Optimization of fermentation conditions for production of D-lactic acid with high optical purity by Lactobacillus delbrueckii HB49-2
D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）作为自然界最小的手性分子，是多种手性物质的前体，广泛应用于医药、化工、农药和环保等领域[1-4]。以高光学纯度D-乳酸为原料合成的聚乳酸（polylactic acid，PLA）具有良好的生物相容性和可降解性，被认为是最具有前景的生物降解材料之一[5-6]。据统计，全球D-乳酸的需求量每年以6%～8%的速度增长，目前国内的产能已无法满足实际需求[7]。随着高光学纯度D-乳酸合成技术的不断突破，D-乳酸产业迅速发展，市场前景十分广阔[8-9]。
D-乳酸的主要生产方法有化学合成法和微生物发酵法，微生物发酵法与化学合成法相比，具有成本低、条件温和、环境友好和产品安全性高等优点[10-11]，但生产过程中仍存在菌种产酸性能低、发酵副产物多等问题，导致D-乳酸的产量较低且光学纯度不高[12-14]。目前，在工业上利用较多的D-乳酸生产菌种主要是乳杆菌属（Lactobacillus sp.）和芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus sp.）[15]，这两类菌属发酵方式均为同型乳酸发酵，即以葡萄糖为碳源通过糖酵解途径生成丙酮酸，然后在D-乳酸脱氢酶的作用下转化为D-乳酸。这类发酵方式所需的能耗少，产物浓度及纯度高，适合规模化工业生产[8]。德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）是乳杆菌属的代表种之一，其可在35～43 ℃条件下利用葡萄糖等碳源发酵生产高光学纯度D-乳酸[16-17]，逐渐成为国内外学者们研究的热点。TASHIRO Y等[18]利用德氏乳杆菌QU41以葡萄糖为底物发酵168 h后，D-乳酸产量为87.4 g/L，光学纯度达到99.9%。邵莲月[19]通过单因素和正交试验得到德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC21101的最佳发酵条件，其在最佳条件下发酵72 h后，D-乳酸产量高达62.7 g/L。韩文静等[20]通过单因素试验优化德氏乳杆菌保加利亚亚种的发酵条件，其在最佳条件下发酵72 h后，D-乳酸产量为37.8 g/L。肖雨[21]采用等离子-紫外复合诱变技术得到德氏乳杆菌保加利亚亚种W209，其在42 ℃条件下发酵48 h后D-乳酸产量为54 g/L。宋婉莹[22]采用单因素及正交试验确定德氏乳杆菌保加利亚亚种S105的最佳发酵条件，其在最佳发酵条件下发酵72 h，D-乳酸产量达62.9 g/L。梁琼[23]在发酵培养基中添加0.015 μg/L的维生素B12后，德氏乳杆菌的D-乳酸产量提高至67.5 g/L。
随着研究人员对德氏乳杆菌发酵生产D-乳酸的关注度持续升高，发酵过程中D-乳酸产量和光学纯度低等瓶颈问题亟待突破。针对德氏乳杆菌发酵产酸存在的问题，本实验室前期从野外果园中筛选出一株产高光学纯度D-乳酸的德氏乳杆菌HB49-2，本研究以其为研究对象，采用单因素试验及Box-Behnken响应面试验对其产D-乳酸的发酵条件及培养基进行优化，进一步提高D-乳酸的产量，为德氏乳杆菌产D-乳酸发酵条件摸索以及生产应用提供参考。
1.1.1 菌株
德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）HB49-2：从江西省九江市桃园土壤中分离获得，由本研究室保存。
1.1.2 试剂
轻质碳酸钙（99.2%）：广西西陇化工有限公司；甲醇（99.9%）：德国默克公司；DL-乳酸钠标准品（纯度为99.0%）：美国SIGMA公司；葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨（均为生化试剂）、微量元素（99.0%）、维生素（99.0%）：生工生物工程（上海）股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
MRS液体培养基[2]：葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、牛肉膏5.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、柠檬酸三铵2.0 g/L、醋酸钠5.0 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、吐温80 1.0 mL/L、pH值6.2～6.4，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。MRS固体培养基：MRS液体培养基中添加琼脂15.0 g/L。
种子培养基[2]：在MRS液体培养基中加入CaCO3 5 g/L。
