图1 基于属水平邛崃和宜宾大曲细菌群落结构
Fig.1 Bacterial community structure of Daqu from Qionglai and Yibin based on genus level
Effects of seasonal variation on microbial community and flavor of strong-flavor Baijiu Daqu from different regions
浓香型白酒丰富、独特的口感来自于大曲中酿酒微生物群的发酵作用。真菌菌群是产酒精、产香的主要功能菌，具有很高的糖化酶活力。细菌属（如乳酸菌和芽孢杆菌等）是大曲中的主要产酸微生物[1]。同时，大曲的自然发酵受气候条件影响，其质量随季节而波动[2]。如不同季节白酒发酵的代谢组存在显著差异，夏季白酒发酵的乳酸乙酯和2-辛醇含量高于其他季节[3]。FU G M等[26]研究了夏季和秋季大曲中微生物群落和挥发性成分之间的关系，结果表明，秋季真菌多样性较高，具有最高的酯化和液化能力，产出的酒精含量最高。因此，季节变化对控制自然发酵食品的质量有重要意义。
目前，随着宏基因组测序技术在传统白酒发酵中的广泛应用，白酒大曲微生物群落组成与白酒风味物质的相关性成为研究热点。张清玫等[4]基于宏基因组学技术对三种香型白酒大曲微生物群落及其功能特征进行解析，采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HSSPME）结合气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）检测大曲风味物质，并通过关联性分析探究微生物与风味间的联系，结果表明，浓香型大曲特征细菌属（Bacillus）和真菌属（Lichtheimia、Saccharomyces）有利于四甲基吡嗪和2,3-丁二醇的生成。陈莹琪等[5]研究结果表明，浓香型大曲制曲过程中吡嗪类物质与枝孢霉属、横梗霉属等微生物属之间多呈正相关。宋建阳等[27]研究结果表明，酒醅中酵母属与浓香型白酒中己酸乙酯具有较强相关性，细菌属与酸类物质呈正相关，证实了酵母属和细菌属是关键酒醅微生物，也是浓香型白酒主要风味物质的核心。目前，鲜有关于季节变化对四川不同产地浓香型白酒大曲微生物群落结构和风味物质影响的研究报道。
本研究以川南和川西地区浓香型白酒大曲为研究对象，采用高通量测序和顶空串联热脱附（headspace-thermal desorption instrument，HS-TD）结合气相色谱串联四极杆飞行时间质谱（gas chromatography-quadrupole time of flightmass spectrometry，GC-QTOF MS）技术分别探究大曲微生物群落结构及风味物质组成，并对两者进行相关性分析，以期进一步了解浓香型白酒香气特征的形成机制，为其酿造生产以及品质提升提供技术支持。
浓香型白酒中高温大曲：川西地区（邛崃（YB））和川南地区（宜宾（QL））各1家白酒企业，每家企业春夏秋冬四季各采样1次，取曲房内成熟曲砖，分别按堆垛层的上、中、下，取3个平行样品后进行五点取样，粉碎、混匀、过筛后做好标记，宜宾和邛崃大曲样品按春夏秋冬四季分别标记为：202211YB、202301YB、202304YB、202306YB；202211QL、202301QL、202304QL、202306QL，用无菌袋密封-20 ℃保存备用。
DNA Isolation Mini Kit-BOX2脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）试剂盒、琼脂糖：上海贝晶生物技术有限公司；无水乙醇（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司。
Bio-rad电泳系统、安捷伦2100生物分析仪、Tecan F200多功能酶标仪、Illumina公司Novaseq 6000平台、MS 1602S电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；气相色谱串联四极杆飞行时间质谱（GC-QTOF MS）仪、CP-WAX 57 CB色谱柱（50 m×250 μm×0.20 μm）：美国安捷伦科技公司；AutoHS全自动顶空仪、AutoTD热脱附解吸仪：成都科林分析技术有限公司。
1.3.1 大曲DNA的提取及测序
样本DNA提取与纯化：根据DNAIsolationMiniKit-BOX2说明书进行样本DNA提取和纯化，使用0.8%琼脂糖电泳及生物分析仪检测DNA完整性。聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增体系：10 PCR buffer 5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）2 μL，DNA模板10 ng，正反向引物0.5 μmol/L，TaqDNA聚合酶0.05 U，用双蒸水（H2O）补足至50 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。
