Effect of different pretreatment methods on the quality of fermented mustard
华容大叶芥菜（Brassica juncea var.longepetiolata（L.）Czern.et Coss.）是十字花科芸属植物，芥菜叶富含叶绿素、β-胡萝卜素、抗坏血酸、多酚和有机硫化合物以及钾、钙等矿物质[1]。腌制后的芥菜具有淡黄的色泽，爽脆的口感，酸香的风味，长期以来作为日常佐餐食品深受人们喜爱，具有良好的市场前景[2]。
传统芥菜腌制原料预处理方法是芥菜收割后在田间直接晾晒，之后添加食盐进行自然发酵，存在许多不易控制的因素，如农药残留、杂菌繁殖、亚硝酸盐超标、食盐浓度过高以及加工过程中其他物质污染等，风味、品质与安全难以保证[3]。目前国内外腌制芥菜研究主要有微生物多样性分析[4]、发酵菌种筛选和发酵剂制备[5]、发酵过程主要化学成分的变化[6-7]等，杜玫等[8]研究了蒸汽、微波、紫外等处理方式对小叶芥菜发酵过程的影响[7]。但有关大叶芥菜预处理方法对发酵过程和发酵芥菜品质影响的研究尚鲜见报道。
本研究以华容大叶芥菜为原料，采用漂烫、盐水浸泡、晾晒等方式对原料进行预处理，然后进行低盐（6%食盐）发酵，研究新鲜芥菜不同预处理方式对发酵芥菜的理化指标、质构、风味特征物质及感官品质的影响，基于质构、挥发性风味物质进行主成分分析（principal component analysis，PCA），正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）及聚类分析（cluster analysis，CA），并利用变量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）值筛选差异挥发性化合物。旨在优化发酵芥菜生产工艺，提高发酵芥菜清洁化生产水平，提升发酵芥菜的风味、品质和安全性，为规模化、标准化生产低盐、高品质、好风味的发酵芥菜提供技术支撑。
华容大叶芥菜：2024年3月中旬采自华容县护城乡，采后立即运回实验室。
氢氧化钠、酚酞试剂、邻苯二甲酸氢钾、甲醛、浓盐酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺（均为分析纯）、琼脂、月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（均为生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠、四硼酸钠、亚铁氰化钾、乙酸锌（均为分析纯）：福晨（天津）化学试剂有限公司。
HCB-1600H超净工作台：海尔生物医疗有限公司；Forma 900超低温冰箱：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；雷磁PHS-2FpH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；AR1124CN精密电子天平：上海坤权生物科技有限公司；CS-580A分光测色仪：杭州彩谱科技有限公司；XMTD-7000离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HH-S6恒温水浴锅：郑州亚荣仪器有限公司；101-2AB烘箱：天津泰斯特仪器有限公司；KQ-250DE超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；TX-XT plus质构仪：美国Stable Microsystems公司；GCMSQP2010岛津气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：日本岛津公司；85 μm萃取纤维头：美国Supelco公司。
1.3.1 发酵芥菜样品预处理方法
