表1 青川黄酒糖化培菌工艺优化Box-Benhnken响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken response surface tests for saccharification culture technology optimization of Qingchuan Huangjiu
因素A 大竹小曲添加量/%B 糖化培菌温度/℃C 糖化培菌时间/h-1水平0 1 0.8 26 48 1.0 28 60 1.2 30 72
Optimization of saccharification culture process and analysis of volatile flavor components of Qingchuan Huangjiu
咂酒是我国西南地区极具特色的一种酒类饮品，是羌族、土家族重要的民族文化载体[1]。咂酒具有独特的饮用方式，通常使用芦管、藤管或竹管等工具，将其斜插入酒坛中进行吸饮，这里的“咂”字，实际上就是代表吸饮的动作，因此得名咂酒[2]。在制作传统咂酒时，主要运用固态发酵工艺，原料以青稞、小麦和大麦为主，经过蒸煮、冷却、拌入酒曲等一系列工序后，密封坛子发酵数日，待发酵完成，再加入温开水浸泡便可直接饮用[3]。随着西南地区地理、人文环境的不断变化，青稞、小麦等酿酒原料种植地环境也不断变化，导致传统咂酒的产量减少，再加上酿酒工业现代化的不断发展，掌握传统酿造核心技艺的人越来越少，对传统酿造工艺的保护和传承造成了很大的影响[4]。
青川黄酒是以玉米为原料的一类咂酒，是青川部分农村地区的主要饮品，因其酒体色黄，故名“黄酒”，其具有口感协调，色泽亮黄，香气浓郁的特点[5]。目前，青川黄酒的酿造以农户手工为主，大部分采用本地种植的非糯玉米为原料，市场购买的酒曲为发酵剂，缺乏统一的酿造标准，导致产品口感千差万别，不利于青川黄酒的工业化生产和品质提升[6]。
本研究采用传统酿造工艺制备青川黄酒，首先在黄糯玉米、紫糯玉米、白糯玉米3种原料和大竹小曲、华西小曲、安琪甜酒曲3种酒曲中进行筛选，确定发酵原料和酒曲，在此基础上，以青川黄酒的感官评分为响应值，采用单因素及Box-Benhnken响应面试验对青川黄酒的糖化培菌工艺进行优化，并对青川黄酒的理化及挥发性风味物质进行分析，以期为青川黄酒的品质提升和标准制定提供一定理论参考，同时为其工业化生产提供更多的思路，为青川黄酒的传承与创新注入新的活力。
1.1.1 材料
黄糯玉米（H）、紫糯玉米（Z）、白糯玉米（B）：产于四川青川地区，市售；大竹小曲（1）：达州市大竹县；华西小曲（2）：彭州市华西酒曲厂；安琪甜酒曲（3）：宜昌市安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 试剂
氢氧化钠、硫酸、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、甲醛（均为分析纯）：重庆川东化工试剂厂；葡萄糖（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。其他试剂均为分析纯或生化试剂。
PHSJ-3F型pH计：上海雷磁仪电科学仪器股份有限公司；ZC-JJ04型酒精计：北京哲成科技有限公司；890N-5975B型气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪：美国Agilent科技有限公司。
1.3.1 青川黄酒的工艺流程及操作要点[7]
糯玉米→炒制→蒸煮→冷却→拌曲→糖化培菌→装桶发酵→冲泡浸提→过滤→灭菌→成品操作要点：
原料炒制：将无霉变的糯玉米粒清洗干净，倒入铁锅内用慢火炒至见黑（6～8 min），一部分成玉米花为宜。
蒸煮：将炒好的玉米粒用清水冲洗干净，放入锅内加水煮40～50 min，至部分开裂可食用为止。
冷却：将煮熟的玉米粒平摊放置，冷却至室温。
拌曲：按冷却后的玉米粒质量精确量取1.0%的酒曲，将加入冷却处理后的玉米粒中，充分混合。
糖化培菌：将混合物置入盘中，置于恒温26 ℃的培养箱中培养48 h。
装桶发酵：糖化培菌结束后装入发酵桶（发酵桶容积12 L，装料量1 000 g）中26 ℃继续发酵7 d。
冲泡浸提：将装瓶发酵后的玉米粒取出，按照料液比1∶3（g∶mL）加入开水浸泡，1～2 h后进行过滤。
灭菌：65～75 ℃水浴灭菌30 min，即得青川黄酒成品。
1.3.2 青川黄酒糖化培菌工艺优化
（1）原料与酒曲的筛选
在1.3.1的基础上，将3种原料（H、Z、B）分别与3种酒曲（1、2、3）进行两两组合发酵制备青川黄酒，以基本理化指标和感官评分为评价指标，筛选出最佳原料与酒曲。
（2）单因素试验
