不生长；当乙醇体积分数＞14%时，除菌株Y4-1外，其他酿酒酵母的生长均明显受到抑制；当乙醇体积分数＞16%时，菌株Y4-1的生长受到抑制，所有酿酒酵母几乎不生长。综上，8株酿酒酵母的耐乙醇性能优于扣囊复膜酵母Y1-1，扣囊复膜酵母Y1-1可耐受乙醇体积分数10%，8株酿酒酵母均可耐受乙醇体积分数16%。李玉花[27]测定了91株野生酿酒酵母的酒精耐受性，结果发现酒精耐受性在9%～13%之间的有41株菌株，酒精耐受性在9%以下的有37株。王晴晴[15]从开封、德州、孝感等地筛选出的酿酒酵母能耐受高达体积分数12%的乙醇，通常情况下乙醇含量在酸面团中不会超过9%，因此，所筛选出的9株酵母菌的耐乙醇性能使其在面团乙醇环境中的增殖速度和存活率不会受到影响。
图3 9株酵母菌菌株的耐乙醇能力分析结果
Fig.3 Results of alcohol tolerance of 9 yeast strains
2.3 酸面团发酵过程中滴定酸度和pH的变化
酸面团发酵过程中滴定酸度和pH的变化见图4。
图4 酸面团发酵过程中滴定酸度（a）及pH（b）的变化
Fig.4 Change of titration acidity (a) and pH (b) of sourdough during fermentation process
由图4可知，随着发酵时间的延长，酸面团样品的滴定酸度整体呈现上升趋势，pH值整体呈现下降趋势，但是添加酵母菌的酸面团的滴定酸度和pH的变化幅度比未添加酵母的酸面团的滴定酸度和pH的变化剧烈。 这可能是因为在发酵前期，酵母菌利用面团中的氧气进行有氧呼吸产生CO2和醋酸等[17]。 姜秀杰等[28]从大庆市自然发酵的酸面团中筛选出优势酵母菌S5，菌株S5发酵面团与安琪酵母发酵面团的pH均随着发酵时间的增加，整体呈现出一个下降的趋势，发酵24 h后，pH分别达到5.4、5.6，本研究从河南本地自然发酵的酸面团中所筛选出的9株酵母菌发酵24 h后，酸面团的pH达到4.06～4.5，滴定酸度达到14.8～16.4 mL，说明这9株酵母菌产酸能力较强，不同地区的酵母菌产酸能力存在较大差异。
2.4 酵母菌菌株发酵力的测定
通过测定面团体积的变化测定酵母菌的发酵力是一种快速直接的方法，在家庭、手工作坊以及工业化生产制作馒头时大多通过观察面团体积的变化经验判断面团的发酵情况[29]，酸面团发酵过程中面团体积的变化见图5。由图5可知，除菌株Y1-1外，随着发酵时间的延长，其他菌株制作的酸面团的体积逐渐增大，证明这些菌株在面团基质中产气量优良，特别是添加酵母菌Y2-1和商业酵母的酸面团，在3 h内面团体积分别增加了1.23倍、1.00倍，说明酵母菌Y2-1在面团基质中的发酵能力最强。
图5 酸面团发酵过程中体积的变化
Fig.5 Changes of sourdough volume during fermentation process
3 结论
本研究从郑州、南阳、安阳、周口、商丘、三门峡六地采集的传统酸面团中分离得到9株酵母菌菌株，经分子生物学鉴定，1株为扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），8株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。 8株酿酒酵母的耐受性优于扣囊复膜酵母Y1-1，其中，菌株Y2-1的耐受性较好，可耐受pH 1.5、乙醇体积分数为16%的环境。随着发酵时间的延长，添加不同酵母菌的酸面团的滴定酸度整体呈现上升趋势，pH值整体呈现下降趋势，面团体积逐渐增大，其中，酿酒酵母Y2-1的发酵力最强，在发酵3 h时可以使面团的体积增加1.23倍。 整体而言，酿酒酵母Y2-1具备较好的耐酸、耐乙醇能力和良好的发酵性能，有望成为具有优良特性的发酵酸面团专用酵母菌，为开发健康发酵面制品提供理论参考。
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