是根据产品间的差异性和相似性进行感官位置的摆放从而生成感官图的一种快速感官分析技术，该方法结合了自由选择的概念和快速确定感官属性描述词的特点，其要求评价员在每个产品的位置写下描述词，该方法中评价人员可以是未经训练的[14]，目前广泛应用于感官研究中[14-16]。Effects of ultrasonic treatment on accelerating aging of domestic new whiskey in the soaking stage
国产威士忌在生产工艺上主要沿袭了传统威士忌的生产工艺，大麦芽粉碎后经过发酵、蒸馏得到威士忌新酒，新酒需要在橡木中自然陈酿，而后经调配获得成品酒[1]。陈酿阶段主要起到提取橡木成分、挥发或吸附不愉快风味成分以及降低酒精的刺激感以使得酒体变柔和的作用[2]。但传统的自然陈酿方式需要花费几个月或几年的时间[3]。为了缩短生产时间、降低生产成本，酒类生产者和技术人员尝试将快速、低成本的人工陈酿方法用于加速酒类陈酿。例如在葡萄酒的陈酿研究中，橡木制品催陈技术[4-6]、超声波催陈技术[7-8]以及二者的联用[8]均有报道。橡木制品催陈是指将橡木制品投加于酒液中模拟橡木桶陈酿的橡木浸出功能[6]。超声波处理可以提供额外的能量促进酒中各成分反应和转化。有报道指出使用超声波处理葡萄酒、白兰能够提高酒的色度和总酚含量[9-10]。超声波技术催化其他酒类陈酿也有报道[11-12]。但仍需要有关超声催陈过程中酒液成分变化的相关研究作为超声波催陈技术的工业化应用的理论支撑[7]。目前橡木制品催陈技术已应用于国产威士忌的生产中，即在橡木桶陈酿之前增加橡木片浸泡工段。浸泡阶段是国产威士忌风味形成的关键阶段[13]。但橡木制品与超声波处理联用实现威士忌催陈的研究鲜见报道。
传统描述性感官分析虽然已经被广泛使用，并且可以很好地描述一款产品的特征和强度，但由于其需要对评价员有较长时间的训练，使评价员具有较好且一致的评价能力，这在实际操作中需要较长的时间和较高的成本，所以目前感官描述性分析方法正朝着快速便捷的方向发展，旨在提高描述性分析方法效率和减少成本。其中Napping是根据产品间的差异性和相似性进行感官位置的摆放从而生成感官图的一种快速感官分析技术，该方法结合了自由选择的概念和快速确定感官属性描述词的特点，其要求评价员在每个产品的位置写下描述词，该方法中评价人员可以是未经训练的[14]，目前广泛应用于感官研究中[14-16]。
本研究在国产威士忌生产的浸泡阶段偶联超声波处理工艺，目的在于利用超声波能量提高橡木片成分的溶出并促进成分的转化。以未偶联超声波处理酒样为对照，对偶联超声波处理的酒样定期采样，监测陈酿过程中酒样的色度、澄清度、团簇平均粒径、总酚、橡木浸出物、总酯和高级醇等指标的变化，并利用正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）及快速感官分析综合评价浸泡偶联超声波处理酒样与新酒、成品酒的差异，以判断浸泡阶段偶联超声波处理对国产威士忌新酒陈酿是否存在催化作用。以期为国产威士忌催陈技术应用提供理论参考，提高威士忌风味。
1.1.1 材料
威士忌新酒、威士忌成品酒：河南省京德精酿有限公司；中度烘烤橡木片（产地法国）：烟台曼森商贸有限公司。
1.1.2 化学试剂
无水乙醇、无水碳酸钠、氢氧化钠（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；福林酚（分析纯）：合肥博美生物科技有限责任公司；没食子酸、丁香酸、香草酸、松柏醛、芥子醛、糠醛、香草醛、5-甲基糠醛、丁香醛、鞣花酸、南烛木树脂酚、原儿茶酸、莨菪亭、正丙醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1丁醇（均为色谱纯）：上海远慕生物科技有限责任公司。
