气相色谱离子迁移谱联用仪：德国G.A.S公司。Analysis on the differences in volatile components of different typical base liquor of sauce-flavor Baijiu based on GC-IMS
白酒是中国最具民族特色的活态文化遗产[1]。中国酒业协会第六届理事会第六次（扩大）会议指出，2023年中国白酒行业实现销售利润总额2 328亿元，同比增长7.5%。酱香型白酒以贵州茅台为代表，是白酒十二大香型之一，因其独特的酿造工艺和独具一格的风味而深受消费者青睐[2]。酱香型白酒基酒的生产流程可以概括为“1，2，9，8，7”，即1年一个生产周期，2次投料，9次原料、酒醅蒸煮，8轮次发酵，7次摘酒。发酵过程中所摘基酒，因酒醅的发酵轮次和所处窖池空间位置、理化环境条件不同，导致微生物组成及代谢产生差异，从而使得所产基酒风格特征不同，形成了酱香、醇甜和窖底3种典型体基酒[3]。酱香典型体基酒酱香突出，有花香蜜香，回味悠长；醇甜典型体基酒醇甜柔和，有一定的酱香风味；窖底典型体基酒窖香浓郁，后味欠爽[4]。根据3种典型体基酒的品质差异，按一定比例勾调得到成品白酒[5]，相互间在风味上起到互补或掩蔽作用[6]，对酱香型白酒典型风格特征的形成和稳定起到重要贡献。基酒风味的不同反映了风味物质组成的差异，许忠等[6]研究表明，酱香体酒风味物质含量相对较高，窖底香体酒醇、醛类物质含量较高；熊小月等[7]研究发现，醇甜典型体基酒的醇和酯类物质含量高，而酸类物质含量较低。因此，对3种典型体基酒进行风味差异分析具有重要意义。
随着风味物质研究技术的不断发展，为进一步探索不同风格特征酱香基酒中的关键差异化合物提供了更好的条件。目前，气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用法是食品香气成分定性和定量分析最主要的方法[8]，而新兴的气相色谱-离子迁移色谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）能对样本的挥发性成分组成进行可视化分析，具有高响应、高灵敏度和操作方便等优点[9]。现已逐渐应用于酒体成分组成及其差异分析，如CAI W C等[10]使用GC-IMS从10个不同厂家生产的酱香型白酒中共鉴定出29种挥发性成分；沈棚等[11]采用GC-IMS技术建立了一种快速鉴别黄酒年份酒的方法；占成等[12]使用GC-IMS技术结合主成分分析（principal component analysis，PCA）实现了不同香型白酒的区分，其中酱香型白酒与其他香型白酒的成分具有显著差异。这些研究表明，GC-IMS在实现酒体差异分析上具有较好的应用潜力。
本研究借助GC-IMS技术对酱香型白酒不同典型体（酱香、醇甜、窖底）基酒进行挥发性成分检测，对比成分指纹图谱，结合PCA和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）模型筛选主要的差异化合物（P＜0.05，变量重要性投影（variable importance projection，VIP）＞1），在此基础上，结合相对气味活性值（relative odor activity value，ROAV）＞1，筛选出对不同典型体基酒风味贡献较大的关键差异化合物。这将为区分酱香型白酒中不同典型体基酒的品质差异分析奠定基础，为成品酒的勾调提供成分组成参考，同时也为探究窖池中不同空间位置的酒醅形成不同风格典型体基酒的机理研究提供思路。
酱香典型体基酒、醇甜典型体基酒和窖底典型体基酒：贵州酱香型白酒仁怀产区某大型酒厂第四轮次基酒；叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸（均为色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇（色谱纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司。
Flavour Spec 气相色谱离子迁移谱联用仪：德国G.A.S公司。
1.3.1 3种典型体基酒挥发性成分GC-IMS分析[13]
