白酒作为中国传统发酵蒸馏酒，也是世界六大著名蒸馏酒之一[1]。其中，酱香型白酒属于中国白酒四大基本香型之一，其以独特的酱油香味和烘烤香气广受欢迎[2]。酱香型白酒生产工艺独特，包括端午制曲、重阳下沙、一年一个生产周期、2次投料、9次蒸煮、8次发酵和7次馏酒，形成了复杂的“12987”工艺[3-4]，其特点可被总结为“四高两长，一大一多”，即高温制曲、高温堆积发酵、高温接酒、高温馏酒、发酵时间长、贮存时间长、用曲量大和发酵轮次多[5]。
目前，关于酱香型白酒的研究主要集中在酒体风味物质鉴定[6]、风味成分组成种类和比例检测[7-8]、酿酒微生物体系检测[9-10]、酿酒工艺优化[11]、感官定性和定量评价[12-14]及酒类健康和安全[15]等方面。如郭雪峰等[16]研究了4种酱香型白酒的主要挥发性风味化合物，建立了感官属性与特征风味物质的数学模型；林先丽等[17]利用感官定量描述和顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用（headspace solidphase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术，分析了不同地区酱香型白酒的感官品质和挥发性风味物质，结果发现赣州和仁怀地区的白酒存在显著差异；莫新良等[18]通过感官评价和GC-MS技术，解析出一种典型酱香型白酒中的90种挥发性风味成分，确定了甜香、水果香和花香的主要贡献化合物；黄蕴利等[19]探究了酱香型白酒二轮次发酵过程中微生物群落结构的变化、微生物多样性以及物种与样品之间的关系，结果发现二轮次酒生产堆积、窖池发酵酒醅中微生物多样性二者存在较大的差异等。这些研究为酱香型白酒的风味物质解析和生成来源提供了重要依据。然而，目前关于不同年份酱香型白酒轮次基酒挥发性风味物质差异的研究相对较少，缺乏贮存时间对酱香型白酒轮次基酒风味差异影响的认识。
本研究以茅台镇某酒厂不同年份（2021年、2022年、2023年）生产的酱香型白酒二轮次基酒为研究对象，采用HS-SPME-GC-MS技术，结合感官定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元统计分析手段，研究不同年份酱香型白酒二轮次基酒挥发性风味物质的差异，并确定了其主要差异风味物质，以期对酱香型白酒酒体设计、风味物质研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
不同年份酱香型白酒二轮次基酒：采自贵州省仁怀市茅台镇某酒厂，2021年生产的酒样编号为J_2_21，2022年生产的酒样编号为J_2_22，2023年生产的酒样编号为J_2_23；2-辛醇标准溶液（100 μg/mL）：上海Sigma-Aldrich公司；氯化钠（分析纯）、乙醇（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。
1.2 仪器与设备
GC-MS QP2010 Plus气相色谱-质谱联用仪：日本Shimadzu公司；CP-WAX 57CB毛细管色谱柱（50 m×0.25 mm×0.20 μm）、DB-FFAP色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 酱香型白酒二轮次基酒的感官评价方法
参照GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》[20]、GB/T 16291.1—2012《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则第一部分：优选评价员》[21]中的方法，优选5名年龄在20～45岁且均具有国家三级品酒师以上资质的成员组成评价小组。酒样感官香气特征描述词为粮香、酸香、花香、果香、青草香、坚果香、植物香、甜香、余味[12]。评价小组运用定量描述性的六点刻度法[22]进行感官评分，单项风味特征评定分值设定范围为0～5分，评分规则为0分代表无香气，1分代表香气弱，2分代表香气较弱，3分代表香气中，4分代表香气较强，5分代表香气强。
1.3.2 酱香型白酒二轮次基酒的挥发性风味物质测定
采用HS-SPME-GC-MS技术测定不同年份酱香型白酒二轮次基酒中的挥发性风味物质。
HS-SPME：精确量取10mL酒样于顶空瓶中，加入100μL 1%内标溶液（2-辛醇），混匀。将顶空瓶样品置于50 ℃的条件下，以450 r/min的转速振荡孵化5 min，随后插入DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，在相同温度条件下，以相同的转速振荡萃取40 min。萃取结束后，样品在250 ℃条件下解吸5 min。