确定最佳原料与酒曲后，以酒精度和感官评分为评价指标，分别考察大竹小曲添加量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、糖化培菌温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、糖化培菌时间（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）对青川黄酒品质的影响。
（3）Box-Benhnken响应面试验
基于单因素试验结果，以感官评分（Y）为响应值，大竹小曲添加量（A）、糖化培菌温度（B）和糖化培菌时间（C）3个因素为自变量，采用Design Expert 13.0软件设计3因素3水平的Box-Benhnken响应面试验，试验因素与水平见表1。
表1 青川黄酒糖化培菌工艺优化Box-Benhnken响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken response surface tests for saccharification culture technology optimization of Qingchuan Huangjiu
因素A 大竹小曲添加量/%B 糖化培菌温度/℃C 糖化培菌时间/h-1水平0 1 0.8 26 48 1.0 28 60 1.2 30 72
1.3.3 基本理化指标的测定
总酸（以乳酸计）、总糖、酒精度、氨基酸态氮和pH的测定：参考GB/T 13662—2018《黄酒》。
1.3.4 感官评价
感官评价参照罗优等[8]方法并做修改，具体如下：选取10名经过专业培训的评审员组成评估小组，对青川黄酒进行感官评价，评价维度涵盖了色泽、香味、口感及整体风味，最终选取四个项目的总分作为综合评分，满分100分，具体感官评价标准见表2。
表2 青川黄酒的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Qingchuan Huangjiu
项目 评价标准 得分/分色泽（20分）色泽鲜明亮黄，有黄酒典型的色泽特质色泽微黄，无沉淀较浑浊，光泽暗淡18～20 15～18 10～15
续表
项目 评价标准 得分/分香味（30分）口感（40分）风味（10分）酒香浓厚雅致，香气均衡酒香纯净，无异香酒香淡薄，略有异香酒体丰满，口感醇厚、爽口酒体较丰满，口感较醇厚酒体略酸，口感欠佳具有青川黄酒特有风格，色、香、味协调风格不突出，较协调风格有偏差25～30 15～25 10～15 35～40 20～35 10～20 8～10 5～8 1～5
1.3.5 挥发性风味物质测定
挥发性风味物质的测定参照罗优等[8]的顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合GC-MS法并加以修改。
顶空固相微萃取：精确量取5 mL黄酒样品于15 mL顶空瓶中，使用聚四氟乙烯瓶盖密封，平衡5 min。将PDMS萃取头插入顶空瓶中，并推出纤维头，在恒温50 ℃的条件下萃取30 min。将萃取头插入GC-MS的进样口，在250 ℃解吸5 min。
气相色谱条件：DB-5MS石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（纯度99.999%），流速1.2 mL/min；进样口温度250 ℃；升温程序为35 ℃持续2 min，然后以3 ℃/min升至70 ℃，再以6 ℃/min升至140 ℃，最后以15 ℃/min升至220 ℃保持3 min。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；扫描范围33～350 m/z。
定性定量方法：依据母离子的特征信息，借助美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）提供的MS Search 2.3数据库，对物质进行准确的识别与鉴定。采用峰面积归一化法对各挥发性风味成分进行定量分析。
1.3.6 数据处理
每个试验重复3次，采用SPSS 26.0、Origin 2021和Design Expert 13.0处理数据并绘图，结果用“平均值±标准差”表示。
不同原料及酒曲组合发酵青川黄酒的理化指标和感官评分见表3。由表3可知，H-1组青川黄酒的总酸含量为6.35 g/L，总糖含量为7.77 g/L，酒精度为11.82%vol，氨基酸态氮含量为0.21 g/L，感官评分为91.1分，均显著高于其他组别（P＜0.05），pH值为3.61，符合GB/T 13662—2018《黄酒》标准。分析原因可能是，黄糯玉米中含有更高含量的支链淀粉，加入大竹小曲后能够更好的进行发酵反应[9]。因此，确定最佳原料为黄糯玉米，最佳酒曲为大竹小曲。
表3 不同原料及酒曲发酵青川黄酒的理化指标及感官评分
Table 3 Physicochemical indexes and sensory score of Qingchuan Huangjiu fermented by different raw materials and Jiuqu