基础发酵培养基[2]：葡萄糖110 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10 g/L、磷酸氢二钾0.25 g/L、磷酸二氢钾0.25 g/L、乙酸钠0.05 g/L、硫酸镁0.5 g/L、碳酸钙50 g/L，pH值6.2～6.4，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
15 cm×30 cm厌氧培养袋及2.5 L二氧化碳产气袋：日本三菱株式会社；D30分光光度计：德国艾本德股份公司；Waters 2695e高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国Waters公司；H2100R高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Starter 3100台式pH计：上海子期实验设备有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；G154DS高压蒸汽灭菌锅：致微（厦门）仪器有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；Practum 224-ICN分析天平：德国赛多利斯公司；ZWY-2102C恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司。
1.3.1 德氏乳杆菌HB49-2生长曲线的测定
将甘油保存的供试菌株以10%（V/V）的接种量接种至装有5 mL MRS液体培养基的Hungate管中，37 ℃静置厌氧培养24 h，连续活化3代备用。将活化液按10%的接种量接种于种子培养基中，装液量为50 mL/250 mL，置于装有二氧化碳产气袋的培养袋中，密封，在37 ℃、150 r/min条件下厌氧培养17 h。将种子液按5%的接种量接种至MRS液体培养基中，置于装有二氧化碳产气袋的培养袋中，密封，于37 ℃、150 r/min条件下厌氧培养24 h，每隔2 h取样，以未接菌的培养基作为空白对照，在波长600 nm处测定OD600 nm值。以培养时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标绘制生长曲线。
1.3.2 德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸发酵条件优化单因素试验
将种子液按10%的接种量接种至基础发酵培养基中，装液量为100 mL/250 mL，置于装有二氧化碳产气袋的培养袋中，密封，在37 ℃、180 r/min条件下培养72 h。在此基础上，依次考察接种量（5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%、20.0%）及发酵温度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃）对D-乳酸产量的影响。
在基础发酵培养基中分别加入MnSO4、FeSO4、ZnSO4和CuSO4，每种微量元素添加量分别为0、0.025 g/L、0.050 g/L、0.075 g/L、0.100 g/L；在基础发酵培养基中分别加入维生素B1（vitamin B1，VB1）、VB6、VB12、VC和VE，每种维生素添加量分别为0、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L，将种子液按10%的接种量接种至不同发酵培养基中，装液量为100 mL/250 mL，置于装有二氧化碳产气袋的培养袋中，密封，在37 ℃、180 r/min条件下厌氧培养72 h，取样测定发酵液中的D-乳酸含量，考察不同微量元素、维生素的种类及添加量对D-乳酸产量的影响[17]。
1.3.3 德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸发酵条件优化Box-Behnken响应面试验
在单因素试验的基础上，选择影响较大的因素，以D-乳酸产量（Y）为响应值，运用Design-Expert 13.0.1软件设计3因素3水平的Box-Behnken响应面试验[24]。
1.3.4 测定方法
葡萄糖、乳酸含量的测定[25]：将发酵液在10 000 r/min条件下离心10 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤后采用HPLC检测葡萄糖、乳酸含量。
乳酸光学纯度的测定[25]：采用HPLC检测发酵液中的D-乳酸及L-乳酸含量，并计算D-乳酸光学纯度，其计算公式如下：
式中：SL为L-乳酸峰面积；SD为D-乳酸峰面积。
1.3.5 数据处理与统计分析
所有试验均设置3个平行，试验数据运用SPSS Statistics 22.0软件进行分析，结果以“平均值±标准差”表示；运用Excel 2021软件制作图表；运用Design-Expert 13.0.1软件设计响应面试验。
德氏乳杆菌HB49-2的生长曲线见图1。由图1可知，培养0～6 h时，菌株HB49-2生长缓慢，处于生长迟缓期；培养6～18 h时，菌株HB49-2快速生长，处于对数生长期；培养18 h之后，菌体浓度处于稳定期并开始略微下降，因此，选择培养时间17 h作为最适种龄。
图1 德氏乳杆菌HB49-2的生长曲线
