随着经济水平的快速提高及蜂产品所具有的各种营养特性，近年来蜂产业迎来高速发展期[1-3]。目前，尽管我国是世界上第一大蜂产品生产国和出口国，但由于产品质量参差不齐，出口单价较低，导致我国蜂产品出口产值低于新西兰[4-6]。农兽药残留是导致我国蜂产品质量较低的重要因素[5]。蜜蜂在生长过程中不可避免的会接触兽药，且蜜蜂在生产蜂蜜等蜂产品时所采集的花粉可能涉及到农药的使用，这会造成农药及兽药经生物富集迁移至蜂蜜、蜂花粉和蜂王浆等蜂产品中[7-9]。残留于蜂产品中的农兽药通过膳食摄入进入人体后，可能会造成肝脏、肾脏、神经及造血功能损伤等不利影响[10-12]。因此，监控蜂产品中农兽药残留是提高蜂产品质量，推动蜂产业高质量发展的重要措施。
目前，蜂产品中农兽药残留常用的监测方法主要有气相色谱（gas chromatography，GC）法[13]、液相色谱（liquid chromatography，LC）法[14]、气相色谱-三重四级杆质谱（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS）法[15-17]，液相色谱串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法等[18-20]。近些年，基于LC-MS/MS法的高灵敏度及易操作性被广泛应用[21]。黄华等[22]利用液相色谱-串联质谱法建立了蜂王浆中苯菌灵、乙基硫菌灵及多菌灵等15种高风险农药的测定方法。超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法测定蜂产品中的农兽药残留多为正离子模式，而某些兽药在负离子模式下响应更好，如氯霉素类兽药中的氟苯尼考、甲砜霉素及氯霉素等[23-24]。因此，本研究选取了近五年全国食品安全监督抽检中检出率较高的农药及兽药作为待测目标物，其涉及磺胺类、氯霉素类、喹诺酮类、糖皮质激素类、硝基咪唑类、抗菌剂类、氨苯砜类共7类兽药25种化合物及新烟碱类和苯并咪唑类共2类农药6种化合物，通过对样品前处理条件及色谱、质谱条件进行优化，采用正负离子切换的多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，建立UPLC-MS/MS法同时测定蜂产品中31种农兽药残留的分析方法，并评估其膳食暴露风险，以期为蜂产品质量监测提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料206个蜂产品（蜂蜜样品142个、蜂花粉样品51个、蜂王浆样品13个）：采集自重庆市各区县。
1.1.2 试剂
甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵（均为色谱纯）：德国Merck公司；31种农兽药标准品（磺胺甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、依诺沙星、地塞米松、甲基波尼松龙、可的松、甲硝唑、地美硝唑、洛硝哒唑、苯硝咪唑、二甲氧苄啶、维吉尼霉素M1、氨苯砜、噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、啶虫脒、杀虫脒、多菌灵）（纯度均≥98%）：天津阿尔塔科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
AB4500QTRAP超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪：美国ABSciex公司；Vortex1涡旋混合仪：德国IKA公司；Milli-Q Advantage A10超纯水机：美国Millipore公司；Autovap S60水浴氮吹仪：美国ATR公司；AG-SPE-24固相萃取仪：上海欧戈电子有限公司；GRINDOMIX GM 200刀式混和研磨仪：弗尔德（上海）仪器设备有限公司；Sigma 4-16S高速冷冻离心机：德国西格玛公司；SP-1002零污染制样碎研机：天津拓至明实验仪器设备有限公司；KQ-800DE型数控超声波仪：昆山市超声仪器有限公司；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（200 mg）：美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
分别称取各标准品10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀后即得质量浓度为1 mg/mL的标准储备液。分别吸取各标准储备液0.1 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀后得质量浓度为1 μg/mL的混合标准母液。采用体积分数为10%甲醇水溶液，按线性范围分别稀释为质量浓度为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5 ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL及250 ng/mL的混合标准工作液。
1.3.2 样品前处理条件
将蜂蜜、蜂王浆分别混合均匀，蜂花粉用碎研机研磨3 min。精密称取蜂产品5.00 g，置于50 mL离心管中，加入20 mL体积分数为80%乙腈-水溶液（含0.2%甲酸），120 W超声提取2 min，5 ℃条件下10 000 r/min离心5 min。精密量取离心后的上清液10 mL过Oasis PRiME HLB固相萃取柱，流速0.5滴/s，收集萃取液并氮吹吹干，加入1 mL体积分数为10%甲醇水溶液复溶，混匀过0.22 μm微孔滤膜后上机分析。
1.3.3 仪器条件
超高效液相色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为甲醇，流动相B为5 mmol/L乙酸铵-水溶液；流速0.2 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL；梯度洗脱程序：0～1.5 min，10%A；1.5～11.0 min，10%～90% A；11.0 ～12.0 min，90% A；12.0 ～12.1 min，90%～10%A；12.1～14.0 min，10%A。