采收后的新鲜芥菜采用9种不同的方法进行预处理：①芥菜采收后直接腌制，记为CK；②蒸汽漂烫2 min，冷却，沥干水分，记为TG1；③沸水漂烫2 min，冷却，沥干水分，记为TG2；④沸水漂烫2 min，冷却，日晒至叶片萎蔫，记为TG3；⑤蒸汽漂烫2 min，冷却，日晒至叶片萎蔫，记为TG4；⑥日晒至叶片萎蔫，记为TG5；⑦芥菜采收后水洗，日晒至叶片萎蔫，记为TG6；⑧芥菜采收后用4%食盐水常温浸泡2 h后，日晒至叶片萎蔫，记为TG7；⑨芥菜采收后用4%食盐水浸泡2 h，晾干表面水分，记为TG8；所有晒干环节都是在18 ℃左右晴朗天气，日晒8 h。芥菜预处理后，按芥菜质量添加6%的食盐，拌匀，入坛腌制，常温自然发酵25 d。
1.3.2 分析检测
（1）理化指标
水分含量：参照国标GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中的第一法进行测定；pH值：采用pH计测定；总酸含量：参照GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法进行测定；氨基酸态氮含量：参照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》中的酸度滴定法进行测定；亚硝酸盐含量：参照GB/T 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的紫外分光光度法进行测定。
（2）颜色参数测定
分别取预处理芥菜和发酵25 d的芥菜，利用分光测色仪测定华容大叶芥菜叶色泽，随机选取叶片测量点，读取明亮度L*值，红绿度a*值，黄蓝度b*值，每种样品测3组平行，每组重复测定6次，取平均值。并计算色差（ΔE）值，其计算公式如下：
式中：ΔE为色差值；L*值、a*值、b*值分别为明亮度、红绿度和黄蓝度指数，L0值、a0值、b0值是空白组（CK）芥菜发酵25 d时的明亮度、红绿度和黄蓝度指数。
（3）质构测定
取发酵25 d的芥菜，修剪为2 cm×3 cm的条状菜柄进行全质构剖面分析（texture profile analysis，TPA）测试。采用P/2探头，参数设置为测前速度1.00 mm/s，测试速度0.5 mm/s，测后上行速度1.0 mm/s，两次压缩间隔时间5 s，形变量60%，触发力0.1 N。测定指标包括硬度、弹性、破裂力、黏附性、内聚性及咀嚼性。每组样品进行6次测定。
（4）挥发性风味物质测定
取发酵25 d的芥菜，采用顶空固相萃取（headspace solid phase extraction，HS-SPME）气相色谱-质谱联用（GC-MS）法测定其挥发性风味物质。
HS-SPME：取打碎的泡菜2.5 g直接置于20 mL的顶空进样瓶中，并加入质量浓度为0.2 μg/μL的1,3-二氯苯内标5 μL，密封并拧紧瓶盖。50 ℃条件下平衡20 min后，将萃取头插入进样瓶吸附20 min后取出萃取头插入到气相色谱仪进样口，推出纤维头，250 ℃解吸附5 min。
GC条件：Rtx-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气（He），流速为1.0 mL/min，不分流进样。升温程序为起始温度40 ℃，保持3 min；以3 ℃/min升至70 ℃；继续以5 ℃/min升至130 ℃；再以6 ℃/min升至160 ℃；最后以10 ℃/min上升至250 ℃。
MS条件：接口温度250 ℃，电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度250 ℃，扫描范围40～350 m/z。
定性分析：将试验所得的挥发性风味物质的总离子流色谱图与美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）17s、NIST17-1和NIST17-2谱库相匹配，取匹配度＞80的化合物[9]。
定量分析：按参考文献[10]的方法，根据内标1,3-二氯苯含量及峰面积对挥发性风味物质进行定量分析，其计算公式如下：
