Analysis on the flavor characteristics of Rosa roxbunghii juice with different carbon sources fermented by lactic acid bacteria based on electronic nose and HS-SPME-GC-MS
刺梨（Rosa roxbunghii Tratt.）富含氨基酸、维生素C[1]、黄酮[2]、胡萝卜素、矿物质及氨基酸[3]等营养成分，具有抗氧化、降血糖、增强免疫力、解酒护肝及助消化功能[4]。贵州地区刺梨资源尤为丰富，产量全国领先[5]。刺梨产品种类丰富，有原汁、酵素、果酒、果醋、果脯及酸乳[6]等，以酵素产品为主，经乳酸菌发酵能使大分子物质被降解，产生游离氨基酸、多肽、游离脂肪等物质，改善产品品质和感官特征[7-8]。
蔗糖是发酵刺梨汁中常加入的碳源，既能提升口感又能为乳酸菌发酵提供碳源[9-10]。但人体在饮品中糖分摄入过多会导致脂肪过量积累，使肥胖率越来越高[11]。近年来，研究人员尝试用其他物质代替蔗糖作为补充碳源。石媛[12]研究表明，大米作为补充碳源发酵得刺梨米醋在风味和口感上差别较大，刺梨黑糯米醋挥发性风味物质及游离氨基酸高于其他大米碳源，感官评分最优。王程惠等[13]以刺梨汁为原料，甜酒酿为补充碳源制备酒醪，辅助刺梨果渣制备刺梨醋，为刺梨工业化发酵碳源的选择提供理论依据。玉米面粉作为乳酸菌发酵补充碳源，在苞谷酸肉[14]、酸辣子[15]及无盐酸菜[16]等发酵食品中应用历史悠久，具有用料天然、操作简便、低成本等优势。但玉米面作为碳源发酵食品的优势尚无研究报道，尤其是应用在刺梨发酵生产。
为验证玉米面粉作为乳酸菌发酵刺梨汁补充碳源的可行性，本研究以副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）为菌种，蔗糖和玉米面粉作为两种补充碳源用于发酵刺梨汁，利用电子鼻结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry technology，HS-SPME-GC-MS）对其风味进行分析，为乳酸菌发酵刺梨汁的品质及风味提升提供理论依据。
1.1.1 材料
刺梨原汁（总糖0.57%，还原糖0.33%，多酚1.14g/100mL，总黄酮0.37 mg/g，维生素C含量1 222.29 mg/100 mL）：贵州山王果健康实业有限公司；玉米面粉（50目）、白砂糖：市售；副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）：西安聚生原生物科技有限公司。
1.1.2 试剂
环己酮（色谱纯）：美国Sigma Aldrich贸易公司；氯化钠（分析纯）：天津市化工三厂有限公司。
v18A九阳原汁机：九阳股份有限公司；Trace 1300-TSQ 8000 Evo气相色谱-质谱联用仪：美国赛默飞世尔科技公司；WYT-II手持式糖度计：成都豪创光电仪器有限公司；CM-5色差仪：日本柯尼卡美能达公司；cNose电子鼻：上海保盛实业发展有限公司。
1.3.1 不同碳源发酵刺梨汁制备
蒸制玉米面制备：以玉米粉及水质量比为1∶1加水混匀，于100 ℃条件蒸制30 min得到蒸制玉米面，冷却至室温后，备用。
以未发酵的组别为对照（CK）。分别以蒸制玉米面、蔗糖为碳源发酵刺梨汁，刺梨原汁与水按1∶4体积比混合，刺梨汁装液量为200 mL/250 mL，100 ℃加热5 min进行灭菌（制备2份），分别加入不同碳源及菌种：7.5%蒸制玉米面及1%副干酪乳杆菌，为玉米碳源组（RRT-YM），7.5%蔗糖及1%副干酪乳杆菌，为蔗糖碳源组（RRT-YM），37 ℃恒温发酵4 d，用纱布过滤取上清液获得不同碳源发酵刺梨汁成品。
1.3.2 分析检测
pH：采用pH计测定[17]；可溶性固型物：采用手持式糖度计测定。