721G紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；JY98-IIIDN超声波细胞破碎机：宁波新芝生物科技有限公司；LC1200高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配光电二级阵列管检测器（photodiode array detector，PDAD））、Agilent 7890B气相色谱（gas chromatography，GC）仪（配氢火焰离子化检侧器（flame ionization detector，FID））：美国安捷伦公司；ZETASIZER NANO ZSE纳米粒度仪、Zeta电位分析仪：美国马尔文帕纳科公司。
1.3.1 浸泡偶联超声波处理方法
参考国产威士忌酿造工艺[13]，威士忌发酵液经蒸馏摘酒后得到的酒液为威士忌新酒，新酒经过净化器净化；将净化后的新酒置于不锈钢容器中，投放橡木片，浸泡1周得到浸泡酒；将浸泡酒转移至橡木桶中于20 ℃下存放2年，得到陈放酒；将陈放酒与新酒进行人工调配得到成品酒（酒精度≥40%vol）。由于本实验浸泡阶段施加了超声波处理，因此橡木片投加量调整为4 g/L。在浸泡过程中用超声波清洗机对酒样施加超声波处理，参考白兰地的超声处理条件并加以改进[6]，在冰浴下（酒样温度≤25 ℃），采用超声功率720 W、超声频率20 kHz、以超声处理4 min-停歇6 min的间歇处理方式，每天处理60 min，连续处理7 d，所得超声波处理样品，简称为“超声酒”。以浸泡期内不施加超声波处理的酒样为对照，简称为“未超声酒”。试验设计3个重复。
1.3.2 分析检测
（1）基本理化指标的测定
以波长420 nm条件下的吸光度值表示威士忌的色度[17]；以波长800 nm条件下的透光率表示威士忌的澄清度[18]；酒中分散的粒子（团簇）是酒液成分通过聚合作用形成的[19]，参考酒液中团簇粒径测定方法[20]测定威士忌中团簇平均粒径；采用Folin酚法测定样品的总酚含量[21-22]。
（2）橡木浸出物的测定
选择没食子酸、原儿茶酸、丁香醛、丁香酸、香草醛、香草酸、糠醛、5-甲基糠醛、莨菪亭、鞣花酸、南烛木树脂酚、芥子醛、松柏醛作为主要的橡木浸出物，并采用HPLC法测定[23-24]。
（3）总酯和高级醇含量的测定
参考国标GB/T 11857—2008《威士忌》中的滴定法测定总酯含量[25]；参考地方标准DB44/T 1387—2014《威士忌鉴定技术规范》中的气相色谱（GC）法测定高级醇含量[26]。以正丙醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇，3-甲基-丁醇作为威士忌中高级醇的测定目标物，以乙酸正戊酯为内标，标准物和内标终质量浓度均为200 mg/L。GC条件：LZP930毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm）；进样量1 μL；火焰离子化检测器（FID）加热器250 ℃，升温程序为40 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至180 ℃，保持10 min，以6 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；载气（N2）流速1 mL/min；氢气（H2）流量30 mL/min，空气流量400 mL/min，分流比为20∶1。
定性定量方法：根据保留时间定性，利用标准品和内标物计算各物质的峰面积校正系数f，再根据样品中目标物和内标的峰面积，采用内标法计算目标高级醇的含量[26]。
（4）感官分析
本研究采用Napping
快速感官分析技术对超声酒、未超声酒、新酒以及成品酒的香气进行评价。品评小组由11名从事威士忌生产和研发的人员组成，在品评过程中要求评价员对4种威士忌样品根据香气的相似性和差异性在40 cm×60 cm的纸上进行摆放，统计每种样品的坐标。
