Effects of adding Chinese medicinal materials to the Green-covering Guanyin Tuqu on flavor components of light-flavor Baijiu
孙宝国等[1]在2016年指出健康白酒是中国白酒发展的新趋势，并提出“内寻外加，自然强化”的技术路线实现健康白酒的功能。通过在制曲、发酵、陈酿过程中添加中药材使白酒中含有健康成分，是实现白酒赋能的一种手段。目前，在酒曲中添加中药材，不仅引入功能成分，如吡嗪类、愈创木酚[2-4]，还能提升白酒风味，降低白酒中杂醇油的含量的作用[5]，也会对白酒中的酯类物质和出酒率产生影响[6]。王志娟等[7]在竹叶青酒中发现的30种风味物质，如柠檬烯、丁香酚、石竹烯、古巴烯等来自添加的当归、陈皮、丁香等中药材。董酒酒曲在制曲过程中添加了大量中药材，胡光源等[8]在董酒中检出白菖油萜、δ-杜松烯、卡拉烯、α-雪松烯等萜烯类物质。
清香型白酒作为中国四大主要香型白酒之一，一直不断致力于改善口感和提高品质，为顺应健康白酒的发展趋势，也为消费者提供多元化的健康白酒产品，亟需寻找多元化的健康有效成分，提升白酒的健康功能。绿衣观音土曲中含丰富的霉菌、酵母及细菌，是酿造清香型白酒的优质酒曲[9-10]。前期实验探究了20种中药材对清香型白酒酒质的影响[6]，筛选出10种中药材（肉桂、丁香、丹参、人参、黄芪、陈皮、当归、川芎、辣蓼、甘草）加入绿衣观音土曲中，得出10种中药材在5%的添加量下制曲、存放一个月的酒曲质量较好[11]，而酒曲加入中药材对酿造清香型白酒的品质是否有影响，和白酒中是否因药材的加入产生新的微量风味物质等尚未进行探究。
将上述10种中药材按5%的添加量添加至绿衣观音土曲，分别酿造药曲白酒及土曲白酒，利用气相色谱（gas chromatography，GC）、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）等方法，检测其出酒率、酒质指标（乙酸乙酯、正丙醇、杂醇油）、挥发性风味物质及活性成分。以期探究中药材的加入对清香型白酒品质的影响，为清香型白酒酒曲中添加中药材的可行性、为健康白酒的多样性提供参考。
含5%中药材（肉桂、丁香、丹参、人参、黄芪、陈皮、当归、川芎、辣蓼、甘草）的绿衣观音土曲（药曲）、不加中药材的绿衣观音土曲（土曲，对照）：劲牌有限公司毛铺制曲车间。
大马酮、四甲基吡嗪、愈创木酚类物质标准品，2-乙基己醇、2-乙酰基吡啶等内标物质，二氯甲烷、无水乙醇（均为色谱纯）：北京迈瑞达科技有限公司；氯化钠、无水硫酸钠（均为分析纯）：中国（医药）集团上海化学试剂公司。
AL204电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SPX-100B-Z生化培养箱、YXQ-LS-75S蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司；Agilent7890B气相色谱仪、Agilent 7890A-5977C气质联用仪、CP-WAX色谱柱（50 m×0.25 mm×0.20 μm）、DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司；MPS2三合一自动进样器：德国GERSTEL公司；DVB/CAR/PDMS固相微萃取三相萃取头（50/30 μm）：美国SUPELCO公司。
1.3.1 药曲中试试验
在中试酿造试验平台进行三批次续糟发酵实验，按照清香型白酒生产工艺，试验箱和对照箱各称取高粱925 kg，75 ℃热水泡粮18～20 h后进行摊凉，试验箱熟高粱添加9.25 kg药曲混匀，对照箱添加9.25 kg土曲混匀，常温下糖化24 h后，以熟粮∶酒糟体积比为1.0∶1.8进行配糟后，混合均匀入槽车发酵，常温发酵14 d后取酒醅蒸酒，对其酒质指标（乙酸乙酯、正丙醇、杂醇油）、出酒率、挥发性风味物质及β-大马酮、愈创木酚类及吡嗪类健康成分进行分析。
1.3.2 发酵小试试验