Fig.1 Growth curve of Lactobacillus delbrueckii HB49-2
2.2.1 接种量及发酵温度对菌株HB49-2产D-乳酸的影响
接种量及发酵温度对菌株HB49-2产D-乳酸的影响见图2。由图2A可知，随着接种量的增加，菌株HB49-2的D-乳酸产量呈先升高后下降的趋势，当接种量为15%时，D-乳酸产量最高，达到68.49 g/L，之后继续增加接种量D-乳酸产量反而降低，可能是因为接种量过大后培养基中营养成分主要用于菌株的生长，导致产酸量降低[20]，因此，选择15%为最佳接种量。由图2B可知，随着发酵温度的升高，D-乳酸产量呈现先升高后降低的趋势，当发酵温度为39 ℃时，D-乳酸产量最高，达到70.21 g/L，分析原因可能是发酵温度继续升高后影响菌体细胞内代谢酶的活性，导致产酸量降低[20]，因此，选择39 ℃为最佳培养温度。
图2 接种量（A）和发酵温度（B）对德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸的影响
Fig.2 Effects of inoculum (A) and fermentation temperature (B) on D-lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii HB49-2
2.2.2 微量元素与维生素对菌株HB49-2产D-乳酸的影响
微量元素、维生素种类及含量对菌株HB49-2产D-乳酸的影响见图3。由图3A可知，添加不同种类及质量浓度的微量元素对菌株HB49-2产D-乳酸的影响有所差别，添加Mn2+对菌株产D-乳酸有抑制作用，当添加量高于0.05 g/L时抑制作用较为明显；Fe2+对菌株HB49-2产D-乳酸有略微的促进作用；而添加Zn2+、Cu2+对菌株HB49-2产D-乳酸促进作用不明显。由图3B可知，维生素对菌株HB49-2的生长有一定的影响，添加VB1对菌株HB49-2的D-乳酸产量有轻微的促进作用，添加VB12的促进作用较为明显，且随着添加量的增加，D-乳酸产量均呈先升高后下降的趋势，当VB1、VB12的质量浓度达到40 mg/L时，D-乳酸产量均最高，分别为65.64 g/L、71.21 g/L；而添加VB6、VC、VE对菌株HB49-2产D-乳酸促进作用不明显。综上，在基础发酵培养基中添加VB12明显有利于德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸，且最佳添加量为40 mg/L，这与梁琼等[23，26]的研究结果一致。
图3 不同微量元素（A）及维生素（B）添加量对德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸的影响
Fig.3 Effects of different trace elements (A) and vitamin (B) addition on D-lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii HB49-2
在单因素试验结果的基础上，选择对德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸影响较大的因素接种量（A）、发酵温度（B）、VB12添加量（C）为考察因素，以D-乳酸产量为响应值，运用Design-Expert 13.0.1软件设计3因素3水平Box-Behnken响应面试验，试验设计及结果见表1，回归模型方差分析见表2。
表1 德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸发酵条件优化Box-Behnken响应面试验设计及结果
Table 1 Design and results of Box-Behnken response surface experiments for fermentation conditions optimization of D-lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii HB49-2
序号 A 接种量/%B 发酵温度/℃C VB12添加量/（mg·L-1）Y D-乳酸产量/（g·L-1）1234567891 0-1（14）1（16）-1 1-1 1-1 1 0（15）-1（38）-1 1（40）1 0（39）0（40）000 000--1（35）-1 1（45）1-1-1 11 12 13 14 15 16 17 00000000 11-1100000 1100000 70.29±0.34 72.46±0.23 73.34±0.29 73.72±0.42 72.09±0.18 72.85±0.27 74.34±0.51 76.51±0.40 72.78±0.26 75.28±0.39 74.19±0.32 76.42±0.48 81.69±0.36 80.75±0.35 80.38±0.29 82.54±0.31 81.83±0.37
表2 回归模型的方差分析
Table 2 Variance analysis of regression models