文库构建：使用NEB公司NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒及NEB Next Multiplex Oligos for Illumina构建测序文库。通过生物分析仪检测文库质量和使用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测文库浓度。
高通量测序：测序平台为Illumina公司Novaseq 6000，使用Illmina公司NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit测序试剂盒，采用PE150测序模式测序。
1.3.2 挥发性风味物质检测
采用顶空串联热脱附（HS-TD）结合气相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪（GC-QTOF MS）联用技术测定不同季节邛崃和宜宾两地不同季节大曲的挥发性物质，通过计算机谱库查询，并结合相关文献检索[5-6]。
顶空串联热脱附（HS-TD）条件：称取酒曲样5.0 g于20 mL顶空瓶，每个样品3个重复，进样时间120 s，80 ℃静态恒温30 min，通过动态补偿将顶部空气转移至热脱附-30 ℃冷阱吸附，冷阱加热时间6 min，再通过300 ℃加热解吸至气相色谱仪。
GC-QTOF MS参数设置：进样量1 μL；分流比10∶1；进样口温度250℃；载气为高纯氦气（He）；载气流速1.5mL/min；升温程序为初始温度35 ℃保持6 min，以2 ℃/min升温至50 ℃，再以4 ℃/min升温至200 ℃，保持9 min；电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度200 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围30～500 m/z。
定性定量：利用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）20.0谱库检索对采集的数据进行匹配度和图谱比较。扣除空白样品背景后，选择峰形良好、分离度好且绝对峰面积＞10 000的色谱峰为目标峰。将目标峰质谱图与MS谱库进行匹配，匹配因子＞80作为所选色谱峰的定性依据。以目标峰的绝对峰面积作为定量依据。
2.1.1 邛崃和宜宾不同季节大曲发酵过程中微生物群落差异性分析
基于属水平对两个地区大曲样本中的细菌菌群结构进行分析，结果见图1。由图1可知，邛崃春夏秋冬四季大曲样本（分别标记为QL1、QL2、QL3和QL4）中平均相对丰度排名前八的细菌依次为：泛菌属（Pantoea）、乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconos toc）、芽孢杆菌属（Bacillus）、欧文氏菌属（Erwinia）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、葡萄球菌属（Staphylococcus），平均相对丰度分别为22%、16%、12%、8.7%、5.0%、2.7%、1.9%、1.4%；宜宾春夏秋冬四季大曲样本（分别标记为YB1、YB2、YB3和YB4）中相对丰度排名前八的细菌依次是：泛菌属（Pantoea）、乳杆菌属（Lactobacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、魏斯氏菌属（Weissella）、欧文氏菌属（Erwinia）、高温放线菌属（Thermoactinomyces），平均相对丰度分别为26%、20%、5.5%、4.2%、2.9%、2.8%、2.7%、0.9%。结果表明，两地大曲样品相对丰度排名前8的细菌属相同，泛菌属（Pantoea）和乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度较高，其他菌属相对丰度不同。在春季时，邛崃地区（QL1）大曲的魏斯氏菌属（Weissella）和宜宾地区（YB1）大曲的葡萄球菌属（Staphylococcus）相对丰度占比最高（分别为31.5%和10.6%）；在夏季时，邛崃地区（QL2）大曲的乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度占比最高（31.1%），宜宾地区（YB2）大曲乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度占比最高（31.4%）；在秋季时，邛崃（QL3）和宜宾（YB3）两地大曲的明串珠菌属（Leuconostoc）相对丰度占比最高（分别为10.4%和4.8%）；在冬季时，邛崃（QL4）和宜宾（YB4）两地大曲泛菌属（Pantoea）和芽孢杆菌属（Bacillus）相对丰度占比最高（分别为45.2%和49.3%）。