白酒作为中国传统的独特饮品，历史悠久，文化深厚。中国白酒按香型主要分为酱香型、浓香型、米香型和清香型[1]。清香型白酒风味纯正温和、带有协调的复合香气、入口微甜、后味略带苦味的特点而深受消费者喜爱[2]。酱香型白酒是贵州省支柱产业之一，具有酱香突出，酯香柔雅协调，入口柔绵醇厚，回味悠长的特点[3]。利用清香型和酱香型白酒作为酒基的配制酒，具有更加丰富的口感，风味独特，兼具营养价值。
鹿茸是雄鹿未骨化的幼角，含有丰富的活性成分，富含氨基酸、多肽、蛋白质、糖类，核苷酸，鹿茸的生物活性肽具有抗炎症、抗疲劳、抗氧化、抗骨质疏松、治疗神经系统疾病、抑制器官纤维化、增强免疫力等功效[4-5]，因其具有壮肾阳、益精血、强筋骨的功效，为历代医学所重视。鹿血是指鹿科动物梅花鹿或马鹿的膛血或茸血，是濡养鹿茸的物质，鹿茸中所含的营养成分均溶于茸血中，茸血可谓鹿茸之精华，具有养容美颜、延缓衰老、改善记忆、抗疲劳等功效。它能提高机体免疫力和工作能力，有明显的治疗和保健功效[6]。鹿茸、鹿血的食用方法有很多，其中鹿茸酒具有补肾壮阳、促进新陈代谢的作用；鹿血酒具有补血益精、提高身体免疫力、抗衰老等功效[7]。国内鹿茸酒、鹿血酒主要注重于药用价值和功效研究以及生产工艺和质量控制的探索。何鑫[8]以人参、红景天、鹿茸和黄精为主要原料，对其进行配方配伍实验、工艺和质量标准化、安全性和功能性研究，以此来研制人参红景天鹿茸保健酒；白晨等[9]以不同剂量的鹿茸血酒对昆明种小白鼠进行抗疲劳功能实验，研究发现鹿茸血酒具有一定的抗疲劳效果；陈艳[10]以白酒、马鹿茸、人参、大枣、龙眼肉、枸杞子制作一款鹿血酒，并探究其品质和抗疲劳功能，结果显示不同剂量的鹿血酒对小鼠的抗疲劳能力起到不同程度的促进作用；而刘蓓[11]则从鹿血酒的遗传毒性实验以及相关的稳定性试验指标进行研究。郭艳等[12]通过动物毒理学实验来评价参茸酒的食用安全性，以此来研发保健酒。而国外则多注重于鹿茸、鹿血中的活性成分对人体健康的影响[13-14]。
目前，市场上出现的鹿茸酒和鹿血酒种类较少，缺乏生产工艺标准化、产品风味不稳定。由于鹿茸酒和鹿血酒是在白酒的基础上，通过添加鹿茸和鹿血等主要原料调配而成，白酒基酒的风味对于最终产品的质量具有一定的影响，但现有研究往往忽视了白酒基酒与鹿茸酒、鹿血酒之间的风味差异性。因此，本研究以清香型白酒基酒（FB）、清香型鹿茸酒（FP）、酱香型白酒基酒（MB）、酱香型鹿茸酒（MP）、酱香型鹿血酒（MA）作为研究对象，采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术鉴定并分析了五种酒之间的非挥发性代谢组分差异，采用主成分分析（principl component analysis，PCA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）构建模型，利用变量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）及方差分析P值筛选关键差异代谢物，并进行聚类分析（cluster analysis，CA）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代谢通路分析。旨在为解析鹿茸、鹿血配制酒的风味物质基础提供理论依据，同时也为生产上进一步调控鹿茸酒和鹿血酒风味提供重要的风味导向依据，进而为鹿茸、鹿血制品的研究与开发提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
清香型基酒（FB）（酒精度为53%vol）、清香型鹿茸酒（FP）、酱香型基酒（MB）（酒精度为53%vol）、酱香型鹿茸酒（MP）、酱香型鹿血酒（MA）：贵州某酒业公司。甲醇、甲酸（均为色谱级）：美国Thermo Fisher公司；Direct-Q3超纯水系统：德国Merck公司。
1.2 仪器与设备
Q ExactiveTM HF/Q ExactiveTM HF-X质谱仪、Vanquish UHPLC色谱仪、HypesilGoldcolumn色谱柱（100mm×2.1mm，1.9 μm）：美国Thermo Fisher公司；D3024R低温离心机：美国Scilogex公司。
1.3 方法
1.3.1 LC-MS/MS检测非挥发性代谢物
五种酒样中非挥发性代谢物的测定采用LC-MS/MS法。
非挥发性代谢物提取：取100 μL样本置于EP管中，加入400 μL体积分数为80%甲醇水溶液；涡旋振荡，冰浴静置5 min，15 000×g、4 ℃条件下离心20 min；取一定量的上清液加超纯水稀释至甲醇含量为53%；15 000×g、4 ℃条件下离心20 min，收集上清液，进行LC-MS/MS分析。