式中：Cx为待测化合物含量，μg/kg；C0为内标物质量浓度，μg/μL；V0为内标物进样体积，μL；Sx为待测化合物的峰面积；S0为内标物峰面积；m为样品取样质量，kg。
（5）感官评价
取发酵25 d的芥菜，选10名经过培训的评价员根据发酵芥菜感官评分标准进行感官评定，满分100分，发酵芥菜感官评分标准见表1。
表1 发酵芥菜感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of fermented mustard
项目 18～25分评分标准9～17分 0～8分色泽香气口味质地整体为黄褐色，菜帮为微黄色，有光泽，汤汁清澈，无霉花浮沫具有发酵醇香，无酸败腐臭味酸度适中，无苦涩味，咸度适宜菜质脆爽，硬度好整体为黄褐色或褐色，不发暗或稍暗，无光泽，汤汁略显浑浊醇香味较弱，稍弱腐臭味酸度较强或较弱，有较弱苦涩味，咸度稍咸或稍淡菜质较脆，略显绵软菜帮发暗，菜叶为深褐色，汤汁浑浊无清香味，腐臭味严重酸度过强或很淡，苦涩味重，过咸或过淡不脆，绵软
1.3.3 数据处理
每个样品进行3 次重复，试验数据以“平均值±标准差”表示，Microsoft Excel 2019软件对数据进行整理，采用GraphPad Prism 9.0、SPSS 16.0进行数据分析，用Origin 9.5软件、Hiplot pro1.0软件进行绘图和显著性分析，P＜0.05表示差异显著。
新鲜芥菜经预处理后，腌制前的水分含量测定结果见图1。由图1可知，不同预处理方式对腌制前芥菜的水分含量有一定的影响，与对照组相比，各预处理组芥菜含水量均有显著性下降，表明预处理组芥菜的脱水程度均高于对照组；用蒸汽热烫（TG1）、沸水热烫（TG2）和水洗后晒至叶片萎蔫（TG6）的芥菜其含水量接近，水分含量相对较高，仅低于对照组；沸水热烫结合日晒（TG3）、直接日晒（TG5）和4%食盐水浸泡（TG8）的芥菜其含水量接近，水分含量相对较低；蒸汽热烫结合日晒（TG4）和4%食盐水浸泡结合日晒（TG7）的芥菜其含水量接近，水分含量是各预处理组中最低的。腌制前芥菜水分含量的高低对发酵过程和产品质量有一定的影响，可为后续研究提供依据。
图1 不同预处理方式对新鲜芥菜水分含量的影响
Fig.1 Effect of different pretreatment methods on the moisture contents of fresh mustard
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
不同预处理后方式对发酵芥菜pH值与总酸含量的影响结果见图2。
图2 不同预处理方式对芥菜发酵过程中pH值（A）与总酸含量（B）的影响
Fig.2 Effect of different pretreatment methods on pH (A) and total
acid contents (B) of mustard during fermentation process
由图2A可知，TG1和TG4预处理芥菜的初始pH值为4.7左右，其他各预处理组芥菜的初始pH值大多在5.25以上。发酵的初期（0～10 d），TG4、CK、TG2、TG4的pH值下降速率较快，TG3、TG5、TG8的pH值下降速率相对较慢，TG6、TG7的pH值下降速率明显低于其他试验组，可能是因为盐水浸泡或水洗减少了芥菜表面的乳酸菌，且通过晒干，芥菜的水分含量降低，使发酵启动较慢。发酵至第15 天时，各组pH值基本降至4.0以下。发酵后期（15～25 d），pH值下降趋于缓和，pH值在3.5左右保持相对稳定。这一现象与发酵过程中微生物的代谢活性逐渐降低有关，随着发酵环境酸度的增加，乳酸菌的增殖受到抑制，有机酸的生成速率降低，因此pH值趋于平稳。