值得注意的是，邛崃地区大曲芽孢杆菌属（Bacillus）相对丰度从春季到冬季呈递增趋势；宜宾地区大曲葡萄球菌属（Staphylococcus）相对丰度从春季到冬季呈递减趋势，邛崃和宜宾两地大曲的乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度四季变化为：夏季＞春季＞秋季＞冬季；其他细菌属在两地区大曲的相对丰度随季节变化呈无规律变化。结果表明，两地区的菌属会因为季节改变而导致部分菌属会呈现不同的变化趋势，这可能是季节变化导致自然发酵温度变化引起细菌属分布的改变，与LIANG F等[2]的研究报道一致，随着日平均温度的变化，白酒发酵过程中微生物群的分布也发生了变化。
图1 基于属水平邛崃和宜宾大曲细菌群落结构
Fig.1 Bacterial community structure of Daqu from Qionglai and Yibin based on genus level
图2 基于属水平邛崃和宜宾大曲真菌群落结构
Fig.2 Fungal community structure of Daqu from Qionglai and Yibin based on genus level
基于属水平对两地大曲样本中的真菌种类和相对丰度分析，由图1可知，邛崃春夏秋冬四季大曲样本（分别标记为QL1、QL2、QL3和QL4）中平均相对丰度排名靠前六的真菌依次为：曲霉属（Aspergillus）、毕赤酵母属（Pichia）、镰刀菌属（Fusarium）、篮状菌属（Talaromyces）、酵母菌属（Saccharomyces）、嗜热根串珠霉菌属（Thermothielavioides），平均相对丰度分别为3.9%、3.2%、0.69%、0.53%、0.51%、0.23%；宜宾春夏秋冬四季大曲样本（分别标记为YB1、YB2、YB3和YB4）中相对丰度排名靠前六的真菌依次为：曲霉属（Aspergillus）、毕赤酵母属（Pichia）、镰刀菌属（Fusarium）、篮状菌属（Talaromyces）、刺盘孢菌属（Colletotrichum）、嗜热根串珠霉菌属（Thermothielavioides），平均相对丰度分别为6.6%、1.3%、0.85%、0.81%、0.32%、0.25%。结果表明，两地大曲样品真菌属大部分相同，但是邛崃和宜宾两地大曲样品相对丰度第5的真菌属不一致，分别为酵母菌属（Saccharomyces）和刺盘孢菌属（Colletotrichum）。在春季时，邛崃地区（QL1）大曲真菌属相对丰度占比较高的菌属有：曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）和嗜热根串珠霉菌属（Thermothielavioides），宜宾地区（YB1）大曲的毕赤酵母属（Pichia）相对丰度占比最高（1.1%）；在夏季时，邛崃（QL2）和宜宾（YB2）两地大曲毕赤酵母属（Pichia）相对丰度占比最高（分别为14.6%和2.7%）；在秋季时，邛崃（QL3）地区大曲曲霉属（Aspergillus）相对丰度占比最高（4.8%），宜宾地区（YB3）大曲真菌属相对丰度占比较高的菌属有：曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）和嗜热根串珠霉菌属（Thermothielavioides）；在冬季，邛崃（QL4）和宜宾（YB4）两地大曲曲霉属（Aspergillus）相对丰度占比最高（分别为3.1%和3.2%）。邛崃和宜宾大曲中曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）和篮状菌属（Talaromyces）的相对丰度分别在春季和秋季较高（分别为5.0%、11.5%、0.7%和20.6%、21.3%、19.9%），且这三类真菌属在邛崃地区的相对丰度均从春季到冬季呈递减趋势，其他真菌属在两地区的相对丰度随季节变化呈无规律变化。本研究中，两地大曲的真菌属与之前研究浓香型白酒酿造过程真菌微生物的结果一致[7]，同时宜宾地区秋季大曲真菌菌群相对丰度最高，邛崃地区春季大曲真菌菌群相对丰度最高，研究表明春秋季的湿度会增加真菌属微生物的相对丰度和多样性[2]，而邛崃和宜宾两地春秋两季真菌属的相对丰度不同可能是两地湿度的差异性导致。
2.1.2 邛崃和宜宾不同季节大曲微生物群落结构相关性分析