颜色参数：采用色差仪测定刺梨汁的L*值、a*值、b*值。a*值表示红绿度指数，b*值表示黄蓝度指数，ΔE表示总色差。ΔE＜2.0表示待测样品与对照样品颜色差异较小，2.0＜ΔE＜4.0表示存在明显差异，ΔE＞4.0表明存在极显著色差[18]。
乳酸菌活菌数：参考国标GB 4789.35—2023《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[19]的稀释涂布平板法测定。
1.3.3 感官评价
根据GB/T16291.1—2010《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则》的要求招募感官评价员[20]。感官评价小组由10名（男女各5名）经过“三点检测”和“对照差别检验法”培训和考核的感官评价员组成，以CK组为对照，参考T/GZCX 026—2024《刺梨发酵汁》[21]分别从香气、色泽、口感3个指标进行评分，总分30分，结果取平均值，具体感官评价标准见表1。
表1 发酵刺梨汁感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of fermented Rosa roxbunghii juice
项目 评分标准 感官评分/分气味色泽滋味具有浓郁的芳香气味，令人愉悦有较好的香气，令人接受综合气味较差，令人不适刺梨汁有光泽，令人愉悦刺梨汁较有光色，透明刺梨汁为暗橙黄色，令人不适具有优良滋味，味道很好味道一般，令人接受整体滋味水平很差，味道接受度极低7～10 4～6 0～3 7～10 4～6 0～3 7～10 4～6 0～3
1.3.4 电子鼻分析
取10 mL样品于顶空瓶，30℃水浴静置15 min，采用顶空吸气法进行采集。电子鼻测定参数：传感器清洗时间120 s，自动调零时间15 s，样品准备时间5 s，样品测试时间100 s，传感器流速600 mL/min，试验中发现传感器响应值在80 s趋于稳定，故选择85～90 s时响应值的平均值用于数据分析[22]。测量前后，均对传感器进行清洗和标准化。电子鼻系统包含10个传感器对不同化合物敏感，分别为：W1C（芳香化合物、苯）、W5S（氮氧化物）、W3C（氨及芳香成分）、W6S（氢化物）、W5C（烯烃、短链芳香族化合物）、W1S（烷烃）、W1W（硫化物、萜稀类化合物）、W2S（醇、醛、酮）、W2W（有机硫化物、芳香类化合物）、W3S（长链烷烃）。
1.3.5 挥发性风味成分测定
采用HS-SPME-GC-MS测定挥发性风味成分[23]。
顶空固相微萃取：取7 g样品于顶空瓶中，加入内标物（环己酮，1 900 μg/L），60 ℃水浴10 min平衡，用萃取头进行萃取30 min后进样。
GC条件：Agilent DB-WAX弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：以4 ℃/min升至120 ℃保持3 min，再以4 ℃/min升至180 ℃保持3 min，最后以5 ℃/min升至240 ℃保持1 min；载气为高纯氦气（He），流速为1.2 mL/min；进样方式为不分流进样。
MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源；电子能量70 eV；离子源温度为320 ℃；传输线温度为250 ℃；质量扫描范围40～580 m/z。
定性定量分析：将检测结果与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）数据谱库检索结果对比，选取相似度＞85%的化合物；采用内标半定量法定量[11]，计算公式如下：
式中：C2为目标化合物质量浓度，mg/L；C1为内标物质量浓度，mg/mL；V1为内标物体积，mL；V0为样品体积，mL；S2为目标化合物峰面积；S1为内标峰面积。
通过香气活力值（odor activity value，OAV）比较风味物质的呈香贡献力，香气活力值=风味物质的含量/风味物质的阈值[24]。
1.3.6 数据分析