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
组合 总酸含量/（g·L-1） 总糖含量/（g·L-1） 酒精度/%vol 氨基酸态氮含量/（g·L-1） pH值 感官评分/分H-1 H-2 H-3 Z-1 Z-2 Z-3 B-1 B-2 B-3 6.35±0.05a 6.28±0.02b 5.98±0.04c 5.86±0.02d 5.02±0.03f 4.66±0.02i 5.08±0.01e 4.97±0.04g 4.73±0.01h 7.77±0.04a 6.27±0.02d 6.25±0.03de 7.33±0.01c 6.26±0.01de 6.24±0.02e 7.46±0.02b 6.26±0.03e 6.18±0.01f 11.82±0.33a 9.84±0.12e 8.06±0.11f 11.27±0.22c 9.85±0.14e 9.81±0.13e 11.62±0.32b 10.67±0.15d 10.63±0.14d 0.21±0.02a 0.16±0.03e 0.17±0.02d 0.16±0.01e 0.18±0.04c 0.19±0.03b 0.20±0.05a 0.17±0.03d 0.18±0.02c 3.61±0.02f 3.57±0.03g 3.88±0.02d 3.66±0.01f 3.72±0.04e 4.60±0.02a 3.84±0.05d 4.01±0.03c 4.58±0.03b 91.1±1.06a 78.4±0.19e 71.3±0.08g 84.5±0.11c 72.6±0.12f 80.2±0.11d 87.4±0.10b 69.3±0.18h 66.7±0.09i
2.2.1 大竹小曲添加量的确定
大竹小曲添加量对青川黄酒酒精度和感官评分的影响见图1。由图1可知，当大竹小曲添加量为0.6%～1.0%时，随着大竹小曲添加量的升高，酒精度和感官评分逐渐上升；当大竹小曲添加量为1.0%时，酒精度和感官评分均达到最高，分别为11.85%vol和91.14分；当大竹小曲添加量为1.0%～1.4%时，随着大竹小曲添加量的升高，酒精度和感官评分逐渐降低。分析原因可能是，大竹小曲添加量较低时，减缓发酵速度，导致发酵时间延长，进而导致酒精度较低，发酵结束后产品风味口感不佳，感官评分低；当大竹小曲添加量逐渐上升时，加速了玉米淀粉的水解过程，使其更快地转化为小分子糖类，由于这些糖类为酒精的产生提供了丰富的碳源，因此酒精度也随之上升且风味逐渐丰富；当大竹小曲添加量过高时，发酵速度过快、中心温度过高，导致酒精度和感官评分也随之下降[10-11]。综合考虑，确定最佳大竹小曲添加量为1.0%。
图1 大竹小曲添加量对青川黄酒酒精度和感官评分的影响
Fig.1 Effects of Dazhu Xiaoqu addition on alcohol content and sensory score of Qingchuan Huangjiu
2.2.2 糖化培菌温度的确定
糖化培菌温度对青川黄酒酒精度和感官评分的影响见图2。由图2可知，当糖化培菌温度为24～28 ℃时，随着温度的升高，酒精度和感官评分逐渐上升；当糖化培菌温度为28 ℃时，酒精度和感官评分达到最高，分别为11.93%vol和92.02分；当糖化培菌温度为28～32 ℃时，随着温度的升高，酒精度和感官评分逐渐降低。分析原因可能是，糖化培菌温度过低时，发酵体系容易受到杂菌的污染，杂菌快速生长繁殖挤占了酵母菌的生存空间，抢夺了酵母菌的生存要素，进而导致整个发酵体系发酵不充分，因此，酒精度偏低和风味口感较差[12]；糖化培菌温度过高时，酵母过早衰老，从而降低其后续发酵能力，糖分无法得到充分转化和利用，因此，在发酵后期，容易出现酸败现象，进一步影响黄酒的品质[13]。综合考虑，确定最佳糖化培菌温度为28 ℃。
图2 糖化培菌温度对青川黄酒酒精度和感官评分的影响
Fig.2 Effect of saccharification culture temperature on alcohol content and sensory score of Qingchuan Huangjiu
2.2.3 糖化培菌时间的确定
糖化培菌时间对青川黄酒酒精度和感官评分的影响见图3。由图3可知，当糖化培菌时间为24～60 h时，随着时间的延长，酒精度和感官评分逐渐上升；当糖化培菌时间为60 h时，酒精度和感官评分达到最高，分别为12.11%vol和92.20分；当糖化培菌时间为60～72 h时，随着时间的延长，酒精度和感官评分逐渐降低。分析原因可能是，糖化培菌时间过短时，由于大竹小曲中的酵母菌生长时间短，代谢产物没有得到完全释放，致使酒精度偏低，影响了发酵产品的整体风味，进而导致感官评分较低；当糖化培菌时间被过度延长，导致发酵体系内其他微生物的繁殖，它们与酵母菌形成营养竞争，从而抑制了酵母菌的活性与增长，导致其他次级代谢副产物的增加，进而导致酒精度和感官评分下降[14-15]。综合考虑，确定最佳糖化培菌时间为60 h。