样品预处理：取白酒样品1 mL与4 mL纯水加入20 mL顶空瓶中，再加入50 μL内标溶液（准确量取叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸各1 mL，用体积分数60%乙醇溶液定容至100 mL并混匀，4 ℃保存备用）。
自动顶空进样：孵育温度为60 ℃，孵育时间为30 min，加热注射器温度为95 ℃，进样量为500 μL，进样时间为0.5 min。
GC条件：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），柱温40 ℃，升温程序为40 ℃持续3 min，然后以4 ℃/min升高至150 ℃持续10 min；载气采用高纯氮气（N2）（纯度≥99.999%）。
IMS条件：漂移管9.8 cm，温度45 ℃；管内线性电压500 V/cm，漂移气为氮气（N2）（99.999%），漂移气流速为150 mL/min，分离时间40.5 min。
定性和定量：借助GC×IMS Library Search软件、美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）数据库和IMS数据库结合保留指数（retention index，RI）对不同样品挥发性风味成分进行定性分析；采用内标法进行定量。
1.3.2 相对气味活度值的计算
相对气味活性值（ROAV）是评估挥发性成分对香气的贡献的重要指标，其计算公式如下：
式中：CA代表目标挥发性化合物A的质量浓度，mg/L；TA代表化合物A的气味阈值，μg/L；Cmax代表对样品香气贡献最大的化合物的质量浓度，mg/L；Tmax代表对样品香气贡献最大的化合物的气味阈值，μg/L。
1.3.3 数据处理
每个样品进行3次平行测定，结果用“平均值±标准差”表示。通过SPSS 24.0进行单因素方差分析，采用Reporter插件绘制三维谱图和差异图谱，采用Gallery Plot插件绘制指纹图谱，基迪奥生物信息云平台绘制PCA得分图，采用SIMCA 14.0构建OPLS-DA模型。
采用GC-IMS技术分析3种典型体基酒中挥发性成分的组成，结果见图1。由图1a可知，不同典型体基酒中的挥发性成分分布规律相似，但是峰位置与峰强度差异较大。图1b为以酱香典型体基酒的谱图为参比，其余谱图扣除参比基酒中的信号峰得到的差异谱图，图中蓝色区域（A）表示该物质在该样品中相比于酱香典型体基酒含量较低；红色区域（B）则表示含量较高。由图1b可知，酱香和醇甜典型体基酒中挥发性成分组成相似，而窖底典型体基酒与其他两种典型体基酒的挥发性成分组成差异较大。
图1 3种典型体基酒挥发性成分的GC-IMS三维谱图（a）和二维谱图（b）Fig.1 Three-dimensional spectra(a)and two-dimensional spectra(b)of GC-IMS of volatile compoundsin three typical base liquor
3种典型体基酒挥发性成分的定性定量分析结果见表1。由表1可知，通过GC-IMS技术从3种典型体基酒中共检出35种挥发性成分，包括酯类16种、醛酮类10种、醇类4种、酸类2种、呋喃类1种及其他类2种。酱香和醇甜典型体基酒中各类挥发性成分总含量相近，但与窖底基酒差异较大。
表1 3种典型体基酒中挥发性成分GC-IMS分析结果
Table 1 Results of GC-IMS analysis of volatile compounds in three typical base liquor
分类 化合物 CAS RI 酱香含量/（mg·L-1）醇甜 窖底酯类乙酸乙酯丙酸乙酯丁酸乙酯乙酸丙酯乙酸异丁酯2-甲基丁酸乙酯3-甲基丁酸乙酯戊酸乙酯己酸乙酯乳酸乙酯庚酸乙酯己酸丙酯己酸丁酯辛酸乙酯-D乙酸丁酯辛酸乙酯-M总含量C141786 C105373 C105544 C109604 C110190 C7452791 C108645 C539822 C123660 C97643 C106309 C626777 C626824 C106321 C123864 C106321 912.2 963.2 997.0 1 003.0 1 038.1 1 078.1 1 092.4 1 156.7 1 256.1 1 366.3 1 355.7 1 339.5 1 424.6 