质谱条件：电喷雾离子（electrospray ionization，ESI）源，多反应离子监测，正负离子切换模式，电离电压为正离子5 000 V，负离子3 500 V；气帘气为30.0 psi，雾化气为50.0 psi，辅助气为50 psi；离子源温度为500 ℃。
1.3.4 质谱条件优化
采用蠕动泵进样方式分别将1.0 mg/mL的标准储备液泵入质谱，采用手动优化模式，选择正离子模式，先找到目标化合物母离子，优化去簇电压、电离电压、气帘气、雾化气，辅助气、碰撞气体密度及离子源温度等质谱相关参数，以获得母离子的最大离子响应强度。再采用子离子优化模式，选择两个相对强度较高的子离子，分别优化碰撞能量以获得两个子离子的最大响应强度。采用负离子方式重复以上优化过程，得到使31种化合物响应最高的质谱参数。
1.3.5 色谱条件优化
流动相的选择：比较5 mmol/L乙酸铵-水溶液+甲醇、5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸-水溶液+甲醇、5 mmol/L乙酸铵-水溶液+乙腈、5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸-水溶液+乙腈对31种农兽药化合物离子化效率的影响。
色谱柱的选择：分别考察Agilent Infinity Lab Poroshell 120 C18毛细管色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、Agilent Infinity Lab Poroshell 120 C8毛细管色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18毛细管色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C8毛细管色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3毛细管色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Thermo Scientific Hypersil GOLD C18毛细管色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）对31种农兽药化合物的分离效果。
1.3.6 样品前处理条件优化
配制10 mL质量浓度为10 ng/mL的31种农兽药化合物混合标准工作液并注入Oasis PRiME HLB固相萃取柱，调节固相萃取装置的负压范围来控制滤出流速，收集滤液并氮气吹干，加入1 mL体积分数为10%甲醇水溶液复溶，过0.22 μm微孔滤膜后测定31种化合物的含量，以回收率（测定值/理论值×100%）为评价指标，考察滤出流速（0.5滴/s、1滴/s、2滴/s、3滴/s）对固相萃取效果的影响。
1.3.7 方法学考察
标准曲线回归方程、检出限及定量限：采用优化后的前处理方法及仪器条件对31种农兽药混合标准工作液进行测定，以定量离子的峰面积（Y）为纵坐标，对应的质量浓度（X）为横坐标拟合得到各物质的线性回归方程。分别以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）确定31种农兽药的方法检出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantitation，LOQ）。
加标回收率及精密度试验：分别在空白的蜂蜜、蜂花粉及蜂王浆样品中分别加入5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg 3个质量浓度水平的标准品，每个质量浓度设置5个平行，采用优化后的前处理方法及仪器条件进行测定，并计算各化合物的加标回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.3.8 膳食风险评估
基于206份重庆市各区县蜂产品的农兽药残留测定结果，利用膳食暴露评估方法对重庆市蜂产品中不同农兽药残留的膳食暴露风险进行评估[25]。按下式计算各农兽药残留的食品安全指数（food safety index，IFS），若IFS＜1表明该化合物的膳食暴露风险可接受，IFS＞1表明该化合物的膳食暴露风险较高，需加强控制。
式中：IFS为农兽药残留的食品安全指数；f为农兽药安全摄入量的校正因子，本研究设f=1；SI为农兽药的安全摄入量，μg/（kg·d），本研究参考GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》、GB 31650.1—2022《食品安全国家标准食品中41种兽药最大残留限量》和GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定的每日允许摄入量（acceptable daily intake，ADI）；bw为人均体质量，kg，本研究参照《中国居民营养与慢性病状况报告（2020年）》取我国成人平均体质量60.6 kg；R为蜂产品中农兽药的残留均值，μg/kg；F为蜂产品的每日膳食摄入量，g/d，以《第四次中国总膳食研究》和《中国居民营养与健康状况调查报告》为依据，设置蜂蜜每日摄入量50 g、蜂花粉30 g、蜂王浆10 g。E和F分别为蜂产品的可食部分因子和加工处理因子，均设为1。
1.3.9 数据处理与分析
采用Microsoft Excel 2019进行数据统计，采用Origin 2019绘图，以IBM SPSS 25.0软件中的单因素方差分析进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 质谱条件优化结果