使用SPSS 26.0对数据进行单因素ANOVA检验，数据结果以“平均值±标准差”表示，采用Origin 2021软件绘图。
由图1可知，乳酸菌在不同碳源刺梨汁中表现出不同的生长状态。随着发酵时间在0～4 d的增加，RRT-YM、RRT-ZT乳酸菌活菌数均先升高后下降，分别在3 d、2 d达到最高值，分别为8.69lgCFU/g和8.24 lgCFU/g，此后趋于稳定，这可能是由于营养物质消耗不足以支持乳酸菌的生长[16]。RRT-YM的乳酸菌活菌数在发酵过程中始终高于RRT-ZT，单位时间内乳酸菌活菌数增长较多，乳酸菌增长速度较快。有研究表明，乳酸菌等微生物因其抗逆性，在高酸环境下会消耗乳酸以克服乳酸胁迫，所以发酵后期pH不再变化[25]。为保证后续研究的样品稳定性，选择最佳发酵时间为3 d。
图1 不同碳源刺梨汁发酵过程中乳酸菌活菌数变化
Fig.1 Changes of viable lactic acid bacteria counts of Rosa roxbunghii juice with different carbon sources during fermentation process
由表2可知，与CK组相比，RRT-YM、RRT-ZT组样品pH值分别显著降低至2.98、3.46（P＜0.05），表明在RRT-YM样品乳酸菌发酵产酸量更多，与乳酸菌活菌数测定结果一致。研究表明，玉米面发酵过程中产生的乳酸含量可高达85%[26]，验证了玉米面粉作为乳酸菌发酵刺梨汁补充碳源的可行性，相对于RRT-ZT组，RRT-YM更有益于乳酸菌生长，表明玉米面粉作为碳源能产生更多乳酸菌发酵用糖。与CK组相比，RRT-YM组a*值及b*值显著降低（P＜0.05），但ΔE无显著差异（P＞0.05）。与CK组相比，RRT-ZT可溶性固形物显著增加（P＜0.05），这是由于RRT-ZT样品中添加的蔗糖尚未被乳酸菌完全利用，ΔE显著降低（P＜0.05），可能是由于发酵过程中刺梨汁产生褐变，而a*值及b*值物无显著差异（P＞0.05）。此外，以CK组为对照，RRT-YM及RRT-ZT组感官评分均显著增加（P＜0.05），其中，RRT-YM的感官评分最高（24.93分）。因此，玉米面粉作为乳酸菌发酵刺梨汁的碳源更适宜乳酸菌生长。
表2 乳酸菌发酵不同碳源刺梨汁的理化指标及感官评价
Table 2 Physicochemical indexes and sensory evaluation of Rosa roxbunghii juice with different carbon sources fermented by
lactic acid bacteria
注：同列数据小写字母不同代表差异显著（P＜0.05）。
样品 pH值 可溶性固形物/% ΔE L*值 a*值 b*值 感官评分/分CK RRT-YM RRT-ZT 3.50±0.02c 2.98±0.01a 3.46±0.03b 3.00±0.06a 2.93±0.05a 10.50±0.04b 45.13±2.49a 45.78±3.98a 42.13±3.99b 52.65±2.16a 55.21±4.17a 49.86±3.55b 7.13±0.45b 3.18±0.39a 7.32±0.42b 25.61±1.74b 16.76±0.78a 24.38±2.23b 15.84±1.26a 24.93±1.80c 19.78±0.57b
采用电子鼻对乳酸菌发酵刺梨汁整体风味进行测定，结果见图2。由图2可知，与CK组相比，样品RRT-YM及RRT-ZT相似度较高，W1C、W3C、W6S及W5C、W1S传感器对乳酸菌发酵刺梨响应值都较低，没有明显差异，与其他传感器相比，对W1W（对硫化物，萜稀类化合物敏感）传感器响应值最高，其次为W5S（对氮氧化合物灵敏）、W2W（对有机硫化物和芳香成分敏感）以及W2S（对醇醛酮类敏感）传感器，表明发酵刺梨汁中主要的挥发性成分有硫化物、氮氧化合物、有机硫化物和芳香成分、醇醛酮类等，这与莫梅清等[27]的研究结果一致，此外，除W1W及W2W传感器外，RRT-YM各传感器的响应值均低于CK组及RRT-ZT组，表明在RRT-YM中萜类化合物、有机硫化物及芳香成分占比较大。