总酸不仅是发酵蔬菜重要生产指标，也是其判断其成熟度的重要参数[11]。pH值的降低与总酸含量的增加具有密切的相关性，与pH值下降相对应的是总酸含量的逐渐上升。在发酵初期，微生物代谢活跃，乳酸等酸性代谢物的生成是引起pH值降低的主要原因。随着发酵的进行，尽管pH值趋于稳定，但总酸含量仍在缓慢增加，反映出发酵后期有机酸的积累主要影响发酵产品的风味和品质。
由图2B可知，各试验组芥菜发酵过程中总酸含量均呈上升趋势。发酵初期（0～10 d），TG4、CK、TG1总酸含量增长速率明显高于其他试验组，TG4和TG1均为蒸汽热烫处理组，导致细胞结构破坏，营养物质易于被乳酸菌利用，CK组因水分含量较高，有利于乳酸菌繁殖；发酵后期（15～25 d），TG4、CK、TG1总酸含量的增长速率变得平缓，而其他试验组的总酸含量增长速率加快。发酵结束时，TG5、TG4、TG8试验组总酸含量较高，分别达到22.82 g/kg、21.33 g/kg和19.98 g/kg。所有试验组的总酸含量均高于20 g/kg。
总酸含量的增长速率高、pH值下降速率快都表明发酵速度快，因此，TG4、CK、TG1可能具有较高的酸化性能，更短的酸化过程可以加速发酵蔬菜生产，减少发酵时间，有利于降低生产成本[12]。
氨基酸态氮含量直接影响发酵食品的风味和营养价值[13]。经不同预处理方式对芥菜氨基酸态氮含量影响结果见图3。
图3 不同预处理方式对发酵芥菜氨基酸态氮含量的影响
Fig.3 Effect of different pretreatment methods on amino acid nitrogen contents of fermented mustard
由图3可知，不同发酵芥菜组别的氨基酸态氮含量存在差别，但无显著性差异（P＞0.05）。其中TG4、TG6和TG8试验组的氨基酸态氮含量相对较高，分别为0.313 g/100 g、0.301 g/100 g和0.283 g/100 g，表明其发酵过程中蛋白质的降解程度较为充分，生成了更多的氨基酸，从而提升了产品的风味和品质。从氨基酸态氮含量测定结果可见，TG4、TG6和TG8试验组的发酵蔬菜品质较优。
亚硝酸盐含量是含量发酵芥菜工艺合理性的重要指标[14]，对不同预处理的发酵芥菜样品检测其亚硝酸含量很有必要。不同预处理方式对发酵芥菜亚硝酸盐含量的影响结果见图4。由图4可知，对照组发酵芥菜中亚硝酸盐含量为0.0292 mg/kg，显著高于各预处理组（P＜0.05），所有试验组发酵芥菜中的亚硝酸盐含量均＜0.02 mg/kg，均远低于国标GB 2762—2022《食品安全国家标准食品中污染物限量》中规定的亚硝酸盐含量的限量值（20 mg/kg），表明所有试验组芥菜经发酵后均是安全的。
图4 不同预处理方式对发酵芥菜亚硝酸盐含量的影响
Fig.4 Effect of different pretreatment methods on nitrite contents of fermented mustard
良好的色泽对品质提升有积极的影响[15]。不同预处理方式对发酵芥菜的颜色参数（L*值、a*值、b*值和ΔE值）的影响结果见图5。
图5 不同预处理方式对发酵芥菜颜色参数的影响
Fig.5 Effect of different pretreatment methods on color parameters of fermented mustard
由图5a可知，与CK组相比，各预处理组发酵芥菜的色度值均表现出一定的差异性。具体而言，TG1组的L*值显著高于CK（P＜0.05），TG2、TG3、TG4组的L*值与CK组无显著差异（P＞0.05），TG5、TG6、TG7、TG8组的L*值显著低于CK组（P＜0.05）。CK组L*值较高可能是因为未经复杂预处理，色素和组织结构保持完整；TG1经蒸汽漂烫破坏了酶的活性以致保持了较好的亮度，而TG5-TG8的日晒与盐水处理破坏了芥菜组织结构的完整性，显著降低了亮度。不同预处理方式对发酵芥菜亮度的影响显示了预处理步骤对产品颜色的调控作用。合理选择预处理方式，可根据目标产品需求调整亮度及视觉品质。整体而言，除TG1以外，CK组发酵芥菜的整体亮度较预处理组稍优，即颜色较为明亮。