计算相对丰度＞0.1%的属水平微生物菌群之间的Spearman相关性，相关性|R|＞0.6，P＜0.05作为网络构建的阈值，定义为具有显著相关性[8]。红色的点为真菌，蓝色的为细菌。红色的连线表示正相关，蓝色的连线表示负相关。基于属水平邛崃和宜宾大曲微生物群落组成相关性网络图见图3。由图3A可知，基于细菌属，泛菌属（Pantoea）与芽孢杆菌属（Bacillus）、欧文氏菌属（Erwinia）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）互为显著正相关（P＜0.05），与乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）互为显著负相关（P＜0.05）。基于真菌属，曲霉菌属（Aspergillus）、毕赤酵母菌属（Pichia）、镰刀霉菌属（Fusarium）、篮状菌属（Talaromyces）、酵母菌属（Saccharomyces）、嗜热根串珠霉菌属（Thermothielavioides）均互为显著正相关（P＜0.05）。
图3 基于属水平邛崃和宜宾大曲微生物群落组成相关性网络图
Fig.3 Correlation network diagram of microbial community composition in Daqu from Qionglai and Yibin based on genus level
由图3B可知，基于细菌属，泛菌属（Pantoea）与欧文氏菌属（Erwinia）互为显著正相关（P＜0.05），与魏斯氏菌属（Weissella）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）互为显著负相关（P＜0.05），芽孢杆菌（Bacillus）与欧文氏菌（Erwinia）互为显著正相关（P＜0.05），与乳杆菌属（Lactobacillus）互为显著负相关（P＜0.05）；基于真菌属，曲霉菌属（Aspergillus）、毕赤酵母菌属（Pichia）、镰刀霉菌属（Fusarium）、篮状菌属（Talaromyces）、刺盘孢菌属（Colletotrichum）、嗜热根串珠霉菌属（Thermothielavioides）均互为显著正相关（P＜0.05）。
2.2.1 邛崃和宜宾不同季节大曲中挥发性风味物质分析
邛崃和宜宾不同季节大曲中挥发性风味物质相对含量见表1。由表1可知，宜宾和邛崃不同季节大曲中所含挥发性风味物质均为醛类、醇类、酮类、酸类、酯类和吡嗪类。邛崃地区大曲样本中挥发性物质在春夏秋冬四季相对含量最高的均为醇类，分别为41.36%、50.09%、39.94%和31.18%。宜宾地区大曲醇类相对含量仅在夏季时最高，为42.44%，春秋冬三季大曲相对含量最高的挥发性物质是醛类，分别为38.68%、39.92%和26.83%。仅有邛崃四季大曲样本中吡嗪类相对含量从春季到冬季呈递增趋势，且两个地区的冬季大曲样本中吡嗪类和酸类组分相对含量均比其他季节高，其他大曲中挥发性物质从春季到冬季呈无规律变化。酯类（如己酸乙酯）、酸类（如乳酸）、醇类（如正丙醇）和醛类（如乙醛）是浓香型白酒中的主要风味化合物[9]，只是宜宾大曲醛类平均相对含量（34.52%）较高，邛崃大曲醇类平均相对含量（40.64%）较高。两地大曲样本中酯类相对含量较低，但酯类具有较低的气味阈值和协同效应，具有果味和甜味，是白酒香气的主要贡献者[10-11]。大部分酯类物质与酸、醛和醇结合会影响白酒的风味[12]。
表1 邛崃和宜宾不同季节大曲中挥发性风味物质相对含量
Table 1 Relative contents of volatile flavor substances in different seasons of Daqu from Qionglai and Yibin
地域 时间相对含量/%酸类 醇类 醛类 酮类 酯类 吡嗪类邛崃宜宾202211QL 202301QL 202304QL 202306QL 202211YB 202301YB 202304YB 202306YB 11.71 10.72 12.43 17.54 8.89 9.48 4.89 19.97 41.36 50.09 39.94 31.18 25.59 42.44 33.16 26.38 22.59 28.12 19.97 16.23 38.68 33.37 39.92 26.83 15.73 8.62 18.99 18.81 19.26 8.98 12.94 18.39 7.42 1.06 4.54 7.93 4.00 4.52 7.22 1.35 1.20 1.39 4.13 7.60 3.64 1.21 1.86 7.04
对邛崃和宜宾不同季节大曲中挥发性风味物质通过NIST20.0谱库检索，匹配因子＞80作为所选色谱峰的定性依据，以目标峰的绝对峰面积作为定量依据，结果见表2。
表2 邛崃和宜宾大曲中挥发性物质定性及定量分析结果
Table 2 Qualitative and quantitative analysis results of volatile substances in Daqu from Qionglai and Yibin