图3 糖化培菌时间对青川黄酒酒精度和感官评分的影响
Fig.3 Effect of saccharification culture time on alcohol content and sensory score of Qingchuan Huangjiu
2.3.1 Box-Benhnken响应面试验设计及结果
基于单因素试验结果，以大竹小曲添加量（A）、糖化培菌温度（B）和糖化培菌时间（C）为自变量，以感官评分（Y）为响应值，采用Design Expert 13.0软件设计3因素3水平的Box-Benhnken响应面试验[16-17]，试验设计及结果见表4，方差分析见表5。
表4 青川黄酒糖化培菌工艺优化Box-Benhnken响应面试验设计及结果
Table 4 Design and results of response surface tests for saccharification culture technology optimization of Qingchuan Huangjiu
试验号 A 大竹小曲添加量/%B 糖化培菌温度/℃C 糖化培菌时间/h Y 感官评分/分1234567891 0 11 0.8 1.2 0.8 1.2 0.8 1.2 0.8 1.2 1.0 1.0 1.0 26 26 30 30 28 28 28 28 26 30 26 60 60 60 60 48 48 72 72 48 48 72 83.2 80.6 84.3 5.2 80.4 82.5 84.3 80.6 83.3 85.5 85.6
续表
试验号 A 大竹小曲添加量/%B 糖化培菌温度/℃C 糖化培菌时间/h Y 感官评分/分12 13 14 15 16 17 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 30 28 28 28 28 28 72 60 60 60 60 60 87.1 90.2 92.5 91.3 90.0 90.4
表5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型**ABCA B**AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和243.65 2.20 9.03 4.35 1.69 8.41 0.122 5 132.16 19.96 46.62 5.00 0.727 5 4.27 248.64 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 27.07 2.20 9.03 4.35 1.69 8.41 0.122 5 132.16 19.96 46.62 0.713 6 0.242 5 1.07 37.93 3.09 12.66 6.10 2.37 11.78 0.171 7 185.19 27.98 65.33＜0.000 1 0.122 2 0.009 3 0.042 9 0.010 9 0.691 0 0.001 7＜0.000 1 0.001 1＜0.000 1** ********0.227 3 0.873 2
采用Design Expert 13.0软件对表4中的结果进行多元二次线性回归拟合得到二次多元回归方程：
由表5可知，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明此回归模型拟合度良好，误差较小。回归模型的决定系数R2为0.979 9，调整决定系数R2adj为0.954 1，说明该模型产生的偏离很低且与实际情况相关程度高。由P值可知，一次项B、交互项BC，以及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项C和交互项AB对结果影响显著（P＜0.05），而其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，3个因素对青川黄酒感官评分影响的主次顺序为：糖化培菌温度（B）＞糖化培菌时间（C）＞大竹小曲添加量（A）。
2.3.2 各因素间交互作用对感官评分的影响
响应曲面弯曲程度及等高线能说明两个因素之间交互作用对结果影响的强弱，弯曲程度越大，等高线为越趋于椭圆形，表示这两个因素间的交互作用越强；弯曲程度越小，等高线越趋于圆形，表示这两个因素间的交互作用越弱[18-20]，各因素间交互作用对青川黄酒感官评分影响的响应曲面及等高线见图4。由图4可知，所有响应面均呈凸面，存在最大值，其中，AB与BC曲面的弯曲坡度较大，斜率较陡峭，等高线呈椭圆形，说明二者间交互作用对结果影响较大，这与方差分析结果一致。
图4 各因素间交互作用对青川黄酒感官评分影响的响应曲面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on sensory score of Qingchuan Huangjiu