GC条件：DB-FFAP毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度和气相色谱检测器温度设定为250 ℃，载气为高纯氦气（He）（＞99.999%），流速为1.2 mL/min，采用不分流进样方式。程序升温条件为初始温度40 ℃保持1 min，以2.5 ℃/min的速度升至100 ℃，保持1 min，以3 ℃/min的速度升至160 ℃，以5 ℃/min的速度升至230 ℃，保持10 min。
MS条件：采用电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，扫描范围为30～550 m/z。
1.3.3 数据处理与统计分析
每个试验重复3次，结果用“平均值±标准差”表示，采用Excel 2022、Origin 2021、Simca 14.1对数据进行处理。
2 结果与分析
2.1 不同年份酱香型白酒二轮次基酒感官特征
不同年份酱香型白酒二轮次基酒的感官评分雷达图见图1。
图1 不同年份酱香型白酒二轮次基酒的感官评价雷达图
Fig.1 Radar chart of sensory evaluation of second-round base liquor of sauce-flavor Baijiu with different aging years
由图1可知，不同年份酱香型白酒二轮次基酒的香气特征相似，均为酸香、粮香较突出，且2023年酱香型白酒二轮次基酒的酸香和粮香显著高于其他2个年份（P＜0.05）；此外，二轮次基酒的花香、果香、青草香、酸香、粮香随着贮存年份的增长呈递减趋势，余味呈递增趋势；不同年份的酱香型白酒二轮次基酒酒样均无明显坚果香和植物香。
2.2 不同年份酱香型白酒二轮次基酒挥发性风味物质差异分析
2.2.1 不同年份酱香型白酒二轮次基酒挥发性风味物质总体结构分析
为进一步分析贮存时间对酱香型白酒二轮次基酒挥发性风味物质组成的影响，通过HS-SPME-GC-MS分别对不同年份二轮次基酒中的挥发性风味物质进行分析，结果从不同年份酱香型白酒二轮次基酒中共定性定量出165种挥发性风味物质，包括酸类9种、酯类47种、醛类19种、醇类27种、酮类16种及其他类47种，具体含量见图2。
图2 不同年份酱香型白酒二轮次基酒挥发性风味物质含量分析结果
Fig.2 Analysis results of volatile flavor substances content in second-round base liquor of sauce-flavor Baijiu with different aging years
由图2可知，不同年份酱香型白酒二轮次基酒中的挥发性风味物质均以酸类、酯类、醛类、醇类、酮类为主，且总含量均随贮存年份的增加呈升高趋势。2021年、2022年和2023年二轮次基酒中的酸类物质总含量分别为（12.36±0.33）mg/L、（5.88±1.21）mg/L和（2.21±0.02）mg/L；酯类物质总含量分别为（88.72±0.99）mg/L、（53.24±0.37）mg/L和（40.90±0.0.47）mg/L；醛类物质总含量分别为（26.86±0.29）mg/L、（11.97±0.15）mg/L和（9.22±0.04）mg/L；醇类物质总含量分别为（13.16±2.09）mg/L、（10.08±0.09）mg/L和（8.12±0.14）mg/L；酮类物质总含量分别为（5.09±0.03）mg/L、（4.44±0.02）mg/L和（3.78±0.01）mg/L。
2.2.2 不同年份酱香型白酒二轮次基酒骨架风味物质分析
基于前期对不同产地、不同类型和不同质量酱香型白酒风味成分中骨架风味物质的研究[23-25]，从不同年份酱香型白酒二轮次基酒中共筛选出45种骨架风味成分，结果见表1。
表1 不同年份酱香型白酒二轮次基酒骨架风味物质GC-MS分析结果
Table 1 GC-MS analysis results of skeleton flavor substances in second-round base liquor of sauce-flavor Baijiu with different aging years