序号 化合物邛崃匹配因子组分面积宜宾匹配因子 组分面积1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27苯甲醛2-甲基吡嗪2-庚酮正己醇乙酸乙酯2,3,5,6-四甲基吡嗪3-羟基-2-丁酮2,5-二甲基吡嗪异戊酸2-丁酮2,3,5-三甲基吡嗪苯乙醇2-甲基-3-戊酮2,3-丁二酮异丙醇2,3-丁二醇2,3-二甲基吡嗪乙酸己醛丙酮正丁醇2-戊酮异丁醇异丁醛2,6-二甲基吡嗪丙醛2,3-二甲基-5-乙基吡嗪97.7 97.3 89.0 95.8 97.9 94.2 95.7 92.5 98.1 97.4 95.5 97.1 98.3 95.5 95.5 94.2 96.5 99.0 97.6 92.0 94.0 95.0 92.0 97.0 239 686.3±4 874.8a 137 284.3±2 182.8a 73 610.4±566.6a 153 546.0±979.6a 467 857.4±1 053.6a 86 810.2±4 166.8b 1 096 711.5±75 543.5 a 64 304.3±1 950.9a 1 564 213.0±24 779.1 a 583 369.9±9 917.3a 507 579.1±13 666.9a 794 306.2±9 801.1a 122 381.2±801.4a 937 746.1±8 158.4a 87 964.2±5 863.9a 86 810.2±4 214.1b 216 766.5±8 994.5a 2 816 088.6±6 672.1a 689 147.0±7 854.8b 1 382 967.0±7 010.5a 79 115.0±2 856.1b 101 777.0±4 641.0b 638 788.0±8 943.0a 2 554 378.0±3 515.4a-- --- -97.7 97.3 89.0 95.8 97.9 94.2 95.7 92.5 98.1 97.4 95.5 97.1 98.3 95.5 95.5 94.2 96.5 99.0 97.6 92.0 94.0 95.0 92.0 97.0 95.6 87.5 94.4 187 319.6±1 685.8b 102 839.5±1 742.5b 58 507.1±8 450.9a 133 390.7±12 984.1a 327 820.1±986.7b 181 308.2±8 884.1a 730 305.2±50 154.7b 47 955.8±167.2b 899 037.7±17 538.4b 303 764.0±8 758.1b 293 689.8±9 067.7b 634 021.8±1 121.7b 94 873.7±153.9b 763 306.7±4 297.5b 37 434.7±2 784.1b 181 308.2±8 145.7a 167 512.8±2 445.7b 2 337 321.8±1 555.3b 945 602.7±9 077.8a 834 163.0±2 903.9b 240 439.0±5 369.5a 130 872.0±2 303.3a 331 280.0±6 457.5b 2 479 914.0±51 022.4a 146 161.0 242 033.5 46 262.2
续表
注：表“-”表示未检出，同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
序号 化合物28 29 30 31 32 33 34 35邛崃匹配因子组分面积宜宾匹配因子 组分面积1-辛烯-3-醇（S）-1,2-丙二醇异戊醛甲醇羟基丙酮乙二醇单丁醚丙酸异丁酸-- - --- - -88.9 90.9 86.4 99.4 58 261.7 169 171.0 1 879 936.4 247 839.1 91.4 92.8 90.0 93.7 148 943.7 1 450 172.7 98 563.3 141 791.9-- - --- - -
由表2可知，两个地区共检出35种挥发性风味物质，其中，共有挥发性风味化合物24种，邛崃和宜宾大曲分别独有4种和7种挥发性风味化合物，其中邛崃地区含量排名前三的共有挥发性风味物质分别为乙酸、异丁醛、异戊醇，宜宾地区含量排名前3的共有挥发性风味物质分别为异丁醛、乙酸、正己醛。结果表明，宜宾地区大曲样本中醛类物质含量高于邛崃地区，而宜宾全年温度和降水量略高于邛崃，这与胡春红等[28]研究结果一致，醛类物质的增长主要与温度和降水量呈现正相关。
基于上述结果，选择两个地区共有挥发性风味物质中含量差异显著（P＜0.05）的21种物质进行分析，结果见表3。
表3 邛崃和宜宾大曲主要挥发性风味物质
Table 3 Major volatile flavor substances in Qionglai and Yibin Daqu
编号 邛崃 宜宾1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21乙酸异戊酸2,3-丁二醇正丁醇苯乙醇异丁醇异丙醇己醛苯甲醛3-羟基-2-丁酮丙酮2,3-丁二酮2-甲基-3-戊酮2-丁酮2-戊酮乙酸乙酯2-甲基吡嗪2,3,5-三甲基吡嗪2,3-二甲基吡嗪2,5-二甲基吡嗪2,3,5,6-四甲基吡嗪乙酸异戊酸2,3-丁二醇正丁醇苯乙醇异丁醇异丙醇己醛苯甲醛3-羟基-2-丁酮丙酮2,3-丁二酮2-甲基-3-戊酮2-丁酮2-戊酮乙酸乙酯2-甲基吡嗪2,3,5-三甲基吡嗪2,3-二甲基吡嗪2,5-二甲基吡嗪2,3,5,6-四甲基吡嗪