2.3.3 验证试验
采用Design Expert 13.0软件对多元回归方程预测，得到青川黄酒最佳糖化培菌工艺为大竹小曲添加量0.990%、发酵温度28.465 ℃、发酵时间61.382 h，青川黄酒感官评分的预测值为93.498分。为了便于实际操作，将最佳工艺条件修订为大竹小曲添加量1%、糖化培菌温度28 ℃、糖化培菌时间61 h。在最佳工艺下进行3次验证试验，得到青川黄酒色泽鲜明亮黄，酒香浓厚雅致，酒体丰满、口感醇厚，具有青川黄酒的风格，感官评分的实际值为93.6分，与预测值相差不大，证明了响应面法所得到的模型参数的精确度和稳定性，能够真实地展示出各种因素对青川黄酒发酵的影响。
在最佳工艺条件下制得青川黄酒，对其理化指标进行分析，结果发现，青川黄酒的总酸含量（以乳酸计）为（6.50±0.05）g/L，总糖含量为（7.86±0.04）g/L，酒精度为（12.50±0.21）%vol，氨基酸态氮含量为（0.24±0.04）g/L，pH值为3.65±0.054，其理化指标均符合GB/T 13662—2018《黄酒》要求。
利用HS-SPME结合GC-MS对最优工艺条件下发酵得到的青川黄酒的挥发性风味成分进行分析，结果见表6。
表6 青川黄酒挥发性风味成分GC-MS分析结果
Table 6 Determination results of volatile flavor components in Qingchuan Huangjiu analyzed by GC-MS
编号 种类 化合物 相对含量/%1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0醇类11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28酯类醛类酸类酮类2-甲基丁醇异戊醇异丁醇苯乙醇异丙醇2,3-丁二醇棕榈酸乙酯癸酸乙酯油酸乙酯正己酸乙酯乙酸异戊酯亚油酸乙酯乙酸苯乙酯琥珀酸二乙酯乙酸辛酯辛酸乙酯壬酸乙酯9-癸烯酸乙酯苯甲醛苯乙醛反-2-辛烯醛癸醛壬醛乙酸2-氨基-6-甲基苯甲酸异戊酸异辛酸香叶基丙酮19.84±0.52 26.14±0.26 4.25±0.14 35.22±0.12 3.84±0.13 2.30±0.14 3.05±0.25 2.78±0.13 2.28±0.10 1.92±0.15 1.51±0.09 1.08±0.05 1.03±0.02 0.96±0.02 0.81±0.03 0.80±0.01 0.15±0.03 0.14±0.02 0.23±0.02 0.10±0.02 0.24±0.03 0.03±0.01 0.19±0.01 1.63±0.04 1.96±0.05 0.16±0.02 1.10±0.05 0.95±0.03
由表6可知，从青川黄酒中共检出28种挥发性风味成分，包括酯类12种、醇类6种、醛类5种、酸类4种和酮类1种。在青川黄酒的挥发性风味成分中，酯类物质占据主导地位，其中乙酯尤为显著，由于乙醇是黄酒中含量最为丰富的醇类物质，是生成乙酯的主要来源，醇类与酸类化合物作为酯化反应的基本前体，通过酯化作用，高效地生成了大量的乙酯[21-23]。棕榈酸乙酯、癸酸乙酯、油酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸异戊酯、亚油酸乙酯是青川黄酒中含量较高的成分，是香气构成的重要组成部分，对酒的口感和稳定性至关重要，尤其棕榈酸乙酯可增加酒体的丰满感，减轻其生硬口感，增强酒的余味[24-26]。异戊醇、苯乙醇这些醇类化合物是第二大类挥发性成分，其中异戊醇具有苹果白兰地香气和辛辣感，有助于改善青川黄酒的风味；而苯乙醇则被研究发现是酒体中重要的芳香化合物之一，具有令人愉悦并持久的玫瑰气味[27-29]。醛类物质中，苯甲醛、癸醛和壬醛具有独特的杏仁香和橘皮香，而酸类物质则是影响黄酒口感和后味的主要因素[30]。
本研究经过单因素和响应面优化试验得到青川黄酒的最佳糖化培菌条件：以黄糯玉米为原料，大竹小曲为酒曲，酒曲添加量1.0%，糖化培菌温度28 ℃，糖化培菌时间61 h。在此优化条件下得到的青川黄酒酒体协调，色泽亮黄，酒香浓郁，具有青川黄酒特有的风味，感官评分为93.6分，总酸含量（以乳酸计）为（6.50±0.05）g/L，总糖含量为（7.86±0.04）g/L，酒精度为（12.50±0.21）%vol，氨基酸态氮含量为（0.24±0.04）g/L，pH值为3.65±0.054，其理化指标符合GB/T 13662—2018《黄酒》要求。采用HS-SPME结合GC-MS从青川黄酒中共检出28种挥发性风味化合物，包括酯类12种、醇类6种、醛类5种、酸类4种和酮类1种。本研究结果为青川黄酒的发展提供了一定的数据支撑，也为高品质咂酒的开发提供参考。
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