空白样本：体积分数为53%甲醇水溶液代替实验样本，前处理过程与实验样本相同。
液相色谱条件：Hypersil Gold column色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱温40 ℃；流速0.2 mL/min；流动相A为0.1%甲酸；流动相B为甲醇。液相色谱梯度洗脱程序见表1。
表1 液相色谱梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution procedure of liquid chromatography
时间/min A相/% B相/%0 1.5 3.0 10.0 10.1 11.0 12.0 98 98 15 0 98 98 98 2 2 8 5 100 2 2 2
质谱条件：扫描范围选择100～1 500 m/z；电喷雾离子（electron spray ionization，ESI）源，喷雾电压3.5 kV；鞘气流速35 psi；辅助气流速10 L/min；离子传输管温度320 ℃；辅助气加热器温度350 ℃；极性为正极和负极；MS/MS二级扫描为数据依赖性扫描。
非挥发性代谢物的鉴定和定量：将下机数据导入CD3.3搜库软件中进行处理，对每个代谢物进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后以第一个质控（qualitycontrol，QC）样本进行峰面积校正，使鉴定更准确，随后设置质量偏差5 mg/kg、信号强度偏差30%、最小信号强度、加合离子等信息进行峰提取，同时对峰面积进行定量，再整合目标离子，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud、mzVault和Masslist数据库进行比对，用空白样本去除背景离子，样本原始定量值（样本代谢物定量值总和/QC1样本代谢物定量值总和）进行标准化处理，得到相对峰面积；并将QC样本中相对峰面积CV＞30%的化合物删除，最后得到代谢物的鉴定和相对定量结果。
使用KEGG数据库（https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html）、HMDB数据库（https：//hmdb.ca/metabolites）和LIPIDMaps数据库（http：//www.lipidmaps.org/）对鉴定到的代谢物进行注释。
1.3.2 质控
质控（QC）样本是从每个实验样本中取等体积样本混匀作为QC样本，每个质控样本的体积、处理和检测方法与样本相同。在信号数据采集的开头，结尾，以及中间部分位点插入QC样本，来记录评估整个质谱数据在采集过程中的信号漂移情况，用于保证代谢组学测定数据的重复性和精确性。
1.3.3 数据分析
采用SPSS 26.0进行实验数据分析，采用SIMCA14.1对最终数据进行主成分分析（PCA）并构建正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）模型，通过计算变量投影重要性（VIP）值，并结合方差分析P值筛选关键差异代谢物（VIP≥1，P＜0.05），并使用Tbtools绘制热图，通过MetaboAnalyst 6.0对代谢物进行KEGG富集分析和通路分析，采用差异倍数（fold change，FC）对差异性成分进行筛选，最后通过微生信网站（https：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制火山图。
2 结果与分析
2.1 五种酒中非挥发性代谢物检测
为深入探究鹿茸酒、鹿血酒与白酒基酒之间非挥发性代谢物的差异，对五种酒检测到的812种代谢物进行处理，保留mzCloud、mzVault和Masslist中至少有一个完全匹配的物质，再去掉Chemical Book中无法查询到的化合物以及没有CAS号的化合物，五种酒中非挥发性代谢物含量测定结果见表2，各类非挥发性代谢物占比见图1。
图1 不同香型白酒、鹿茸酒及鹿血酒中各类非挥发性代谢物占比
Fig.1 Proportion of various categories nonvolatile metabolites in different flavor types Baijiu, deer antler wine and deer blood wine
表2 不同香型白酒、鹿茸酒及鹿血酒中非挥发性代谢物含量测定结果