在实验室模拟清香型白酒生产工艺，用于探究添加单种中药材对白酒中风味物质的影响。称取适量糯高粱清洗干净杂质于65 ℃热水中浸泡24 h，浸泡完毕后进行初蒸，初蒸条件为：115 ℃蒸粮10 min，65 ℃焖粮5 min。复蒸条件为：111 ℃复蒸10 min。蒸粮完毕后取熟粮1 kg摊晾至30 ℃左右，对照组熟粮加入5.0 g土曲，10个实验组熟粮中分别加入5.0 g土曲和1.0 g不同种中药材，均匀翻拌后于30 ℃糖化24 h。糖化完毕后，取500 g糖化醅与500 g酒糟等量混合均匀，30 ℃恒温发酵7 d后取酒醅小火慢蒸收集前100 mL酒样[12]。对酒样挥发性风味物质进行定性分析并比较，确定10种不同中药材对白酒中挥发性成分种类的影响。
1.3.3 酒质分析检测
主要酒质指标（乙酸乙酯、正丙醇、杂醇油）[13]：参考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[14]。
出酒率：在20 ℃条件下，根据55%vol乙醇密度及出酒体积求得的原酒质量，计算单位投粮量的原酒质量[6，14]。
1.3.4 挥发性风味成分分析
酒样中挥发性风味成分采用HS-SPME-GC-MS进行检测[15-16]。样品检测完毕通过将各挥发物的质谱图与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）谱库11.L进行比对，保留匹配度＞800的化合物；计算各化合物的保留指数，并参考文献报道的保留指数进行定性。
1.3.5 活性成分分析
采用GC-MS对酒样中的健康成分进行检测。
内标溶液的配制：以无水乙醇为溶剂配制6种功能物质和3个内标物的储备液。用无水乙醇稀释内标储备液配制成内标溶液（IS1：2-乙酰基吡啶，250 mg/L；IS2：L-薄荷醇，150 mg/L；IS3：愈创木酚-d3，250 mg/L）。用乙醇及超纯水配制模拟白酒基质溶液（酒精度为55%vol）备用。吸取一定体积功能物质储备液在模拟白酒溶液中配制成一系列不同质量浓度的标准工作溶液。
样品前处理：用超纯水将4 mL酒样稀释至乙醇体积分数为10%，加入NaCl至溶液饱和，加入20 μL内标溶液，振摇5 min，再加入2 mL二氯甲烷并振摇5 min，冰浴超声10 min后再以8 000 r/min离心5 min，静置过夜，收集下层有机相加入无水Na2SO4脱水，过滤后所得样液和标准工作溶液采取同样方法处理后进行GC-MS分析。
气相色谱条件：DB-FFAP色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），升温程序为初始温度45 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升高至250 ℃，保持2 min；载气为高纯氦气（He）（99.999%），流速为1 mL/min，进样口温度为250 ℃，不分流进样。质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；辅助通道加热温度280 ℃；扫描质量范围20～500 amu。扫描方式：先采用全扫描模式进行定性分析，确定目标化合物及对应内标物的保留时间及特征离子，然后对化合物进行分组，再采用选择离子模式扫描。
通过将各挥发物的质谱图与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）谱库11.L进行比对，保留匹配度＞800的化合物，计算各化合物的保留指数定性；采用内标法进行定量。
土曲及药曲酒样的主要酒质指标检测结果见表1。由表1可知，与对照酒样相比，药曲的酒样出酒率平均提升2.93个百分点，可能是药材的加入，促进了酒曲中微生物的繁殖和代谢，促使原料中糖类物质向醇类的转化，从而提高出酒率[6]。正丙醇和杂醇油是白酒中重要的缺陷成分，正丙醇含量过高导致酒体辛辣，杂醇油过高则容易酒后“上头”，加入中药材后，药曲酒样中正丙醇和杂醇油分别降低0.08 g/L和0.12 g/L，可能与甘草、川芎、人参等具有降低杂醇油作用的药材有关[11]。乙酸乙酯是清香型白酒重要的风味指标，然而药曲白酒中乙酸乙酯含量下降0.18 g/L，但药曲白酒中乙酸乙酯的含量仍处在GB/T 10781.2—2006《清香型白酒》中规定的清香型白酒优级酒（0.6～2.6 g/L）和一级酒（0.3～2.6 g/L）[13]范围。乙酸乙酯的下降可能与药材的加入有关，部分药材如丁香对绿衣观音土曲中的产酯酵母Y29具有较强的抑制作用[6]。因此，酒曲中药材的加入对白酒感官没有明显的负面影响，且在乙酸乙酯含量符合白酒优级酒和一级酒的范围内，具有较明显的降杂醇油和正丙醇的作用。