1.3.3 数据处理
除感官分析外，各项指标重复检测3次，结果以“平均值±标准差”形式表示。采用OriginPro9.1绘制折线图。对橡木浸出成分的测定结果进行z-score标准化[27]，然后采用R语言4.3.1的ComplexHeatmap和circlize程序包绘制环形热图，以每个扇区的颜色变化表示各成分随陈酿时间的变化。采用IBM SPSS Statistics 20.0对样本进行t检验。利用迈维云平台（https：//cloud.metware.cn）进行正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）建模分析，评价浸泡偶联超声波处理工艺在威士忌催陈中的综合效果。采用R语言的SensoMineR程序包分析感官分析数据，并绘制个体因子图。
威士忌酒样的色度和澄清度在陈酿过程的变化见图1。由图1a可知，在浸泡阶段结束时（陈酿0 d）超声酒的色泽远高于未超声酒，这是由于超声波的空穴作用破坏了橡木片细胞壁的结构，促进了橡木成分在短期内大量溶出，表现为超声酒的色度高于未超声酒。在陈酿0 d时，未超声酒中橡木片可溶物浓度高于超声酒中橡木片的可溶物浓度，固液两相浓度差较大，推动力大。因此在陈酿0～15 d时，未超声酒中橡木成分的溶出速率高于超声酒，表现为未超声酒色度增加速率高于超声酒。随后由于固液两相浓度差越来越低，两种酒的色度都表现为缓慢增加。陈酿90 d时，超声酒色度高于未超声酒6.4%，这说明因超声波处理而溶出的呈色成分在陈酿初期是稳定的。这与FERNÁNDEZ L L等[28]将超声技术应用于葡萄酒陈酿的结果相近。
图1 威士忌酒样色度（a）和澄清度（b）在陈酿过程中的变化
Fig.1 Changes of color (a) and clarity (b) of whiskey samples during the aging process
由图1b可知，超声酒的澄清度显著低于未超声酒。在陈酿90 d内，未超声酒的澄清度持续缓慢下降，这可能是橡木成分在陈酿过程中缓慢释放，浸出成分之间、浸出成分与酒液成分之间发生聚合引起的[19]。超声酒的澄清度呈先增加后快速降低的变化趋势。这可能是超声波的破碎作用除了引起橡木内容物的浸出外，还引起了橡木片细胞的破碎，产生的碎片使得陈酿0 d的澄清度低于未超声酒；而随着陈酿的进行，这些碎片沉降，且橡木内容物浸出速度减缓，导致酒液澄清度总体上呈现升高的趋势。但随着陈酿时间的继续延长，橡木内容物的浸出、成分的聚合使得酒液澄清度又快速降低。超声酒的澄清度极显著低于未超声酒（P＜0.01），陈酿90 d时，超声酒澄清度低于未超声酒8.9%。说明超声波处理能够促进橡木内容物浸出、为聚合反应提供了更多的反应物。
从色度和澄清度在陈酿过程中变化来看，超声波处理能够加速橡木成分的溶出，在较短的时间内使得酒获得陈酿酒色度，但酒的澄清度会受到一定的影响。
威士忌新酒中团簇平均粒径为（282.3±3.2）nm，成品酒中团簇平均粒径为（336.1±19.0）nm，说明威士忌的成熟过程中酒液成分、橡木浸出成分会发生聚合作用，使得酒液中团簇平均粒径增加，这也是酒液风味经陈酿后变得柔和的原因之一[29-30]。威士忌酒样中团簇平均粒径在陈酿过程中的变化见图2。
图2 威士忌酒样中团簇平均粒径在陈酿过程中的变化
Fig.2 Changes of average particle size of clusters of whiskey samples during the aging process