Table 2 Determination results of non-volatile metabolites contents in different flavor types Baijiu, deer antler wine and deer blood wine
序号 化合物相对含量/%FB FP MB MP MA 1234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44氨基酸类甜菜碱脯氨酸L-焦谷氨酸缬氨酸苏氨酸L-瓜氨酸DL-赖氨酸L-谷胱甘肽（还原型）DL-精氨酸天冬酰胺L-苯丙氨酸L-天冬氨酸L-组氨酸甘氨酰-L-亮氨酸L-谷氨酸L-酪氨酸γ-氨基丁酸N-乙酰-DL-缬氨酸4-乙酰氨基丁酸苯乙酰甘氨酸8-氨基辛酸3-甲基-2-氧丁酸N-乙酰-L-组氨酸4-羟基异亮氨酸4-羟基-L-谷氨酸L-鸟氨酸4-胍基丁酸胱氨酸丙氨酰-酪氨酸2-苯基甘氨酸3-吲哚丙烯酸N-乙酰-DL-谷氨酸D-2-氨基己二酸5-羟基吲哚-2-羧酸亮氨酸脯氨酸D-苯丙氨酸L-高胱氨酸L-苏氨酸N-乙酰-L-亮氨酸N-乙酰-DL-苯丙氨酸氧化谷胱甘肽N-乙酰-L-酪氨酸N-乙酰-D-色氨酸L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸FB 2.00 7.17 4.28 8.57 3.11 1.35 5.10 29.13 0.29 2.38 5.54 5.94 11.10 4.62 12.35 23.55 36.12 10.56 36.07 11.29 71.23 23.22 16.84 17.77 3.03 36.32 36.39 4.44 25.09 17.28 17.11 23.61 14.92 33.35 28.57 55.52 9.12 68.45 47.83 8.82 34.65 5.19 14.63 23.51 FP 25.04 21.24 25.01 17.91 22.20 24.87 27.77 10.67 18.15 22.10 20.79 20.15 18.57 32.89 17.67 15.70 8.83 2.26 15.14 9.13 4.26 6.69 7.33 9.21 25.06 10.95 8.56 0.54 18.75 42.00 15.62 8.64 2.30 5.62 22.94 4.90 1.66 0.41 5.89 8.42 3.09 11.85 24.96 18.46 MB 1.72 2.78 3.49 6.55 1.99 0.55 2.13 18.94 0.20 0.58 4.60 2.76 5.74 2.87 9.69 15.51 9.39 7.52 24.99 8.13 3.53 24.26 7.85 12.05 6.18 14.28 19.13 84.34 15.09 9.70 8.79 14.32 67.48 26.68 16.88 24.37 84.21 29.91 25.49 45.09 16.63 58.48 7.54 21.18 MP 30.24 25.87 25.50 31.73 29.36 16.00 25.00 25.10 30.43 23.18 31.03 23.33 17.61 29.8 20.37 25.58 12.43 2.76 8.70 57.90 11.73 18.03 55.14 39.88 44.41 19.40 32.15 3.92 28.15 13.74 23.72 34.49 4.76 21.94 14.55 10.83 2.48 0.54 11.97 26.75 9.96 17.27 29.52 22.64 MA 41.00 42.93 41.72 35.23 43.35 57.23 40.00 16.16 50.93 51.77 38.04 47.82 46.98 29.77 39.92 19.66 33.24 76.90 15.10 13.56 9.26 27.80 12.83 21.09 21.32 19.04 3.76 6.76 12.91 17.28 34.76 18.93 10.55 12.41 17.06 4.38 2.52 0.69 8.81 10.92 35.67 7.21 23.36 14.21
续表