芥菜在发酵过程中容易出现失绿、褐变等问题[15]。a*值代表红绿色，a*值为正，颜色偏红，为负则偏绿。由图5b可知，TG1、TG2、TG6组和CK组的a*值均为正值，且TG2组和CK组的a*值基本一致（P＞0.05），其他试验组的a*值均为负值，且显著低于CK组（P＜0.05）。CK组是未经任何预处理的芥菜直接腌制发酵，而TG2组经过了沸水漂烫2 min后直接冷却并沥干用于发酵，漂烫处理可以通过灭酶作用（如多酚氧化酶和过氧化物酶的失活）减少色素氧化，同时短时间的漂烫不会显著改变色素组成，因此TG2组和CK组的a*值基本一致，但是沸水漂烫可能破坏叶绿素结构，导致脱绿现象。其他试验组（TG1、TG3～TG8）在预处理过程中经过了日晒、盐水浸泡等处理，原料含水量较低，发酵后a*值受到了显著影响。表明预处理工艺有助于芥菜保持绿色，能有效防止芥菜发酵过程中发生褐变。TG7、TG8、TG3的护绿效果较好。
发酵芥菜黄绿色（b*值）是由叶绿素和类胡萝卜素的降解产物所产生的，在传统发酵芥菜的生产过程中，随着发酵的深入，黄绿色（b*值）往往会升高。但b*值过高，黄色调过于强烈，意味着叶绿素被大量降解。由图5c可知，TG2、TG6试验组发酵芥菜的b*值明显高于CK组，TG7、TG8试验组发酵芥菜的b*值明显低于CK组（P＜0.05）。因为TG2和TG6试验组原料分别经过了沸水漂烫和日晒处理，加速了叶绿素的破坏，加之发酵过程产生的有机酸的作用，所以发酵产品b*值较高；TG7、TG8试验组原料经盐水浸泡处理可能降低了芥菜组织中的酶活性，特别是多酚氧化酶的活性，从而抑制了酶促褐变反应的发生。从b*值的结果来看，TG7、TG8试验组发酵芥菜具有较为理想的颜色。
色差值（ΔE）是评估样品色度变化的重要指标。由图5d可知，以CK组发酵芥菜为基准，各试验组发酵芥菜的ΔE值存在显著差异，其中TG5、TG7、TG8试验组发酵芥菜的ΔE值相对较高，说明与CK组相比，其色差较大，结合感官评价结果，TG5、TG7、TG8试验组发酵芥菜表现出较好的色泽，优于其他试验组发酵芥菜。色差的产生主要受发酵过程中的色素降解、酶促反应、pH变化和微生物代谢活动的共同影响。
综上所述，TG7、TG8试验组发酵芥菜的L*值、a*值、b*值和ΔE值综合表现优于其他试验组和CK发酵芥菜，证明新鲜芥菜采用盐水浸泡并适度脱水的预处理方法（TG7、TG8）有助于提升发酵芥菜的外观品质。
质构分析可以消除评价人员对评价结果引入的主观误差，具有方便、快捷、可量化的优点[16]。不用预处理方式对发酵芥菜质构特性的影响见表2。由表2可知，除脆度外，各试验组发酵芥菜的其他质构指标均无显著性差异（P＞0.05），为了整体分析预处理方法对发酵芥菜质构特性的影响，对各试验组发酵芥菜的相关质构指标进行主成分分析（PCA），结果见表3。
表2 不同预处理方式对发酵芥菜质构特性的影响
Table 2 Effect of different pretreatment methods on texture characteristics of fermented mustard
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
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表3 不同预处理方式发酵芥菜质构特性的主成分载荷矩阵
Table 3 Principal component load matrix of texture characteristics of fermented mustard with different pretreatment methods
指标咀嚼性胶着性黏聚性弹性胶黏性回复性脆度硬度特征值方差贡献率/%累计方差贡献率/%主成分1 2 0.927 0.871 0.861 0.823 0.801 0.727-0.278-0.194 4.322 54.023 54.023-0.256-0.474 0.183 0.263 0.489-0.066 0.771-0.759 1.808 22.601 76.624