由图2可知，浸泡期结束时未超声酒中团簇平均粒径显著降低至（219.8±6.1）nm，这可能是由于橡木片对新酒中的较大团簇有吸附作用；超声酒中团簇平均粒径显著降低至（198.1±3.3）nm，说明超声波的能量对新酒中的团簇还有破碎作用。在陈酿初期，无论是否超声波处理，酒样中团簇平均粒径变化趋势是基本一致的，都在15 d时达到最大值（在15 d前大量溶出的橡木浸出物发生聚合，表现为团簇平均粒径增加），然后出现缓慢降低（形成的大团簇缓慢沉降，表现为平均粒径减小）。但陈酿达到90 d时超声酒中的团簇平均粒径开始回升，且显著高于未超声酒（P＜0.05）。结果表明，超声波作用可以加速酒液中物质的聚合，使得酒中团簇平均粒径的增加提前出现，因此，可以认为在浸泡阶段偶联超声波处理可以起到促进威士忌成熟的作用。
威士忌酒样中总酚含量在陈酿过程的变化见图3。由图3可知，在浸泡期结束时超声酒的总酚含量显著高于未超声酒（P＜0.05），说明超声波处理促进了橡木中酚类物质的释放。本实验结果与DELGADO-GONZÁLEZ M J等[9]研究结果一致。随着陈酿的进行，未超声酒的总酚含量在陈酿30 d时变化不显著。超声酒的总酚含量在60 d前高于未超声酒，在90 d时略低于未超声酒。超声酒总酚的小幅度下降可能是由于来自橡木片的酚类物质参与了聚合反应。
图3 威士忌酒样中总酚含量在陈酿过程的变化
Fig.3 Changes of total phenols contents in whiskey samples during the aging process
威士忌酒样中橡木浸出物高效液相色谱图见图4。由图4可知，威士忌酒样中共检测出11种主要橡木浸出物单体，包括没食子酸、糠醛、香草醛、丁香酸、5-甲基糠醛、香草酸、丁香醛、鞣花酸、南烛木树脂酚、松柏醛、芥子醛。
图4 威士忌酒样中橡木浸出物高效液相色谱图
Fig.5 High performance liquid chromatogram of oak extracts in whiskey samples
各橡木浸出物在超声酒和未超声酒中的含量变化见图5。由图5可知，在超声酒样中丁香酸、香草酸、松柏醛和芥子醛始终高于未超声酒，说明超声波的破碎作用能够提高酒样中这四种浸出物的含量，且在陈酿过程中能始终保持较高的含量。随着陈酿时间的延长，在超声酒中糠醛、香草醛、没食子酸、5-甲基糠醛、丁香醛、鞣花酸、南烛木树脂酚的含量由最初的接近或高于未超声酒，逐渐转变为低于未超声酒，可推测这几种单体参与了聚合反应[23，31]或被橡木片重新吸附[24，32]。由此可推测，超声波处理能够提高酒中丁香酸、香草酸、松柏醛和芥子醛的含量，能够促进其他酚类参与聚合反应。
图5 威士忌酒样中橡木浸出物含量在陈酿过程的变化
Fig.5 Changes of oak extracts contents in whiskey samples during the aging process
威士忌酒样中总酯和高级醇含量在陈酿过程中的变化见图6。由图6a可知，超声酒和未超声酒在陈酿初期总酯含量均呈现先降低后回升的特点。在超声波处理过程中，超声能量加速了酯类的挥发和/或分解，使得超声酒在浸泡阶段结束时显著低于未超声酒（P＜0.05）。在陈酿30 d内，酒样中酯类挥发、水解或参与聚合反应，因此出现了总酯含量降低的现象。而后由于酯化反应占据主导，总酯含量又呈现上升的趋势，这与CǍLUGǍR A等[33]研究结果一致。
图6 威士忌酒样中总酯（a）和高级醇（b）含量在陈酿过程中的变化
Fig.6 Changes of total esters (a) and higher alcohols (b) contents in whiskey samples during the aging process
由图6b可知，超声酒和未超声酒在陈酿初期高级醇含量均呈现先降低后回升的特点。有研究表明，添加橡木片可以提高酒中高级醇的含量[34]。在超声波处理过程中，超声波的能量可能加速了橡木浸出物的溶出，使得在浸泡阶段结束时，高级醇在超声酒中显著高于未超声酒（P＜0.05）。在陈酿30 d内，超声酒和未超声酒都出现了高级醇含量降低的现象，这可能是酒样中醇类重新被橡木吸附，导致测定结果降低[35]。而后橡木片中高级醇进一步溶出，因此在陈酿30 d后高级醇含量有所回升。