宜宾和邛崃不同季节大曲中主要挥发性风味物质聚类分析热图见图4。由图4A可知，异丙醇、2-甲基-3-戊酮、2-戊酮和2,3,5,6-四甲基吡嗪的组分面积随季节变化逐渐减少，苯乙醇、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪的组分面积随季节变化逐渐增加。由图4B可知，异戊酸、丁醇、2-甲基-3-戊酮和2-戊酮的组分面积随季节变化逐渐减少，苯乙醇、3-羟基-2-丁酮、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪的组分面积随季节变化逐渐增加，其他无规律变化。
图4 宜宾（A）和邛崃（B）不同季节大曲中主要挥发性风味物质聚类分析热图
Fig.4 Heat map of cluster analysis of major volatile flavor compounds in different seasons of Daqu from Qionglai and Yibin
2.2.2 邛崃和宜宾大曲风味物质差异性分析
邛崃和宜宾不同季节大曲代谢物偏最小二乘-判别分析结果见图5。由图5可知，以风味物质为因变量，以不同产地为自变量，利用偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）解析邛崃和宜宾大曲之间的差异[13]。结果表明，邛崃大曲中的异戊酸、乙酸乙酯、2,3-丁二酮、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、3-羟基-2丁酮等挥发性风味物质的含量要高于宜宾大曲；而异戊醛、己醛、2-戊酮、异丙醇和2,3-丁二醇等在宜宾大曲中占优势。
图5 基于挥发性风味物质邛崃和宜宾不同季节大曲偏最小二乘-判别分析结果
Fig.5 Partial least squares-discriminant analysis results in Daqu with different seasons from Qionglai and Yibin based on volatile flavor compounds
变量重要性投影（variable importance inprojection，VIP）值用于衡量每个变量在模型中的重要性。VIP值＞1表示变量对模型的贡献较大，通常被认为是关键变量（重要特征）；0.5＜VIP≤1表示变量对模型的贡献较中等，具有一定的区分能力（差异）；VIP≤0.5表示变量贡献较小，对模型影响不显著。邛崃和宜宾地区大曲差异挥发性风味物质变量重要性投影（VIP）值见表4。
表4 邛崃和宜宾地区大曲差异挥发性风味物质变量重要性投影值
Table 4 Variable importance in the projection value of differential volatile flavor substances in Daqu from Qionglai and Yibin
化合物 VIP值异戊醛2,3-丁二醇3-羟基-2-丁酮2,3,5-三甲基吡嗪丙酮2-甲基-3-戊酮2-戊酮乙酸乙酯乙酸苯乙醇己醛异丁醇苯甲醛3.8 1.3 1.2 0.86 0.83 0.81 0.79 0.78 0.78 0.71 0.60 0.55 0.51
由表4可知，共有13种代谢物对该邛崃和宜宾的代谢组成差异作出了重要贡献（VIP值＞0.5），而异戊醛、2,3-丁二醇及3-羟基-2-丁酮为关键差异物质（VIP值＞1）。其中乙酸乙酯作为乙酯基的代表物质，具有类似梨和香蕉的香气，广泛存在于各种香型白酒中，适当增加乙酸乙酯的含量可以改善白酒的品质[14]。苯乙醇是具有玫瑰花香的高级醇，是酒精发酵代谢的副产物的主要成分，为白酒的酿造贡献香气成分[15]。2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪等挥发性风味物质主要在邛崃样品中检出，这可能是导致两地白酒风味有差异的原因，和林涵瑞等的研究结果一致[16]。甲基吡嗪属于吡嗪类化合物，是白酒香气成分的重要组成物质，同时也是促进白酒特定风味形成的决定性风味物质之一[17-18]，它具有预防心血管疾病作用，对白酒的保健功能起着重要作用[19]。