由表3可知，发酵芥菜的质构特性有两个主成分，其特征值分别为4.322和1.808，方差贡献率分别为54.023%和22.601%，两个主成分累计方差贡献率为76.624%，基本反映了芥菜质地品质的绝大部分信息，具备良好的质地品质信息代表性。第1主成分的咀嚼性、胶着性、黏聚性、弹性、胶黏性、回复性权重较大。第1主成分的咀嚼性、胶着性、黏聚性、胶黏性等4个质地指标均为质构仪下压过程中所呈现出的指标，芥菜的咀嚼性越大，其胶着性、黏聚性、胶黏性越大，可称之为适口性因子，对芥菜质地表征具有重要的意义。第2主成分脆度正向权重值最大，硬度负向权重最大。
对各试验组发酵芥菜质地品质综合评价。通过主成分分析，计算出主成分分析得分系数，建立了两个主成分表达式如下：
其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8分别代表咀嚼性、胶着性、黏聚性、弹性、胶黏性、回复性、脆度、硬度的标准化值，Y1表示第一主成分得分，Y2表示第二主成分得分。将不同预处理的发酵芥菜对应的质地指标带入以上两个公式，得到发酵芥菜主成分的综合得分，建立了芥菜质地品质评价模型：Y=0.540×Y1+0.226×Y2，通过模型计算出各预处理组发酵芥菜的综合得分，其得分与排名见表4。由表4可知，综合得分较高的3个试验组分别是TG8、TG7、TG1，其结果说明从质构特性来看，TG8、TG7、TG1处理方式较佳。
表4 不同预处理方式发酵芥菜质构综合得分
Table 4 Comprehensive scores of texture of fermented mustard with different pretreatment methods
预处理方式 Y1 Y2 Y 排名CK TG1 TG2 TG3 TG4 TG5 TG6 TG7 TG8-0.14 1-1.03-1.75 1.52-3.46-0.98 1.34 3.51-1.92 1.77 0.15 1.30-1.33-0.98 0.24 1.57-0.81-0.51 0.94-0.52-0.65 0.52-2.09-0.48 1.08 1.71 6 3 7 8 4 9 5 2 1
2.7.1 挥发性风味物质分析
为研究预处理方式对发酵芥菜香气特征的影响，利用顶空固相微萃取（HS-SPME）与气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析各试验组发酵芥菜样品的香气成分种类及含量，结果见图6。由图6A可知，9组发酵芥菜样品共鉴定出109种挥发性风味化合物。其中，CK和TG1～TG8分别检测出68种、77种、73种、79种、76种、68种、83种、74种和80种挥发性风味化合物，包含烃类、异硫氰酸酯类、酯类、醛类、醇类、酮类、酸类、腈类、杂环类、硫类和其他类。
图6 不同预处理方式对发酵芥菜中各类别挥发性风味物质数量（a）及含量（b）的影响
Fig.6 Effects of different pretreatment methods on quantities (a) and contents (b) of various volatile flavor components in fermented mustard with different pretreatment methods
由图6B可知，不同预处理组发酵芥菜的挥发性风味物质总含量差异较大，其中TG8发酵芥菜挥发性风味物质的总含量最高，达261 428.21 μg/kg，TG6发酵芥菜挥发性风味物质的总含量最低，仅为78 967.51 μg/kg，其他试验组发酵芥菜风味物质总含量从高到低的顺序为TG5、TG3、TG7、TG1、CK、TG2、TG3。发酵芥菜中异硫氰酸酯类、酯类、醇类浓度较高，为主要挥发性风味物质，这与李子怡等[17]对大叶芥菜中主要挥发性风味物质的研究结果一致。