参考国家标准GB 11857—2008《威士忌》，优级威士忌总酯含量＜0.8 g/L[25]；参考广东地方标DB 44/T1387—2014《威士忌鉴定技术规范》，威士忌高级醇含量（正丙醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇）＞1.25 g/L[24]。通过成品酒分析发现，成品酒的总酯含量约为（0.13±0.01）g/L，显著低于新酒（0.88±0.01）g/L（P＜0.05）；成品酒的高级醇含量约为（2.40±0.29）g/L，显著高于新酒（1.53±0.22）g/L（P＜0.05）。这说明在国产威士忌的成熟过程中，成品酒总酯低于新酒、高级醇高于新酒，这可能由于在陈酿期酒中的酯类会发生分解、橡木片溶出高级醇，导致了总酯含量的降低和高级醇含量的增加。
结果表明，超声酒在60 d后总酯含量上升开始变缓，且显著低于未超声酒；超声酒在30 d后高级醇含量快速上升，且上升速度大于未超声酒。当陈酿90 d后，超声酒的总酯含量为（0.55±0.02）g/L，高级醇含量为（1.53±0.03）g/L，均已经达到高级醇含量和总酯含量的标准范围。未超声酒的总酯含量为（0.86±0.04）g/L，还未达到总酯含量标准范围，高级醇含量为（1.30±0.04）g/L，刚刚达到高级醇含量标准范围。因此，可以推断超声波处理有加速国产威士忌成熟的作用。
正交偏最小二乘-判别分析得分图和模型验证结果见图7。由图7a可知，与未经超声波处理的威士忌酒样相比，超声波处理酒样与成品酒更接近，说明在浸泡阶段偶联超声波处理能够催化威士忌的陈酿，使威士忌酒在色度、澄清度、团簇粒径、总酚含量、总酯含量、高级醇含量这些指标上更接近成品酒。由图7b可知，经过浸提橡木块并陈酿90 d的威士忌酒样与新酒有很大差异，模型预测能力Q2=0.86，解释能力（R2Y）=0.902，P值均＜0.05，说明该模型拟合效果较好。
图7 正交偏最小二乘-判别分析得分图（a）和模型置换检验结果（b）
Fig.7 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis score plot (a) and model permutation test results (b)
快速感官分析Napping
快速感官分析的个体因子图见图8。由图8可知，4种威士忌酒样被明显分为3个组：新酒、陈酿90 d酒样和成品酒，超声波处理与未超声波处理的样品距离较小，但都远离新酒，且超声酒与成品酒距离更近，说明超声酒在香气上比未超声酒更接近成品酒。
图8 Napping
快速感官分析个体因子图
Fig.8 Individual factor map of Napping 
rapid sensory analysis
在浸泡阶段偶联超声波处理能够促进橡木片成分溶出，在较短的时间内使得酒获得陈酿酒色度，且超声波处理增加的呈色物质在陈酿过程中是稳定的，但酒的澄清度会受到一定的影响。超声波作用使得酒中团簇平均粒径的增加提前出现。超声波处理促进了橡木中酚类物质的释放，提高了酒中丁香酸、香草酸、松柏醛和芥子醛的含量，同时也促进了酚类物质参与聚合反应。超声波作用还导致了总酯含量的降低和高级醇含量的增加，加速酒体成分由新酒向成品酒的转变。处理后的酒样在色度、澄清度、团簇粒径、总酚含量、总酯含量、高级醇含量以及香气上更接近威士忌成品酒。因此，超声波的能量能够有效加速新酒在陈酿过程的物理化学反应。在新酒的浸泡阶段偶联超声波处理能够起到催化威士忌新酒陈酿的作用。
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