表1 土曲及药曲酒样的主要酒质指标检测结果
Table 1 Determination results of main liquor quality indexes in Tuqu Baijiu and Yaoqu Baijiu samples
出酒率/%2.93正丙醇/（g·L-1）-0.08杂醇油/（g·L-1）-0.12乙酸乙酯/（g·L-1）指标 样品 批次1 批次2 批次3 平均数 变化量土曲酒样药曲酒样土曲酒样药曲酒样土曲酒样药曲酒样土曲酒样药曲酒样54.69 59.05 0.58 0.50 1.31 1.20 0.76 0.73 57.59 58.64 0.62 0.48 1.29 1.06 0.83 0.54 56.22 59.57 0.50 0.48 1.11 1.10 0.68 0.48 56.16 59.09 0.57 0.49 1.24 1.12 0.76 0.58-0.18
中药材制曲对白酒中挥发性风味成分的影响见表2。由表2可知，土曲酒样中检出99种挥发性风味物质，有38种酯类、15种醇类、15种烷烃类、6种烯类、5种醛类、6种酮类、4种酸类、10种酚、苯、萘等其他物质，其中酯类占比最大，主要以乙酯形式存在。药曲酒样中共检出101种挥发性风味物质，其中39种酯类、19种醇类、10种烷烃类、6种烯类、5种醛类、7种酮类、3种酸类、12种酚、苯、萘等其他物质，占比最高的同样为乙酯形式存在的酯类物质。两种酒样中，共有物质共64种，土曲酒样中特有的物质共35种（8种烷烃、9种酯类、3种醇、4种烯烃、2种醛、2种酮、2种酸、5种其他类），其中石竹烯、糠醛为活性成分，相对含量分别为0.74%、0.01%。药曲酒样中特有物质共37种（4种烷烃、10种酯类、6种醇、4种烯烃、2种醛、3种酮、1种酸、7种其他类），其中异丁香烯、古巴烯、卡拉烯、丁香酚和α-白菖考烯具有一定活性。药曲酒样中酯类、烯类和醛类物质相对含量（分别为82.77%、2.76%、0.53%）高于土曲酒样（分别为66.23%、1.59%、0.46%），而土曲酒样中的醇类、烷烃类、酮类和酸类相对含量（分别为8.48%、3.99%、1.01%、0.94%）高于药曲酒样（分别为7.09%、2.10%、0.23%、0.86%）。土曲酒样中10种其他类物质占17.30%，主要物质为甲醚，而药曲酒样中12种酚、苯、萘等其他类物质仅占3.66%，主要物质为乙烯醚。从药曲酒样中发现的5种成分异丁香烯、古巴烯、卡拉烯、丁香酚和α-白菖考烯，鲜少在白酒中被发现，其中，异丁香烯相对含量最高（1.36%）。古巴烯相对含量为0.77%，目前，白酒中仅在竹叶青酒中检测到[7]，卡拉烯和α-白菖考烯在董酒中有检出[17]，相对含量分别为0.22%和0.03%，丁香酚相对含量为0.05%。因此，中药材的加入除了改善酒质之外，还能影响白酒中风味物质的结构，同时在白酒中引入新的风味物质，丰富白酒的内涵。
表2 土曲和药曲酒样中挥发性风味物质分析
Table 2 Analysis of volatile flavor substances in Tuqu Baijiu and Yaoqu Baijiu samples
种类烷烃类酯类醇类烯类醛类酮类酸类其他类土曲酒样种类数量/种相对含量/%药曲酒样种类数量/种 相对含量/%15 38 15 10 39 19 6 5 6 4 1 0 3.99 66.23 8.48 1.59 0.46 1.01 0.94 17.30 6 5 7 3 1 2 2.10 82.77 7.09 2.76 0.53 0.23 0.86 3.66