1 442.8 1 083.9 1 446.6 150.11±0.65a 70.83±0.87a 135.37±0.51b 87.92±1.22a 100.32±0.35b 110.37±0.51c 126.91±0.23c 94.19±0.96b 99.88±1.17b 108.64±1.22a 21.92±1.32b 9.98±0.35b 3.19±0.23b 32.50±0.36b 11.87±0.26b 7.47±0.31b 1 171.48±10.53b 150.07±0.30a 69.80±0.42a 136.26±0.17a 77.48±0.32b 103.85±0.64a 115.86±0.51b 128.67±0.20b 89.63±0.63c 98.61±1.55b 108.82±0.23a 20.72±1.64b 5.26±0.70c 3.14±0.26b 32.00±1.60b 9.89±0.12c 6.91±0.11c 1 156.96±9.38c 149.95±0.23a 70.78±0.23a 136.21±0.23a 59.64±0.87c 83.80±0.59c 125.07±0.43a 131.01±0.20a 128.92±0.42a 125.14±0.23a 48.15±0.09b 99.27±0.48a 61.49±0.40a 36.35±0.81a 65.34±0.68a 39.08±0.20a 10.37±0.06a 1 370.56±6.13a
续表
注：RI表示保留指数（retention index）；M与D分别表示为Monomer单体与Diner二聚体；同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
分类 化合物 CAS RI 酱香含量/（mg·L-1）醇甜 窖底醛酮类C75070 C123386 C123728 C110623 C66251 C124130 C100527 C123386 C100527 C78933 762.9 835.0 852.9 1 004.3 1 061.9 1 308.1 1 500.8 834.3 1 500.4 882.5醇类C71363 C71363 C78922 C78831 1 130.4 1 132.3 1 056.8 1 101.1酸类C64197 C64197 1 456.2 1 455.8呋喃类C98011 1 462.1其他类乙醛丙醛-D丁醛戊醛正己醛1-辛醛苯甲醛-D丙醛-M苯甲醛-M 2-丁酮总含量1-丁醇-M 1-丁醇-D 2-丁醇2-甲基-1-丙醇总含量乙酸-M乙酸-D总含量糠醛总含量环己烷1-辛烯总含量C110827 C111660 776.3 838.1 50.59±3.53a 38.72±2.78b 130.38±1.35b 30.74±3.30a 135.57±0.44b 52.14±0.12a 17.07±0.78c 26.46±2.79b 13.79±2.57ab 14.02±0.55c 509.47±18.21b 64.33±9.98a 33.68±6.00a 28.21±0.49b 31.08±3.64a 157.00±20.11a 29.26±0.20a 35.05±5.05a 64.31±5.25a 114.88±1.03a 114.88±1.03a 147.26±0.97a 68.89±1.89a 214.38±0.99a 45.42±0.18b 29.26±1.10c 127.82±0.43c 28.05±0.28a 134.68±0.15c 49.34±0.26b 21.33±0.15b 25.00±1.29b 12.33±0.03c 17.89±0.18b 491.13±4.04b 70.40±0.75a 36.21±0.61a 25.41±0.45c 23.27±0.42b 155.29±2.24a 30.08±0.63a 27.60±0.31b 57.68±0.94a 112.24±0.28b 112.24±0.28b 146.69±0.45a 67.68±0.54ab 214.38±0.99a 44.42±0.36b 52.57±0.68a 135.21±0.39a 31.75±0.56a 136.92±0.21a 46.58±0.16c 49.09±0.67a 36.67±0.67a 16.89±0.15a 45.28±0.25a 595.37±4.10a 60.37±0.70a 27.64±0.17a 41.73±0.35a 19.03±0.62b 148.77±1.84a 18.35±0.06b 14.13±0.14c 32.47±0.20b 89.81±0.85c 89.81±0.85c 146.56±0.09a 65.54±0.60c 212.00±0.68a