图2 乳酸菌发酵不同碳源刺梨汁电子鼻检测结果
Fig.2 Electronic nose detection results of Rosa roxbunghii juice with different carbon sources fermented by lactic acid bacteria
通过数据可视化结合数据处理手段，以电子鼻探头响应值为参数变量，对3种样品进行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA），结果见图3。由图3可知，PC1和PC2的方差贡献率分别为86.15%、13.11%，其累积方差贡献率为99.26%（＞85.00%），可以反映乳酸菌发酵不同碳源刺梨汁挥发性物质的主要信息特征[28]，不同样品距离越远说明不同样品的气味差异性越大[29]，RRT-YM对PC1的贡献率最大，RRT-ZT对PC2贡献率最大，两者存在较大差异。综上，乳酸菌发酵不同碳源刺梨汁风味有显著差异，RRT-YM与CK差异较大，RRT-YM风味中硫化物、萜稀类化合物及芳香物质占比增加，相比于RRT-ZT组有明显优势。可根据PCA区分不同碳源的刺梨汁样品。
图3 基于电子鼻检测结果乳酸菌发酵不同碳源刺梨汁的主成分分析结果
Fig.3 Principal component analysis results of Rosa roxbunghii juice with different carbon sources fermented by lactic acid bacteria based on electronic nose detection results
乳酸菌发酵不同碳源刺梨汁的挥发性风味化合物分析见表3。由表3可知，不同样品中共检出47种挥发性风味化合物，包括烯类9种，醇类10种，酸类3种，酮类5种，醛类12种，其他类8种，其中，CK、RRT-YM、RRT-ZT分别检测出34种、20种、15种挥发性风味物质，总含量分别为204.99mg/L、68.19 mg/L及30.05 mg/L。与CK组相比，RRT-YM及RRT-Z挥发性风味化合物含量及种类减少，可能是发酵过程中挥发性成分分解与挥发，但经乳酸菌发酵后原汁的生涩风味得到改善。
表3 乳酸菌发酵不同碳源刺梨汁的挥发性风味化合物分析
Table 3 Volatile flavor compounds analysis of Rosa roxbunghii juice with different carbon sources fermented by lactic acid bacteria
种类 序号 化合物 阈值/（mg·L-1）CK含量/（mg·L-1）RRT-YM CK RRT-ZT OAV RRT-YM RRT-ZT 36-0.01-0.70±0.00 1.35±0.00--1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0月桂烯3-蒈烯苯乙烯α-蒎烯α-姜黄烯丁香烯榄香烯反式菖蒲烯角鲨烯小计2-壬烯-1-醇甲基乙酰甲醇桉叶油醇2-乙基己醇0.02萜烯类-- - - - -1.26±0.12 0.03±0.00 11.05±0.27 1.00±0.10 0.62±0.09 0.81±0.24 23.94±0.41 0.42±0.04 39.13±1.27 7.87±0.01 0.24±0.04 8.80±0.67 0.68±0.09 11 12 13醇类6- - - - - - --- - - - - - - - 0 - - -3.29 1.84 5.21±0.00 7.26±0.00-0.67±0.00-- - - - - - -2.60×10-4---0.92±0.11 33846--- - - - - - - - - - - --- - - - - - - - - - - -