据报道，酯类、酸类、醇类和醛类是浓香型白酒中的主要风味化合物[20]。邛崃、宜宾大曲中微生物群落结构和挥发性风味物质网络图见图6。由图6可知，邛崃大曲中乙酸乙酯含量高于宜宾，是因为邛崃大曲中芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、泛菌属（Pantoea）与乙酸乙酯呈显著正相关，而宜宾大曲中相对丰度＞0.1%的菌属与乙酸乙酯无正相关。邛崃大曲中2,3-丁二酮含量高于宜宾大曲，是因为邛崃大曲中泛菌属（Pantoea）、埃希氏菌属（Escherichia）、欧文氏菌属（Erwinia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、小迫氏菌属（Kosakonia）、芽孢杆菌属（Bacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）7个菌属与2,3-丁二酮呈显著正相关，而宜宾大曲中只有泛菌属（Pantoea）、埃希氏菌属（Escherichia）与2,3-丁二酮呈显著正相关。2,5-二甲基吡嗪高于宜宾，是因为邛崃大曲中埃希氏菌属（Escherichia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、泛菌属（Pantoea）等与2,5-二甲基吡嗪呈显著正相关，而宜宾大曲相对丰度＞0.1%的菌属与2,5-二甲基吡嗪无正相关。结果表明，邛崃大曲微生物之间的交互协同作用强于宜宾大曲。
图6 邛崃（A）及宜宾（B）大曲中微生物群落结构和风味物质网络图
Fig.6 Microbial community structure and flavor substance network in Daqu from Qionglai (A) and Yibin (B)
邛崃大曲中芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、泛菌属（Pantoea）、埃希氏菌属（Escherichia）、欧文氏菌属（Erwinia）等菌属对酯、醇等主要风味物质的产生具有显著贡献作用。与LI Q等[21]研究报道一致，芽孢杆菌属与乙酸乙酯呈显著正相关性，可以改善大曲的风味特性，提高不同类型白酒的乙酸乙酯含量，使白酒口感更加醇厚[21]。在邛崃大曲中检测出2,5-二甲基吡嗪，且芽孢杆菌属与吡嗪类呈显著正相关性，均随四季变化逐渐增加，吡嗪类化合物主要通过糖类物质与含氮物质之间的美拉德反应形成[22]，能够为白酒提供坚果、焦香味，同时也是促进白酒特定风味形成的决定性风味物质之一[23]。大曲醇类物质的种类仅次于酯类，具有花香、果香气味[24]。宜宾大曲中2,3-丁二醇含量高于邛崃，柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）、泛菌属（Pantoea）、摩根氏菌属（Morganella）等菌属对醇类风味物质的产生具有显著贡献作用。异戊醛是宜宾大曲的独有挥发性物质，与乳杆菌属（Lactobacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、毕赤酵母菌属（Pichia）、小迫氏菌属（Kosakonia）等菌属呈显著正相关。醛类物质对大曲的香味有显著功效，具有提升酱味的效果[25]，使得宜宾浓香型白酒兼有淡淡的酱香，口感细腻，这也可能是导致宜宾和邛崃两地区白酒风味存在差异的原因之一。
以邛崃和宜宾两地浓香型白酒大曲为研究对象，研究了季节变化对两地白酒大曲的微生物群落结构及风味物质的影响。微生物群落结构结果显示，邛崃和宜宾两地大曲全年平均相对丰度靠前的细菌属和真菌属差异不大，但部分菌属会因为季节改变呈现不同的变化趋势。邛崃地区芽孢杆菌属（Bacillus）相对丰度从春季到冬季呈递增趋势；宜宾地区葡萄球菌属（Staphylococcus）相对丰度从春季到冬季呈递减趋势，邛崃和宜宾两地的乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度四季变化为：夏季＞春季＞秋季＞冬季；曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、篮状菌属（Talaromyces）和嗜热根串珠霉菌属（Thermothielavioides）的相对丰度在春季和秋季最高。挥发性物质分析结果显示，两地大曲四季所含挥发性风味物质均为醛类、醇类、酮类、酸类、酯类和吡嗪类，两地共有挥发性风味化合物有24种，邛崃和宜宾大曲各自独有4种和7种挥发性风味化合物，邛崃和宜宾大曲醇类和醛类相对含量较高，邛崃地区大曲吡嗪类化合物从春季到冬季呈递增趋势。通过微生物与挥发性风味物质的关联性分析，邛崃大曲微生物之间的交互协同作用强于宜宾。邛崃大曲中吡嗪类与芽孢杆菌属（Bacillus）呈显著正相关，且随四季变化逐渐增加。异戊醛是宜宾大曲独有的挥发性物质，与乳杆菌属（Lactobacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和毕赤酵母菌属（Pichia）呈显著正相关。然而由于白酒酿造受季节变化影响的因素较多，还需进一步加强产区季节变化对芽孢杆菌属（Bacillus）及吡嗪类物质的影响，为酿造生产以及品质提升提供技术支持。
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