序号种类 CAS 化合物含量/（mg·L-1）酒样J_2_21 酒样J_2_22 酒样J_2_23 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0酸类乙酸DL-3-羟基丁酸异戊酸己酸庚酸辛酸反式-乌头酸丁酸正壬酸酯类11 12 13正己酸乙酯乙酸正丙酯辛酸乙酯丁酸乙酯十六酸乙酯癸酸乙酯乙酸异戊酯戊酸乙酯丁酸丁酯庚酸乙酯月桂酸乙酯乳酸乙酯异戊酸乙酯1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0醛类己醛-2-乙缩醛2-呋喃甲醛苯甲醛辛醛-2-乙缩醛乙醛醇类11 12 64-19-7 300-85-6 503-74-2 142-62-1 111-14-8 124-07-2 4023-65-8 107-92-6 112-05-0总量123-66-0 141-78-6 106-32-1 105-54-4 628-97-7 110-38-3 123-92-2 539-82-2 109-21-7 106-30-9 106-33-2 97-64-3 108-64-5总量3658-93-3 1998-1-1 100-52-7 54889-48-4 75-07-0总量71-23-8 143-08-8 123-51-3 1960-12-8 78-83-1 71-36-3 112-30-1 589-98-0 628-99-9 111-87-5 626-89-1 543-49-7总量正丙醇正壬醇异戊醇苯基乙醇2-甲基-1-丙醇正丁醇1-癸醇3-辛醇2-壬醇正辛醇4-甲基-1-戊醇2-庚醇8.39±0.32 ND 1.45±0.01 0.54±0.02 0.10±0.01 0.18±0.03 0.49±0.03 ND 0.43±0.01 11.58±0.45 18.31±0.23 12.46±0.52 8.65±0.15 5.80±0.09 2.47±0.11 1.93±0.03 2.34±0.05 3.90±0.07 1.08±0.02 2.79±1.65 1.25±0.02 1.54±0.06 2.41±0.03 64.84±3.03 18.11±0.23 2.77±0.02 1.80±0.03 1.90±0.15 0.29±0.16 24.87±0.59 3.45±0.02 1.06±0.02 2.65±0.04 0.57±0.02 0.66±0.02 0.85±0.03 0.51±0.01 0.38±0.01 0.57±0.01 ND ND 0.45±0.08 11.15±0.26 0.31±0.01 2.63±0.30 1.21±0.02 0.37±0.01 0.14±0.00 0.13±0.01 0.41±0.03 0.04±0.02 0.23±0.01 5.47±0.41 5.47±0.07 10.78±0.20 4.49±0.05 4.20±0.01 2.98±0.24 2.58±0.05 2.22±0.01 1.21±0.01 5.33±0.02 0.87±0.02 1.50±0.01 1.61±0.04 1.14±0.00 44.38±0.73 5.46±0.07 1.74±0.01 2.48±0.08 0.21±0.01 0.43±0.01 10.33±0.16 1.61±0.11 1.65±0.01 0.74±0.02 0.79±0.02 0.70±0.01 0.96±0.07 0.41±0.00 0.53±0.01 0.22±0.00 0.60±0.01 0.32±0.01 0.11±0.01 8.64±0.28 0.43±0.01 1.32±0.30 1.09±0.01 0.21±0.03 0.12±0.01 ND 0.22±0.01 0.08±0.01 0.13±0.02 3.60±0.40 5.09±0.00 2.05±0.07 5.42±0.03 1.76±0.02 3.29±0.20 3.76±0.01 3.16±0.02 1.67±0.00 ND 1.12±0.00 1.79±0.04 1.39±0.05 0.52±0.00 31.02±0.44 5.09±0.01 1.12±0.01 ND 0.46±0.03 0.83±0.01 7.50±0.06 1.25±0.00 1.47±0.01 0.71±0.01 0.74±0.02 0.70±0.01 0.24±0.01 0.36±0.00 0.29±0.00 0.28±0.00 0.46±0.00 0.39±0.01 0.10±0.00 6.99±0.07
续表
注：“ND”表示未检出。