烃类物质虽然普遍存在，但其对整体香气的贡献率相对较低[18]。异硫氰酸烯酯类是十字花科蔬菜及其加工产品的特征风味成分，具有芳香味和辛辣味[19]，各组预处理组发酵芥菜中均含有一定大量的异硫氰酸酯类。其中，TG8发酵芥菜中异硫氰酯类含量最高，为80 487.65 μg/kg，赋予了其浓郁的特征风味。
主要是由发酵体系中原料成分、乳酸菌发酵产物、代谢产物相互作用产生的[20-21]。风味物质的呈味不仅与挥发性含量有关，而且与挥发性物质的风味阈值有关，短链的酯类化合物具有极低的阈值（10-9级），感知极为灵敏，能够赋予发酵芥菜特殊的酯香，具有较大的风味贡献潜力[22]。因此，酯类物质为发酵芥菜的主要风味呈味物质。9组发酵芥菜样品共检出了12种酯类物质，TG2和TG8发酵芥菜中酯类总含量较高，分别为27 960.72 μg/kg和25 741.26 μg/kg。
醛类物质在发酵芥菜的香气中起到了重要作用，是形成其特有风味的关键成分之一[23-24]。醛类化合物具有较低的嗅觉阈值，常常能够以微量就产生显著的香气效果。由于其分子结构中含有活泼的碳氧双键，醛类物质具有独特的挥发性和芳香特性，能够赋予食品鲜明的香气特征，如果香、草香、花香等。在发酵过程中，醛类物质主要通过脂肪酸降解、氨基酸代谢及糖类转化等途径生成[25]。常见的醛类物质包括己醛、壬醛和2-甲基丁醛等，它们是脂肪酸降解的产物，能够赋予芥菜清新、微甜或草本香气。此外，醛类化合物还可能来源于芥菜在发酵过程中细胞壁成分的分解，特别是脂类与蛋白质的降解产物，它们共同参与了芥菜风味的形成。9组发酵芥菜样品中，TG5和TG8发酵芥菜中醛类物质总含量较高，分别为10 561.44 μg/kg和4 474.33 μg/kg。
9组发酵芥菜样品中的挥发性风味物质中都含有一定量的醇类物质，发酵芥菜样中的醇类物质一部分源于芥菜本身所含有的乳酸菌进行的异型乳酸发酵，另一部分是因为芥菜本身或者发酵环境中的酵母菌发酵产生了部分乙醇[26-28]。醇类本身具有清香、花香等气味，但其风味阈值较大，含量较小的情况下对发酵芥菜的风味影响很小。但是，醇类的存在对酯类、醛类等成分产生不可或缺，是芥菜发酵过程中不可或缺的成分。9组发酵芥菜样品中，TG8和TG5发酵芥菜中醇类物质总含量较高，分别为125 293.5 μg/kg和127 358.92 μg/kg。
腈类物质的存在与新鲜芥菜本身有关，同时也与化合物水解有关[29]。酯类物质中一些特殊物质特别是异硫氰酸酯类会慢慢转化为腈类风味物质，均为发酵芥菜重要的风味化合物[30-31]。9组发酵芥菜样品中，均检出了腈类物质中的苯代丙腈，TG8和TG5发酵芥菜中含量较高，分别为7 560.34 μg/kg和7 248.06 μg/kg。腈类化合物具有强烈的香气，类似于相应的醛，但比醛更尖辛和更强烈。为发酵蔬菜的重要风味化合物，这与李文青等[32]的研究结果相似。
酸类物质、酮类物质和其他化合物在发酵样品中含量相对较少，有的样品甚至未检出，这与大多数泡菜的研究结果一致[33-34]。酸类物质多为有机酸，挥发性酸含量较少。酮类化合物是微生物代谢产物，其风味独特，感知阈值低，在后熟过程的进一步反应中会形成相应的酸和醇。
2.7.2 基于挥发性风味物质的OPLS-DA
以9组发酵芥菜样品中110个共有香气组分作为因变量，不同发酵芥菜样品作为自变量，构建OPLS-DA模型，并进行200次置换检验，结果见图7。由图7A可知，OPLS-DA可以实现对不同预处理方式发酵芥菜样品的有效区分。由图7B可知，经过200次置换检验，经分析自变量拟合指数R2X为0.979，因变量拟合指数R2Y为0.996；模型预测能力Q2为0.99，R2和Q2超过0.5表示模型拟合结果可接受。Q2回归线与纵轴的相交点＜0，说明模型对数据未过拟合，模型验证有效，表明OPLS-DA可用于不同预处理方法发酵芥菜的鉴别分析。
图7 不同预处理方式发酵芥菜挥发性风味成分正交偏最小二乘-判别分析（A）及置换检验结果（B）