β-大马酮、吡嗪类、愈创木酚类物质也是白酒中常见的活性成分[18-19]，利用气质联用对两种酒样中的β-大马酮、四甲基吡嗪、愈创木酚类物质进行检测，探究酒曲中加入中药材对这些活性成分的影响，结果见表3。由表3可知，土曲酒样中含有一定量的大马酮、吡嗪类、愈创木酚类物质，说明这些物质来源于原料或酒曲微生物的代谢。相对于土曲酒样，药曲白酒中四甲基吡嗪含量提升了12.62%，由于川芎中富含四甲基吡嗪，其含量提升可能与药曲中加入川芎有关[4]；两组样品中β-大马酮含量无明显区别；愈创木酚含量增加23.36%，4-乙基愈创木酚含量增加7.81%，4-乙烯基愈创木酚含量增加20.71%，4-甲基愈创木酚含量减少21.46%，说明酒曲添加中药材对白酒中四甲基吡嗪等健康成分有一定的影响，可能与当归中含有一定的愈创木酚类物质及其前体阿魏酸有关[20-21]。在白酒发酵中，常采用筛选功能菌株强化到发酵过程来提升白酒中上述健康成分的含量。由以下结果可知，通过酒曲中添加中药材来提高白酒中活性成分也具有一定的效果，该方法可作为提升白酒中活性成分的有效补充。
表3 土曲和药曲酒样中活性成分含量检测结果
Table 3 Determination results of active ingredient contents in Tuqu Baijiu and Yaoqu Baijiu samples
活性成分 土曲酒样/（μg·L-1） 药曲酒样/（μg·L-1）变化率/%四甲基吡嗪β-大马酮愈创木酚4-甲基愈创木酚4-乙基愈创木酚4-乙烯基愈创木酚10.78±0.23 32.05±1.02 83.50±3.46 411.26±11.02 105.81±2.33 178.91±2.42 12.14±1.03 32.31±1.87 103.01±5.64 322.99±18.73 114.08±3.28 215.99±12.68 12.62 0.81 23.36-21.46 7.81 20.71
10种中药材的加入主要在白酒中引入了4种烯类物质和1种酚类物质，说明这些中药材的添加主要影响原酒的中烯类风味成分，而上述5种新增物质的来源则需要进一步进行确认。为探究药曲白酒中5种物质异丁香烯、古巴烯、卡拉烯、丁香酚和α-白菖考烯的中药材来源，将10种中药材分别单独加入绿衣观音土曲中，开展单药材酿造小试实验，对酒样中风味物质种类进行定性分析，其中，异丁香烯在9种中药材（丁香、肉桂、陈皮、当归、川芎、黄芪、丹参、人参、辣蓼）药曲酒样中均有检出。在肉桂酒样中检测出古巴烯，与张笮晦等[22]在肉桂中检测到较高含量的古巴烯结论一致，其他药材丹参、丁香和人参酒样中古巴烯同样有检出。仅肉桂酒样中检测出卡拉烯，而丁香酚在10种药材的酒样中均有检出。α-白菖考烯来自人参、陈皮、黄芪、丹参、丁香、肉桂和当归。
丁香酚是一种酚类芳香族化合物，具有良好的抗氧化、抑菌、抗病毒等作用[23-25]。萜烯类物质具有独特的香味，更具有多种功能活性，如抗癌、抗氧化、抗衰老等，研究中发现，萜烯类物质还能强化免疫力、抗击新冠病毒等[26]。因其萜烯类物质具有的健康功能特性，在功能饮品开发领域受到广泛关注。异丁香烯、古巴烯、卡拉烯和α-白菖考烯均属于萜烯类物质，但目前在白酒领域，尚缺乏系统研究。古巴烯具蒿草味，异丁香烯具松脂香，可提升白酒风味，两者均为倍半萜烯，除具有萜烯类的功能，同时具有倍半萜烯的共性，如消炎、止痛、降血压等[27-31]。因此异丁香烯和古巴烯是较理想的为健康白酒赋能的潜在活性成分，在白酒领域具有较大的应用前景。在开发相应健康白酒时，可在制曲过程结合中药的药效，针对性地对中药材的种类和比例进行合理配伍，实现清香型白酒中异丁香烯和古巴烯的内生。
选取10种中药材进行制曲酿造，生产的白酒出酒率提升2.93个百分点，正丙醇和杂醇油分别降低0.08 g/L和0.12 g/L，乙酸乙酯下降0.18 g/L，说明中药材的加入在一定程度影响清香型白酒的酒率和酒质。土曲和药曲白酒中挥发性风味物质的数量和物质种类差别较小，但土曲白酒中的烷烃类、酮类、醇类和其他类物质相对含量较高，药曲白酒中酯类、烯类物质相对含量较高。药曲白酒中发现具有抗氧化、抗衰老作用的异丁香烯和古巴烯，是尚未在清香型白酒中应用的活性成分，具有较大的应用前景。另外，药曲白酒中四甲基吡嗪、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚等活性成分含量也得到一定的提升，说明了在酒曲中添加中药材可作为一种有效的提升白酒中活性成分的途径。未来，根据中药材所能提供的功能成分进行科学配伍，可为白酒的健康保健性开发提供方向。
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