序号 化合物45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 5-羟基色氨酸有机酸类柠檬酸山梨酸丙二酸没食子酸2-羟基丁酸十五烷酸壬二酸亚油酸肉桂酸衍生物4-羟基肉桂酸3-羟基肉桂酸3-甲氧基肉桂酸4-甲氧基肉桂酸糖类L-艾杜糖醇D-氨基葡萄糖蔗糖葡糖酸D-甘露醇葡糖酸内酯葡萄糖-1-磷酸D-棉子糖半乳糖醛酸β-环糊精6-脱氧-D-葡萄糖L-（-）-阿拉伯醇海藻糖D-葡萄糖酸N-乙酰-D-葡萄糖胺脂类2-异丙基苹果酸丁二酸二乙酯单油酸甘油酯1-棕榈酸单甘油酯硬脂酸二十二碳五烯酸月桂酸乙酯2-羟基-3-甲基丁酸戊酸丙戊酸壬酸2-甲基戊二酸十一烷二酸10-十一烯酸相对含量/%FB FP MB MP MA 19.10 25.37 12.12 10.90 32.50 3.73 2.94 5.76 11.33 9.09 15.44 36.49 45.19 38.33 0.22 22.37 19.77 14.97 0.32 0.32 2.71 3.31 95.47 4.32 10.34 14.01 77.86 77.86 41.23 22.26 0.66 33.00 57.39 25.68 4.42 4.42 5.89 32.37 0.71 34.54 1.17 36.25 1.97 1.97 4.97 4.60 25.29 72.65 14.16 19.50 21.49 2.84 13.86 3.56 3.01 17.11 7.04 34.00 15.65 2.77 37.57 38.33 34.55 4.62 27.37 0.51 2.79 28.35 3.14 2.54 48.03 8.30 0.21 17.85 2.96 1.36 25.94 21.53 3.63 3.86 1.35 25.46 6.71 40.13 0.72 4.47 10.83 27.76 17.64 26.41 15.87 1.64 19.75 30.66 26.15 94.75 2.15 5.71 4.27 94.55 32.74 8.92 0.21 15.44 1.67 21.70 68.03 14.62 8.79 4.28 2.10 40.64 13.56 29.99 1.40 8.00 32.26 32.73 23.29 3.42 35.00 2.40 16.02 53.64 39.62 1.28 28.97 45.67 22.47 0.79 6.77 39.69 39.10 25.78 65.54 26.07 1.99 28.09 3.28 26.09 2.61 78.29 5.79 42.66 40.01 44.40 52.20 15.61 2.46 5.88 12.31 46.29 87.50 36.77 5.37 5.05 26.85 9.57 6.57 1.03 1.86 1.07 0.90 0.51 1.26 3.27 5.48 3.20 76.80 9.67 4.56 26.21 23.69 21.60 40.13 65.14 1.30 84.37 83.99 34.74 3.42 46.43 5.25 1.36 24.44 8.49 16.15 31.12 3.16 5.14 50.22 2.48 1.00 7.49 0.57 6.98 9.97 5.64 38.36 13.07 13.58 1.86 2.65 13.04 45.12 6.76 1.45 8.21 3.01 6.63
续表
序号 化合物87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 16-羟基十六烷酸3-甲基己二酸辛二酸癸二酸胺类组胺酪胺十八胺醇类吡哆醇D-奎尼酸维生素类维生素B2泛酸烟酰胺呋喃酮类L-抗坏血酸苯类苯乙醛酸二苯胺苯乙烯2-氨基苯磺酸4-羟基-3-甲基苯甲酸邻苯二甲酸-丁酯5-氨基水杨酸苯丙炔酸苯丙酮酸二苯甲酰硫胺素2-苯基丙酸吲哚羧酸类DL-色氨酸3-吲哚丙烯酸DL-吲哚-3-乳酸L-色氨酸核苷酸类5'-腺苷酸其他类4-吗啉基苯甲酸L-蛋氨酸甲酯L-酪氨酸甲酯亚麻酸6-磷酸葡萄糖酸2-（甲酰氨基）苯甲酸4-（辛氧基）苯甲酸D-果糖-6-磷酸10-羟基癸酸相对含量/%FB FP MB MP MA 19.84 9.15 14.19 33.47 14.83 1.97 4.03 4.60 34.29 77.14 65.90 20.90 11.82 6.24 6.99 38.45 19.22 5.50 8.88 2.57 4.48 28.40 56.41 9.15 15.18 3.31 2.86 18.86 32.29 58.06 27.61 3.29 25.48 9.95 4.70 23.55 1.48 12.52 22.59 14.78 4.16 25.76 38.54 23.38 33.24 30.70 4.30 25.27 6.34 26.43 20.98 14.48 2.27 12.39 42.44 12.62 19.30 6.04 54.38 