序号种类 CAS 化合物含量/（mg·L-1）酒样J_2_21 酒样J_2_22 酒样J_2_23 1 2 3 4 5 6酮类593-08-8 111-13-7 821-55-6 112-12-9 14476-37-0 4485-09-0总量2-十三烷酮仲辛酮2-壬酮2-十一酮4-十一烷酮4-壬酮0.65±0.04 0.93±0.03 0.72±0.01 0.52±0.01 0.38±0.01 0.45±0.08 3.65±0.53 1.13±0.02 0.83±0.00 0.47±0.00 0.40±0.00 0.30±0.00 0.11±0.00 3.24±0.02 1.03±0.01 0.36±0.00 0.42±0.00 0.43±0.00 0.43±0.01 0.10±0.00 2.77±0.02
酸类物质是白酒中重要的呈香呈味物质，起到消除苦味，调节口感的作用，与其他香味物质共同构成了白酒的特殊芳香[26]。由表1可知，随着贮存年份的增加，酱香型白酒二轮次基酒样品中的酸类物质总量呈上升趋势，与宋丽等[27]研究中总酸含量随着贮存时间增加呈上升趋势的结果一致，这可能是醇、醛的氧化和酯的水解导致[28]。其中，乙酸在2021年酒样中含量[（8.39±0.32）mg/L]明显高于2022年[（0.31±0.01）mg/L]和2023年[（0.43±0.01）mg/L]；丁酸与乙酸含量变化不同，是随着贮存年份的增长呈下降趋势，在2022年和2023年酒样中含量分别为（0.04±0.02）mg/L和（0.08±0.01）mg/L，而在2021年酒样中未检测出；而己酸、异戊酸与丁酸含量变化相反，随着贮存年份的增长呈增长趋势；DL-3-羟基丁酸在2022年基酒样品中含量为（2.63±0.30）mg/L，而在2021年中未检测出，因此，DL-3-羟基丁酸含量与贮存时间的相关性有待进一步研究。
酯类物质是白酒中具有芳香气味的化合物，主要起到呈香作用[29]。由表1可知，在各类挥发性风味物质中，酯类物质总含量最高。在所有年份酱香型白酒二轮次基酒中，正己酸乙酯、乙酸正丙酯、辛酸乙酯和丁酸乙酯均为含量较高的4种酯类，且均随着贮存时间的增加而呈升高趋势，这可能是由于酸和醇可能发生酯化反应导致酯类物质含量上升。酯类物质总量随贮存年份的增加总体呈上升趋势，与胥佳等[30]研究中贮存1～3年原酒中酯类物质明显降低的结果不一致，原因可能是两种香型生产工艺、酿造原料等条件不同，导致基酒中酯类物质变化不同；而与吴慧珠等[31]研究中自然贮存时大部分酯类物质含量均在以不同的速度增长的结果一致，因此酯类物质的变化可能受贮存温度的影响。
醛类物质是协调白酒香味的重要成分[32]。由表1可知，在各类挥发性风味物质中，醛类化合物的整体含量较高，仅次于酯类化合物，其骨架成分有己醛-2-乙缩醛、2-呋喃甲醛、苯甲醛、辛醛-2-乙缩醛、乙醛等；己醛-2-乙缩醛占其绝对量，且随着贮存时间的增长明显升高，在2021年、2022年和2023年二轮次基酒中含量分别为（18.11±0.23）mg/L、（5.46±0.07）mg/L和（5.09±0.01）mg/L；乙醛具刺激性气味，赋予新酒刺激感[33]，在2023年酒样中含量较高，为（0.83±0.01）mg/L，随着贮存时间的延长，其含量逐渐减少，其与醛类物质总量变化趋势相反，这可能就是白酒贮存时间越长越柔和的原因；同时醛类物质往往具有令人愉悦的香味，如2-呋喃甲醛具有杏仁香气和焦糖甜味[33]，其在不同年份基酒中含量仅次于己醛-2-乙缩醛，且在2021年酒样中含量最高，这也可能是2021年基酒甜香较其他年份高的原因。
醇类物质是白酒中醇甜和助香剂的主要物质来源，也是形成香味物质的前驱物质，在白酒中占有重要地位[33]。由表1可知，在不同年份二轮次基酒中，高级醇含量丰富，包括正丙醇、正壬醇、异戊醇、苯基乙醇、2-甲基-1-丙醇、正丁醇、2-辛醇、1-癸醇、3-辛醇等；其中绝大部分醇类物质含量变化规律一致，随着贮存时间延长呈升高趋势，与黄琴等[34]的研究结果一致，这可能是因为陈酿过程中酯类物质水解产生。
酮类物质往往可使酒体色泽泛微黄，主要为白酒提供愉快的芳香和蜂蜜般的甜味[23]。由表1可知，酮类物质总含量随贮存年份逐年增长，由2023年（2.77±0.02）mg/L增长至2021年的（3.65±0.53）mg/L，这与曹玉发等[35]研究中随贮存年份延长不同年份样品中酮类化合物含量呈上升趋势的结果一致；2-十三烷酮和仲辛酮在不同年份二轮次基酒中含量均较高；不同贮存年份二轮次基酒中酮类物质含量不同，仲辛酮、2-壬酮和4-壬酮随贮存年份延长呈现升高的趋势，2-十一酮和4-十一烷酮呈现先下降后升高的趋势。
2.3 基于挥发性风味物质含量不同年份酱香型白酒二轮次基酒的多元统计学分析
2.3.1 主成分分析
基于挥发性风味物质含量对不同年份酱香型白酒二轮次基酒进行PCA，结果见图3。
图3 基于挥发性风味物质含量不同年份酱香型白酒二轮次基酒的主成分分析得分图