酯类物质是基酒中含量最丰富的挥发性成分，由微生物脂质代谢或酯化反应生成，是构成酱香型白酒典型性的主要物质[14]。窖底典型体基酒中酯类物质的总含量[（1370.56±6.13）mg/L]显著高于酱香[（1 171.48±10.53）mg/L）]和醇甜典型体基酒[（1 156.96±9.38）mg/L]（P＜0.05），这可能与发酵窖池底层糟醅中氧气含量较少，代谢主要以厌氧发酵有关[15]。其中，高含量的己酸乙酯[（125.14±0.23）mg/L]对窖底典型体基酒独特的窖底香的形成起着至关重要的作用[16]。乙酸乙酯是3种典型体基酒中含量最高的酯类[17]，而乳酸乙酯在酱香和醇甜典型体基酒中的含量较高，具有令人愉悦的水果香气[18]。乳酸乙酯和乙酸乙酯比例适当时会赋予酒体更加柔和优雅的风味[19]。
醛酮类物质是检出的第二大类挥发性成分，是白酒中重要的呈味物质，主要来源于醇的氧化反应，酮酸脱羧和氨基酸脱氨反应也可产生一定的醛酮类物质[20]。丁醛和正己醛在窖底典型体基酒中的含量最高，分别为[（135.21±0.39）mg/L]和[（136.92±0.21）mg/L]。醛类物质通常会赋予酒体果香和青草香等让人愉悦的香味[21]，但其含量过高时会导致酒体带有一定的刺激性和辣感，如戊醛在低浓度下具有苹果或桃子香，高浓度下则呈现刺激性气味[22]。此外，本研究检出的2-丁酮有类似薄荷的香气。
醇类物质通常由微生物通过糖代谢生成，能提升酒体的醇甜风味和酒香[23]。具有甜香和酸香特征的1-丁醇在醇甜典型体基酒中含量最高，为[（106.61±1.36）mg/L]，有助于贡献该类基酒酒体醇甜柔和的感官特征[7]，其还可能是一种引起饮用过程中感官知觉变化的关键香气化合物[24]。
为筛选3种典型体基酒中的差异化合物，基于挥发性成分含量对3种典型体基酒进行PCA、OPLS-DA分析，结果见图2。
图2 基于挥发性成分3种典型体基酒的主成分分析得分图（a）、正交偏最小二乘-判别分析得分散点图（b）、200次置换检验结果（c）和变量重要性投影值（d）
Fig.2 Score plot of principal component analysis (a), scatter plot of orthogonal partial least squares-discriminant analysis scores(b), 200 permutations tests results (c) and variable importance projection value (d) of three typical base liquors based on volatile compounds
由图2a可知，第一主成分（principal component，PC1）的方差贡献率为72.00%，PC2的方差贡献率为16.20%，累计方差贡献率为88.20%（＞85%），说明前两个主成分能较好的代表整体信息，酱香、醇甜典型体基酒距离较近，但与窖底典型体基酒距离较远，说明酱香、醇甜、窖底典型体基酒能得到很好的区分，尤其是窖底典型体基酒。由图2b、图2c可知，OPLS-DA模型总贡献率为80.10%，变量解释率R2=0.623、预测能力Q2=-0.822，说明模型不存在过拟合现象，模型可靠。OPLS-DA模型显示酱香典型体基酒位于第四象限，醇甜典型体基酒位于第一象限，窖底典型体基酒位于第二、三象限交界处，说明3种典型体基酒的挥发性成分存在较大差异[25]。由图2d可知，根据变量重要性投影（VIP）值＞1及P＜0.05筛选出10种主要差异化合物，分别为乙醛、2-甲基-1-丙醇、1-辛醛、丙醛-D、3-甲基丁酸乙酯、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、乙酸丙酯、丁醛、乙酸-D。