22.07 0.32 24.28 0.21 20.74 54.45 55.33 12.64 24.79 19.23 25.89 22.60 40.37 14.49 16.49 20.05 62.45 1.10 6.05 14.00 20.30 12.43 6.53 7.35 11.46 14.03 16.18 4.01 38.84 71.35 17.70 10.66 16.24 58.15 29.97 8.42 13.82 10.73 22.67 2.34 4.39 25.12 23.11 23.82 8.22 14.53 23.56 24.73 23.20 5.03 2.39 5.57 18.39 26.69 21.62 4.50 7.78 42.08 30.93 29.84 5.84 3.81 6.37 14.22 7.14 28.38 24.07 17.11 29.33 1.77 3.38 9.10 4.00 22.98 23.93 52.09 32.78 43.06 42.25 7.48 26.75 37.04 12.34 17.88 12.47 20.27 27.07 32.04 17.66 29.69 6.05 22.54 51.25 31.71 37.86 7.08 34.98 14.40 7.28 8.99 8.48 1.29 7.95 3.90 12.38 24.66 11.40 38.58 4.06 12.70 25.73 24.95 52.96 41.15 3.33 44.40 10.99 39.80 44.22 19.53 16.05 2.70 12.31 4.98 12.13 13.45 41.10 12.06 2.20 19.33 2.58
由表2可知，5种酒样共检出124种非挥发性代谢物，其中氨基酸类45种，有机酸类8种，肉桂酸衍生物4种，糖类15种，脂类18种，胺类3种，醇类2种，维生素类3种，呋喃酮类1种，苯类11种，吲哚羧酸类4种，核苷酸类1种，其他类9种，这些代谢物大致代表了鹿茸酒和鹿血酒的非挥发性成分。通过图1和表2的比对分析，可以看到白酒基酒加入鹿茸和鹿血后，五种酒的非挥发性代谢物差异更多在含量上，而非在种类上。由图1可知，FB和MB中非挥发性代谢物主要以氨基酸类和脂类占主导地位，而FP、MP和MA则以氨基酸类和糖类为主。接下来将重点讨论差异明显且对风味影响较大的氨基酸类、脂类和糖类化合物。
氨基酸类是五种酒中非挥发性代谢物最主要的组成成分。FB和MB中的氨基酸主要来源于谷物的发酵过程，不仅为白酒贡献“甜味”和“鲜味”，而且还能中和酸味和碱味，对改善白酒的味觉特征有一定的贡献[15]。而FP、MP和MA中的氨基酸一部分来源于鹿茸和鹿血[16-17]，另外一部分可能来源于山药、枸杞富含的活性成分。FB中D-苯丙氨酸、L-高胱氨酸、L-苏氨酸、N-乙酰-L-亮氨酸等含量高于FP。相反FP中的甜菜碱、L-焦谷氨酸的含量分别是FB的13倍、6倍，甜菜碱含量增加可能是由于在FP中加入的枸杞子本身富含这种成分。L-焦谷氨酸与其他一些有机化合物生成衍生物，而多数衍生物具有一定的抗菌活性[18]。MB中的L-高胱氨酸、D-2-氨基己二酸和胱氨酸高于MP和MA。与MB相比，L-谷胱甘肽（还原型）、苯乙酰甘氨酸、缬氨酸、苏氨酸、D-葡萄糖酸等在MP中含量较高，而N-乙酰-DL-缬氨酸、L-瓜氨酸、氧化谷胱甘肽、天冬酰胺等在MA中含量较高。
脂类物质在白酒风味和健康方面扮演着重要的角色。丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、十一烷二酸、二十二碳五烯酸是FB中主要的脂类。相比之下，FP中脂类含量以2-异丙基苹果酸、单油酸甘油酯含量较高，其余脂类化合物的含量低于FB。而2-异丙基苹果酸、丙戊酸、壬酸、3-甲基己二酸、辛二酸等脂类代谢物在MB中占主导地位，而MP和MA中单油酸甘油酯、戊酸含量均高于MB。糖类物质是FP、MP和MA中重要的组成部分。本研究共检测出15种糖类，FP中葡萄酸、D-葡萄酸、D-棉子糖含量高于FB；MP中D-葡萄糖酸、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-氨基葡萄糖等代谢物含量高于MB；MA与MB相比，蔗糖、β-环糊精、葡萄糖-1-磷酸、D-棉子糖等代谢物在MA中含量较高。其中β-环糊精具有除苦除涩的作用[19]，这一特性在改善MA的口感和风味方面发挥了重要作用。然而，值得注意的是，尽管MP中的氨基酸种类丰富，但在大部分氨基酸的含量上还是低于MA，这与赵卉等[20]研究结果一致。
2.2 五种酒中非挥发性代谢物主成分分析