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
来源 平方和 自由度 均方值 F 值 P 值 显著性模型ABCA B*******AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和246.37 3.75 10.22 8.95 0.801 0.497 0.018 2 99.15 71.91 29.3 4.48 1.45 3.02 250.84 91111111117341 6 27.37 3.75 10.22 8.95 0.801 0.497 0.018 2 99.15 71.91 29.3 0.639 4 0.483 8 0.756 1 42.81 5.87 15.98 13.99 1.25 0.777 4 0.028 5 155.08 112.48 45.82＜0.000 1 0.045 9 0.005 2 0.007 3 0.299 9 0.407 2 0.870 7＜0.000 1＜0.000 1 0.000 3******0.639 8 0.628 2
采用Design-Expert13.0.1软件对表1中的试验数据进行二次多元回归拟合分析，得到以D-乳酸产量（Y）为响应值的二次多项式回归方程：Y=81.438+0.685A+1.13B+1.057 5C-0.447 5AB+0.352 5AC-0.067 5BC-4.852 75A2-4.132 75B2-2.637 75C2。
由表2可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明模型可靠。决定系数R2为0.982 1，调整决定系数R2Adj为0.959 2，变异系数（coefficient of variation，CV）为1.06%，说明模型的拟合度较好，数据之间误差较小，能够对D-乳酸产量进行分析和预测。由P值可知，一次项A对结果影响显著（P＜0.05），一次项B、C及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），其他因素对结果影响不显著（P＞0.05），说明接种量、发酵温度、维生素B12添加量对菌株HB49-2产D-乳酸影响显著。各因素间交互作用对结果影响的响应面及等高线见图4。
图4 各因素间交互作用对德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸的响应曲面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on D-lactic acid production by Lactobacillus delbrueckii HB49-2
由图4可知，接种量、发酵温度、维生素B12添加量间交互作用对D-乳酸产量影响的3个响应曲面均呈抛物面状，说明存在极值点，等高线均趋于圆形，说明各因素间交互作用对德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸的影响较小，这与方差分析结果一致。对二次多项回归方程求解得到德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸的最佳发酵条件：接种量15.07%，发酵温度39.13 ℃，维生素B12添加量40.21 mg/L，D-乳酸产量的预测值为81.64 g/L。考虑试验的可操作性，修正最佳发酵条件为接种量15%，发酵温度39 ℃，维生素B12添加量40 mg/L，在此条件下进行3次平行验证试验，得到D-乳酸的平均产量为82.15 g/L，与预测值接近，比优化前产量（62.01 g/L）提高32.4%，高于邵莲月等[19-22]的试验结果。
将德氏乳杆菌HB49-2在最佳发酵条件下发酵培养72 h，采用HPLC测定D-乳酸和L-乳酸含量，HPLC色谱图见图5。在此条件下，D-乳酸的平均光学纯度为99.89%，这与TASHIRO Y等[18]的试验结果相近。
图5 德氏乳杆菌HB49-2发酵液与DL-乳酸标准品高效液相色谱对比图
Fig.5 Comparison of high performance liquid chromatography between Lactobacillus delbrueckii HB49-2 fermentation broth and DL-lactic acid standard
本研究采用单因素试验及响应面试验优化得到德氏乳杆菌HB49-2产D-乳酸的最优发酵条件为接种量15%、发酵温度39 ℃。最适发酵培养基成分为葡萄糖110 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉10 g/L、磷酸氢二钾0.25 g/L、磷酸二氢钾0.25 g/L、乙酸钠0.05 g/L、硫酸镁0.5 g/L、维生素B12 40 mg/L、碳酸钙50 g/L。在此优化条件下，发酵培养72 h后，D-乳酸产量为82.15 g/L，比优化前产量（62.01 g/L）提高32.4%，D-乳酸的光学纯度为99.89%，研究结果对德氏乳杆菌工业化生产D-乳酸具有一定的指导意义。
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