续表
注：“-”表示未检测到。
种类 序号 化合物 阈值/（mg·L-1）CK含量/（mg·L-1）RRT-YM CK RRT-ZT OAV RRT-YM RRT-ZT 14 15 16 17 18 19-6-2,3-二甲基环己醇芳樟醇辛醇β-松油醇香叶醇苯甲醇小计乙酸辛酸壬酸小计3-羟基-2-丁酮左旋香芹酮大马士酮香叶基丙酮芷香酮小计正辛醛壬醛糠醛癸醛苯甲醛4-羟基壬烯醛5-甲基呋喃醛反式-2-癸烯醛2-癸烯醛柠檬醛十二醛5-羟甲基糠醛小计庚酸烯丙酯香芹酚乙酸酯丁酸乙酯甲基丁香酚3-甲基-5-乙基苯酚4-异丙基甲苯7-顺式-倍半红木烯水合物榄香素小计---0.49±0.01 0.50±0.04-0.20±0.01 3.64±0.53 0.03±0.00 22.45±1.40-11.85±1.01 5.76±0.60 17.61±1.60-1.13±0.00 0.26±0.00--1.04±0.12 0.37±0.00 0.08 0.17 110 340 8 100 0.78±0.16 0.01—— ——-0.49—— - -酸类20 21 22 22 000 3 000 3 000 4.24±0.76 6.32±0.88 14.48±1.51 10.93±0.05-25.41±1.56 0.00 0.03 0.00 1.70±0.27 3.37±0.04 8.51±0.28 1.19±0.01 13.07±0.33 2.70±0.00 0.04-0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00-- -800酮类23 24 25 26 27 0.05 60-- ---5.29-- - --- - -0.01-- - ---0.01--1.39±0.00-2.46±0.15 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39-1 1 1 1-- -0.32±0.00 0.14±0.00 0.46±0.00 2.99±0.00 0.33±0.01 2.58±0.00 3.82±0.00 1.63±0.00 0.65±0.00-3.35±0.00-1.77±0.00 2.93±0.00 2.85±0.01 2.46——4.27 0.33 2.58 3.82 1.77 2.93 2.85醛类350-0.05 81 0.40 3000 2 20 1.96±0.80 0.68±0.04 6.81±0.36 1.58±0.11 1.03±0.20 5.07±0.32 16.71±0.61-36.30±2.27-0.26±0.03-1.05±0.34-- - - - - --- - - - --- - - - -0.01-136.18 0.02 2.57-8.36 0.15±0.00 0.98±0.00 8.69±0.01 0.08 0.05 40 41 42 43 44 45 46 47-- - - - - - -11.35±0.01 16.84±0.74-5.13±0.95--其他-- ---1.88±0.00 0.40±0.01 1.73±0.04--4.71±0.26 6.02±0.63 2.73±0.01 5.92±0.25-30.62±1.95 1.11±0.01 5.12±0.06-- - - - - - - - - --- - - - - - - - - - - - - - - - --- - - - - - - - -
2.4.1 萜稀类
萜稀类挥发性成分是常见的芳香物质，多存在于新鲜果蔬及其制品中[30]。CK及RRT-YM中萜稀类化合物分别为8种、3种，含量分别为39.12 mg/L、7.27 mg/L，α-蒎烯及反式菖蒲烯在CK组中含量最高，分别为11.05 mg/L、23.94 mg/L，其中，α-蒎烯的OAV为1.84，贡献了令人愉悦的香脂香气[31]。RRT-ZT组中并未检测到此物质，这表明刺梨汁经乳酸菌发酵后风味物质含量下降，可能是萜类化合物在发酵过程中挥发，但感官评分有改善作用，表明发酵产生的代谢物质能改善刺梨汁风味[9]。RRT-YM角鲨烯含量明显上升，这可能是由于玉米面粉的淀粉被水解，油脂释放出来，而角鲨烯是玉米油中重要微量成分[32]。