主成分分析（PCA）可以对相关变量进行归类，从而降低数据维度。五种酒非挥发性代谢物的主成分分析结果见图2。由图2可知，同一组平行样品的酒类聚集在一起，表明样品之间的重复性较好，所有样本都在95%置信区间内。主成分（principl component，PC）1的方差贡献率为47.1%，PC2的方差贡献率为18.8%，两个主成分累计方差贡献率达到65.9%，前两个主成分基本保留了原始变量的大部分信息。其中FB和FP具有明显的分离趋势，表明二者的非挥发性代谢物组成差异较大；MP和MA在PC1上的分布比MB更接近，这表明MP和MA的非挥发性代谢物组成差异较小。
图2 不同香型白酒、鹿茸酒及鹿血酒非挥发性代谢物的主成分分析结果
Fig.2 Principal component analysis results of non-volatile metabolites of different flavor types Baijiu, deer antler wine and deer blood wine
2.3 五种酒中非挥发性代谢物正交偏最小二乘-判别分析
为了进一步对特征非挥发性代谢物进行筛选，引出一种有监督模式的识别方法，对五种酒进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），结果见图3。
图3 不同香型白酒、鹿茸酒及鹿血酒非挥发性代谢物的正交偏最小二乘-判别分析结果
Fig.3 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis results of non-volatile metabolites of different flavor types Baijiu,deer antler wine and deer blood wine
由图3可知，两个主要成分的累计方差贡献率为65.2%，此外，得分图中所有点置于95%的置信区间内，这意味着分析结果具有很高的可靠性。FP与MA、MP距离较接近，表明这三种不同配制酒的非挥发性代谢物的组成和含量相似，而FB和FP组间分离效果明显，说明二者非挥发性代谢物的组成和含量存在较大差异。结果表明，通过OPLS-DA能够有效区分五种酒，这为后续的特征代谢物筛选和深入研究提供了坚实的基础。
2.4 关键差异代谢物聚类分析
聚类分析将不同样本中表达模式相似或相同的代谢物归为一类，从而推断它们可能具有相似的功能并参与同一代谢过程，这种方法有助于揭示未知代谢物的功能以及已知代谢物的未知功能[21-22]。在OPLS-DA模型的基础上，以VIP≥1和P＜0.05为标准，五种酒共筛出43个关键差异代谢物。对43个差异代谢物进行聚类分析，结果见图4。
图4 不同香型白酒、鹿茸酒及鹿血酒关键差异代谢物聚类分析热图
Fig.4 Heat map of cluster analysis of key differential metabolites of different flavor types Baijiu, deer antler wine and deer blood wine
由图4可知，5种酒中关键差异代谢物被聚为两个类别，MA与MP聚为一类，FB、FP和MB聚为一类，且红色表示表达含量高，蓝色表示表达含量低。FP与FB相比，葡萄酸在FP中具有高表达。葡萄酸又称外消旋型酒石酸，它是配制酒中的一类酸味调节剂，它具有较好的涩感，可以提高酒液的骨架感和丰满感[23]。MA和MP与MB比较，N-乙酰-DL-缬氨酸、L-瓜氨酸、3-吲哚丙烯酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、蔗糖、苯丙炔酸、2-羟基丁酸、泛酸在MA中含量较高。在MA中，N-乙酰-DL-缬氨酸含量是MB中十倍之多。它作为缬氨酸支链的衍生物，其来源丰富多样，一部分来源于高温大曲[24]，另外一重要部分来源于鹿血[25]。N-乙酰-L-组氨酸、苯乙酰甘氨酸、4-羟基异亮氨酸、D-葡萄糖酸、没食子酸、组胺、维生素B2、L-酪氨酸甲酯在MP中含量较高。没食子酸具有抗氧化活性，可以有效的清除自由基并抑制氧化反应[26]。在MP中，这种抗氧化作用有助于保护MP的品质，防止MP在陈放过程中被氧化，从而保持其原有的风味和色泽。另外，没食子酸有助于降低心血管疾病、糖尿病和帕金森病发生的风险，通过防止或减缓在人体内的分子氧化应激[27-28]。MP中组胺含量是MB的二十倍，原因是MP中加入的鹿茸本身含有组胺[29]。
2.5 关键差异代谢物火山图分析
以VIP≥1和P＜0.05为标准，总共筛选出43种关键差异代谢物，并通过火山图展示其代谢物之间的差异，结果见图5。