为进一步直观展示各挥发性成分含量的差异，绘制了3种典型体基酒挥发性成分的指纹图谱，结果见图3。由图3可知，指纹图谱可视化了10种主要差异化合物的含量差异，其中，2-甲基-1-丙醇、乙酸-D、1-辛醛、乙酸丙酯和乙醛含量（红色区域框内）在酱香典型体基酒中最高，其次是醇甜典型体基酒；而3-甲基丁酸乙酯、正己醛、2-甲基丁酸乙酯、丙醛-D和丁醛含量（黄色区域框内）在窖底典型体基酒中含量最丰富，说明差异化合物能有效区分3种典型体基酒。
图3 3种典型体基酒中挥发性成分的指纹图谱
Fig.3 Fingerprint of volatile compounds in three typical base liquors
相对气味活性值（ROAV）可用于评价挥发性成分对基酒香味的贡献程度，通常认为0.1≤ROVA≤1的化合物对基酒的整体风味有一定的修饰作用，ROAV＞1的化合物对基酒整体风味的贡献较大[25]。基酒中丁醛的含量相对较高，香气阈值（16.51 μg/L）相对较小，所以认为其对样本的整体风味贡献度大，故指定其在醇甜典型体基酒中的ROAV为100。基于此，计算10种主要差异化合物的ROAV，结果见表2。由表2可知，根据ROAV＞1共筛选出3种关键差异化合物，分别为3-甲基丁酸乙酯、丁醛、正己醛。3种关键差异化合物在3种典型体基酒中风味贡献均较大，但其风味贡献程度存在显著差异（P＜0.05）。其中，丁醛的ROAV：窖底典型体基酒（105.78）＞酱香典型体基酒（102.00）＞醇甜典型体基酒（100.00）；正己醛的ROAV也呈现类似规律：窖底典型体基酒（69.41）＞酱香典型体基酒（68.72）＞醇甜典型体基酒（68.27）。由此可见，丁醛和正己醛这两种醛类差异化合物对窖香、酱香的典型风味特征贡献更大。刘家欢等[26]研究发现，正己醛是与酱酒典型感官特征相关的重要香气成分。醛类物质在低浓度时呈现青草香，高浓度时则具有刺激性气味，说明这种风味贡献差异可能是三种典型体基酒风格特征具有显著差异的原因[27]。3-甲基丁酸乙酯的ROAV在不同典型体基酒中表现为：窖底典型体基酒（245.60）＞醇甜典型体基酒（241.20）＞酱香典型体基酒（237.91），说明其对窖香、花果香的典型风味特征贡献更大，因此窖底、醇甜典型体基酒具有更为明显的花果香。贺子豪等[13]研究也表明，3-甲基丁酸乙酯能够赋予酒体浓郁的果香以及独特的芳香气味。
表2 差异化合物的相对气味活性值
Table 2 Relative odor activity values of differential compounds
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；“-”表示未查询到阈值。
化合物 阈值/（μg·L-1）[28] 气味描述[28-29]酱香ROAV醇甜 窖底丁醛乙醛正己醛3-甲基丁酸乙酯2-甲基-1-丙醇乙酸-D 1-辛醛2-甲基丁酸乙酯乙酸丙酯丙醛-D 16.51 1500 25.48 6.89 2 8300 160 000 102.00b 0.44a 68.72b 237.91c 0.01a 0.00a 100.00c 0.39b 68.27c 241.20b 0.01a 0.00a 105.78a 0.38b 69.41a 245.60a 0.01a 0.00a-- - --- - --- - --- - -低浓度下带有清香味，高浓度下则呈现刺激性气味青苹果、刺激性气味苹果香、青草香苹果香浓郁、刺鼻、杂醇油醋、酸味橙子、柠檬、脂肪菠萝、苹果香、甜香梨、香蕉、酯香青草香
本研究借助GC-IMS技术从3种酱香型白酒不同典型体（酱香、醇甜、窖底）基酒中检出35种挥发性成分，包括酯类16种、醛酮类10种、醇类4种、酸类2种、呋喃类1种及其他类2种。通过PCA、OPLS-DA、指纹图谱和ROAV分析发现，3种典型体基酒挥发性成分具有一定差异，根据P＜0.05、VIP值＞1、ROAV＞1筛选得到3种关键差异化合物，分别为3-甲基丁酸乙酯、丁醛和正己醛。本研究结果为辨识酱香型白酒三种典型体基酒的不同风味特征奠定了良好的基础，为挖掘窖池中不同空间位置的酒醅对微生物代谢、基酒香味形成机理提供了新的思路。
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