Fig.7 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis (A) and permutation test results (B) of volatile flavor components of fermented mustard with different pretreatment methods
2.7.3 差异挥发性风味化合物筛选
根据各预处理组发酵芥菜香气组分OPLS-DA分析的VIP值，可以进一步分析不同香气成分对各预处理组发酵芥菜香气的贡献率，根据VIP值＞1的标准，不同预处理发酵芥菜筛选出45种差异挥发性风味化合物，其中烃类13种、醛类7种、醇类10种、酮类5种、酯类7种、腈类2种和酸类1种。将这45种香气物质进行聚类分析并绘制热图见图8。由图8可知，不同预处理发酵芥菜样品中挥发性风味成分的相对含量分布，以颜色深浅来指示每个挥发性物质在不同样品中的含量变化。颜色从蓝色（含量较低）到红色（含量较高）依次递增，清晰反映了各样品中挥发性风味成分的差异。
图8 不同预处理方式发酵芥菜的差异挥发性风味化合物聚类分析热图
Fig.8 Heat map of cluster analysis of differential volatile flavor components of fermented mustard with different pretreatment methods
由图8可知，从整体色彩分布来看，TG7、TG8、TG4、TG2发酵芥菜中的多种挥发性成分出现在红色区域，表明其含量较高，特别是正辛醛、α-蒎烯、异硫氰酸烯丙酯等。这些挥发性成分通常与发酵芥菜的特征香气和风味直接相关，赋予了发酵芥菜更好的感官品质。但CK和TG5发酵芥菜中的多种挥发性成分出现在蓝色区域，说明其含量较低。如柠檬烯、β-蒎烯、异硫氰酸烯丙酯等含量较低，导致其香气和风味不如其他组发酵芥菜丰富和多样，其整体风味较差。
不同预处理方式对发酵芥菜的颜色、香气、口味、质地的感官评分结果见表5。由表5可知，感官评分从高到低依次为TG8、TG7、TG1、TG4、CK、TG6、TG3、TG2、TG5。其中TG8预处理组发酵芥菜的感官评分为92分，品质最好。
表5 不同预处理方式发酵芥菜感官评分结果
Table 5 Sensory evaluation results of fermented mustard with different pretreatment methods
预处理方法 颜色 香气 口味 质地 总分 排名CK TG1 TG2 TG3 TG4 TG5 TG6 TG7 TG8 18 22 19 15 21 16 18 22 24 21 23 16 17 22 18 20 24 23 22 17 18 20 20 19 19 20 22 18 23 21 24 19 21 20 24 23 79 85 74 76 82 74 77 90 92 5 3 8 7 4 8 6 2 1
新鲜芥菜预处理较优方式为用4%盐水浸泡2 h后，自然晾干表面水分（晾8 h，水分含量83.3%），其自然发酵芥菜产品的总酸含量为19.98 g/kg，氨基酸态氮含量为0.283 g/100 g，L*值、a*值、b*值和色差值分别为36.07、-0.27、4.70、4.21，质构综合得分为1.71分，感官评分为92分；亚硝酸盐含量为0.014 3 mg/kg，远远低于国家限量标准（20 mg/kg）。不同预处理的发酵芥菜样品中共检出74种挥发性风味物质，其中醇类15种，酚类1种，酮类2种，醛类12种，腈类3种，酯类7种，异硫氰酸酯类4种，烃类29种，其他类1种。经OPLS-DA可区分不同预处理组发酵芥菜，以VIP值＞1为标准，筛选出45种差异挥发性风味化合物，其中烃类13种、醛类7种、醇类10种、酮类5种、酯类7种、腈类2种和酸类1种。此预处理方式可以考虑在腌制芥菜加工中推广应用。
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