Fig.3 Score plot of principal component analysis of second-round base liquor of sauce-flavor Baijiu with different aging years based on the contents of volatile flavor substances
由图3可知，主成分1（principal component 1，PC1）的方差贡献率为63.7%，PC2的方差贡献率为29.1%，前两个主成分的累计方差贡献率为92.8%，说明数据的可靠性与稳定性较好，在测定过程中未出现明显偏差。由图3亦可知，不同年份酱香型白酒二轮次基酒样品分离效果较好，表明不同年份酱香型白酒二轮次基酒样品中的挥发性风味成分含量存在较大差异。
2.3.2 OPLS-DA模型建立及模型预测与验证
OPLS-DA可根据各组的特征变量，确定样本之间的关系，更好地获取组间差异信息[23]。为准确鉴定不同年份酱香型白酒二轮次基酒挥发性风味成分的差异，基于挥发性风味物质含量对不同年份酱香型白酒二轮次基酒进行OPLS-DA，并经过200次置换检验以评估OPLS-DA模型是否过度拟合数据，结果见图4。
图4 基于挥发性风味物质含量不同年份酱香型白酒二轮次基酒正交偏最小二乘-判别分析（a）及模型200次置换检验（b）结果
Fig.4 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis (a) and 200 permutation test (b) results of second-round base liquor of sauce-flavor Baijiu with different aging years based on the contents of volatile flavor substances
由图4a可知，不同年份酱香型白酒二轮次基酒样品能明显被区分。由图4b可知，该模型因变量解释率R2Y为0.999，预测能力Q2为0.997，均近于1，说明模型预测能力较好；该模型经过200次置换检验后，R2和Q2的截距分别为0.411和-0.807，R2＞Q2，且Q2在负截距，说明模型不存在过拟合，模型验证可靠。根据OPLS-DA，以变量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1且P＜0.05为筛选条件，从165种挥发性风味物质中筛选出71种挥发性风味物质，包括异戊酸乙酯、正己酸乙酯、二丙基二硫等，基于前20种重要差异风味物质对不同酒样进行聚类分析，结果见图5。
图5 基于前20种重要差异风味物质不同年份酱香型白酒二轮次基酒聚类分析热图
Fig.5 Cluster analysis heat map of second-round base liquor of sauce-flavor Baijiu with different aging years based on the top 20 important differential flavor substances
由图5可知，不同年份酱香型白酒二轮次基酒样品间挥发性风味物质具有明显差异，在2021年二轮次基酒样品中含量较高的差异挥发性风味物质有异戊酸乙酯、正己酸乙酯、二丙基二硫、二氟甲基苯砜、乙酸、正丙醇和己醛-2-乙缩醛；在2022年二轮次基酒样品中含量较高的差异挥发性风味物质有月桂酸乙酯、癸酸乙酯、十六酸乙酯、丙酸正丙酯、乙酸异戊酯、1,1-二乙氧基乙烷；在2023年二轮次基酒样品中含量较高的差异挥发性风味物质有乙酸苯乙酯、乳酸乙酯、苯甲醛、正壬醇、2-十三烷酮和甲基（2-甲基-3-呋喃基）二硫和噻酚-2-乙酰胺。
3 结论
本研究以不同年份酱香型白酒二轮次基酒为研究对象，用HS-SPME-GC-MS技术，结合感官定量描述和主成分分析等，研究了不同年份二轮次基酒风味物质的差异。感官品评表明，不同年份二轮次基酒的香气特征相似，均为酸香、粮香较突出。从不同年份的二轮次基酒中共检出165种挥发性化合物，包括酸类9种、酯类47种、醛类19种、醇类27种、酮类16种及其他类47种，以酸类、酯类、醛类、醇类、酮类为主，且各类挥发性化合物的含量均随贮存年份的增加而升高；结合PCA和OPLS-DA分析表明，不同年份二轮次基酒能明显区分，模型预测能力较高，以VIP值＞1且P＜0.05为筛选条件，筛选出71种重要差异挥发性风味物质，包括异戊酸乙酯、正己酸乙酯、二丙基二硫等。本研究从感官品评和风味物质多维度解析了不同年份二轮次基酒的风味物质差异性，为酱香型白酒酒体设计、风味物质研究提供了理论依据。
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