2.4.2 醇类
醇类物质是青香型化合物的代表，大多数醇类被赋予甜香的风味特征，可有效的增加发酵刺梨的香甜风味。CK、RRT-YM及RRT-ZT含量分别为22.45 mg/L、6.33 mg/L及1.7 mg/L，表明在乳酸菌发酵后醇类物质大幅减少，其中，桉叶油醇在CK组中含量为8.80 mg/L，OAV为33 846，表现为典型的生涩植物味[33]，在RRT-YM及RRT-ZT中尚未检出，因此生涩味得到改善。RRT-YM中苯甲醇含量最高，为4.24 mg/L，可能由苯甲醛代谢产生，表现为甜香、烘烤香[31]，但OAV为0.04＜1，不是特征香气成分。
2.4.3 酸类
酸类物质沸点较高，挥发性弱，固相微萃取头不易吸附[32]。在3组样品中均检出乙酸及辛酸，其在CK组中含量最高，分别为698.45 mg/L及81.85 mg/L，乙酸由乳酸菌经丙酮酸甲酸裂解途径产生[16]。经乳酸菌发酵后，挥发性酸类物质含量增加，但由于酸类物质的阈值较高，均未在刺梨汁风味中有贡献，这和感官评价描述结果一致。
2.4.4 酮类
酮类物质阈值较低，对风味贡献较大。CK、RRT-YM及RRT-ZT酮类物质含量分别为1.39 mg/L、0.46 mg/L及3.35mg/L。香叶基丙酮含量为0.32mg/L，阈值较高，为60mg/L，具有玫瑰、玉兰花香味[22]。大马士酮的阈值较低，为0.05mg/L，其OAV为5.29，对CK组的风味有一定贡献。
2.4.5 醛类
醛类化合物主要是低碳链醛类和芳香族醛类，是刺梨果汁的主要香气成分[23]。CK组中挥发性醛类物质含量高于RRT-YM及RRT-ZT组，说明经不同乳酸菌发酵后醛类物质的相对含量均显著下降，醛类物质可能被还原成醇或氧化为酸[13]。CK组中5甲基呋喃醛、十二醛含量最高，分别为6.81 mg/L、1.58 mg/L，OAV分别为136.18、8.36。辛醛是RRT-YM中特有挥发性成分，含量为2.99 mg/L，其OAV（4.27）高于糠醛（2.58）、癸醛（3.82），呈现出柑橘香、水果味。糠醛和癸醛是RRT-YM及RRT-ZT特有风味成分，后者具有甜橙香气的挥发性物质[34]。
2.4.6 其他类
在其他类风味成分中，丁酸乙酯作为副干酪乳杆菌发酵刺梨汁特征风味物质，在RRT-YM及RRT-ZT中均有检出[16]。RRT-YM中其他类挥发性成分较多，如庚酸烯丙酯含量为16.84 mg/L，为其带来了独特的风味及花果香气。
以上结果表明，与CK组相比，RRT-YM及RRT-ZT组对风味提升效果明显。RRT-YM的萜类、醇类及醛类挥发性成分含量均高于RRT-ZT，与电子鼻分析结果一致，可计算OAV的有15种。角鲨烯、苯甲醇、辛醛是RRT-YM样品特有且含量较高的挥发性成分，其中，辛醛（2.99 mg/L）的OAV为4.27，对RRT-YM风味有贡献。
RRT-YM中乳酸菌生长速度快于RRT-ZT，当发酵时间为3 d时，乳酸菌活菌数达最高值（8.69 lg CFU/g），其pH、可溶性固形物含量、感官评分分别为2.98、2.93%、24.93分。采用电子鼻及HS-SPME-GC-MS能够区分乳酸菌发酵不同碳源刺梨汁风味特征。电子鼻分析表明，与其他组别相比，RRT-YM中硫化物、萜稀类化合物及芳香物质占比较大。挥发性风味成分分析表明，RRT-YM挥发性成分种类为20种，其萜类、醇类及醛类挥发性风味成分含量均高于RRT-ZT。其中，角鲨烯、苯甲醇、辛醛是RRT-YM特有且含量较高的挥发性成分，其含量分别为5.21 mg/L、4.24 mg/L、2.99 mg/L，对RRT-YM甜香、水果香及柑橘风味有贡献。以上研究验证了乳酸菌发酵以玉米为碳源刺梨汁的可行性。
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