图5 不同香型白酒、鹿茸酒及鹿血酒关键差异代谢物分析火山图
Fig.5 Volcano plots of key differential metabolites analysis of different flavor types Baijiu, deer antler wine and deer blood wine
选择差异倍数（fold change，FC）值最大的前5个上调差异代谢物和最大的前5个下调差异代谢物标记在图（5-A、5-B、5-C）。由图5可知，MA和MB之间差异代谢物最多，总共27个，包括MA上调13个，MB上调14个，MB中的壬酸、十五烷酸含量是MA的39倍以上，壬酸是合成对应高级脂肪酸酯的前体物质[30]。而MA中的L-瓜氨酸含量是MB的104倍，L-瓜氨酸对血管具有明显的保护作用，能够有效维护血管健康，更重要的是，它能够通过直接和间接的作用影响心脏代谢健康[31]。其次是MB和MP组差异代谢物有23个，包括MB上调12个，MP上调11个；MP中的戊酸、L-瓜氨酸含量是MB的29倍以上，而MB中的山梨酸、壬酸含量是MP的58倍以上。山梨酸具有一定的酸味和涩味，能够调节酒体的口感，使其更加醇厚、柔和。FB和FP之间差异代谢物最少，有19个，包括FB上调12个，FP上调7个，其中L-瓜氨酸、葡萄酸在两组之间的差异倍数分别为25倍、17倍。
2.6 关键差异代谢物KEGG代谢通路分析
将43种关键差异代谢物输入MetaboAnalyst6.0中进行富集分析和代谢途径分析，结果见图6。
图6 不同香型白酒、鹿茸酒及鹿血酒关键差异代谢物的富集分析（a）和代谢途径（b）
Fig.6 Enrichment analysis (a) and metabolic pathway (b) of key differential metabolites of different flavor types Baijiu, deer antler wine and deer blood wine
由图6可知，五种酒中非挥发性代谢物的KEGG富集分析结果，横坐标表示通路的富集率（enrichment ration，ER），纵坐标为富集到的前25条通路，颜色越红代表其越显著。由图6A可知，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；苯丙氨酸代谢；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；泛酸和辅酶A（coenzyme A，CoA）的生物合成；硫胺素代谢；牛磺酸和低牛磺酸的代谢；半胱氨酸和蛋氨酸代谢的富集率较高（ER＞10）且较为显著。通路分析的气泡图中每一个气泡代表一个代谢途径：气泡越大，表示信号通路影响（pathway impact，PI）越大（基于拓扑分析）；颜色越深，P值越小（富集分析），该途径的富集程度越显著。由图6B可知，总共获得28条代谢途径，基于PI＞0.1和P＜0.05确定7条关键代谢途径：包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；苯丙氨酸代谢；半胱氨酸和蛋氨酸代谢；酪氨酸代谢；乙醛酸和二羧酸代谢；丙酮酸代谢。通过对关键代谢途径注释到的关键差异代谢物综合分析可知，L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-高胱氨酸与7条关键代谢途径有关，可以作为区分五种酒的重要依据。
3 结论
本研究通过对清香型白酒基酒（FB）、清香型鹿茸酒（FP）、酱香型白酒基酒（MB）、酱香型鹿茸酒（MP）、酱香型鹿血酒（MA）的非挥发性代谢物进行测定分析，五种酒共检出124种非挥发性代谢物，其中氨基酸类45种，有机酸类8种，糖类15种，脂类18种等。通过PCA、OPLS-DA均能有效区分五种酒。以VIP≥1和P＜0.05为标准，共筛出43个关键差异代谢物，通过聚类分析，五种酒中MA与MP聚为一类，FB、FP和MB聚为一类。KEGG富集分析结果表明，五种酒关键差异代谢物大多数与氨基酸的代谢过程相关。代谢途径分析结果表明，L-苏氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-高胱氨酸等可以作为区分五种酒的重要依据。本研究探讨了鹿茸酒、鹿血酒与白酒基酒在非挥发性代谢物组成方面的特征，不仅表明基于LC-MS/MS的代谢组学技术对鉴别酒的组成具有可行性，还为完善其风味化学理论体系提供了有力支持。
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