调整质谱相关参数，采用正、负离子两种电离模式优化各化合物的响应值。结果表明，反吹气、雾化气、碰撞气体密度、气化温度等参数对各化合物的响应影响较小，因此，可以采用一致的条件对各化合物进行检测，但在去簇电压和碰撞能量参数上，各化合物间差别较大。氯霉素、氟苯尼考、甲醛霉素在负离子模式下的响应比正离子模式高，应采用负离子电离方式，其余28种化合物正离子模式下的响应优于负离子，应选择正离子电离方式。各化合物的质谱参数见表1。
表1 31种农兽药化合物UPLC-MS/MS检测的质谱参数
Table 1 Mass spectrum parameters of 31 pesticide and veterinary drug compounds detected by UPLC-MS/MS
序号 化合物 母离子（m/z）子离子（m/z）去簇电压/V碰撞能量/eV 1 2 3 4 5磺胺甲嘧啶265.0 70磺胺甲恶唑254.0 70磺胺二甲嘧啶279.0 70磺胺间二甲氧嘧啶311.0 70磺胺间甲氧嘧啶281.0 156.0*92.0 92.0*156.0 186.0*92.0 156.0*92.0 156.0*92.0 70 25 35 35 25 22 35 25 35 25 35
续表
注：子离子中*表示定量离子，无*号表示定性离子。
序号 化合物 母离子（m/z）子离子（m/z）去簇电压/V 6 7 8 9 1 0磺胺喹恶啉301.0 70磺胺嘧啶251.0 70甲氧苄啶291.1 99氯霉素320.9-72氟苯尼考356.0-67 11甲砜霉素353.9-75 12恩诺沙星360.2 71 13环丙沙星332.1 56 14沙拉沙星386.2 105 15依诺沙星321.1 65 16地塞米松393.2 110 17甲基泼尼松龙375.2 110 18可的松361.2 110 19甲硝唑172.0 59 20地美硝唑142.0 69 21洛硝哒唑201.1 59 22苯硝咪唑163.9 74 23二甲氧苄啶261.2 99 24维吉尼霉素M1 526.3 125 25氨苯砜249.0 75 26噻虫嗪292.0 70 27噻虫胺250.0 60 28吡虫啉256.0 62 29啶虫脒223.0 66 30杀虫脒197.1 68 31多菌灵192.0 156.0*108.0 156.0*92.0 230.0*261.0 151.9*256.9 336.0*184.9 289.9*184.9 316.1*245.0 231.1*314.1 299.1*342.1 303.0*234.0 355.0*146.8 357.1*161.1 163.1*121.0 81.7*127.8 95.9*80.7 54.8*139.7 117.8*90.9 245.1*123.1 508.2*355.1 108.1*92.2 211.0*181.0 169.0*131.0 209.3*175.2 126.0*56.0 117.1*125.0 160.0*105.0 70碰撞能量/eV 25 30 25 35 25 20-25-16-15-27-18-28 27 38 47 30 36 26 15 25 10 30 10 25 25 32 34 20 24 36 34 17 30 52 24 20 7 14 21 23 19 10 15 10 18 12 20 16 29 33 16 27
2.2 色谱条件优化
为保证较好的离子化效率，考察不同的流动相配比对各化合物响应强度的影响。结果表明，5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸-水溶液最有利于待测化合物的离子化。因此，选择A相为5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸-水溶液。此外，甲醇和乙腈为常用有机相，对比后发现各化合物经这两种有机相洗脱后均能呈现良好的峰形，且各待测化合物的响应无明显差异，故选用了价格相对便宜的甲醇作为B相。
色谱柱的分离效果极大程度影响着检测方法的灵敏度，因此考察了31种化合物在各类常用色谱柱上的分离效果。结果表明，磺胺类和喹诺酮类化合物在C8和T3毛细管色谱柱上峰形有明显拖尾，在C18毛细管色谱柱上分离效果较好，且不同C18毛细管色谱柱间峰形和分离效果无明显差异，但Waters ACQUITY UPLC BEH C18毛细管色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）颗粒粒径更小，其使得液相系统的压力更大，化合物出峰提前，所需要的时间更低，节约了时间成本，因此，最终选用Waters ACQUITY UPLC BEH C18毛细管色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。基于优化后的质谱及色谱条件，31种农兽药的总离子流色谱图见图1。
图1 31种农兽药化合物的UPLC-MS/MS分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of 31 pesticide and veterinary drug compounds analyzed by UPLC-MS/MS
1.甲硝唑；2.磺胺嘧啶；3.洛硝哒唑；4.地美硝唑；5.多菌灵；6.磺胺甲嘧啶；7.苯硝咪唑；8.二甲氧苄啶；9.甲氧苄啶；10.甲砜霉素；11.杀虫脒；12.氨苯砜；13.噻虫嗪；14.磺胺二甲嘧啶；15.依诺沙星；16.环丙沙星；17.恩诺沙星；18.沙拉沙星；19.磺胺甲恶唑；20.磺胺间甲氧嘧啶；21.氟苯尼考；22.吡虫啉；23.噻虫胺；24.啶虫脒；25.氯霉素；26.磺胺间二甲氧嘧啶；27.磺胺喹恶啉；28.可的松；29.地塞米松；30.维吉尼霉素M1；31.甲基泼尼松龙。
2.3 样品前处理优化结果
基于汪建妹等[26]的结果采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化样品。Oasis PRiME HLB固相萃取柱为通过性固相萃取柱，吸附材料和载液间的作用时间尤为关键。因此，考察不同滤出流速对31种农兽药化合物回收率的影响，结果见图2。由图2可知，当滤出流速为3滴/s时，回收率在80%～120%的化合物仅有5个；当滤出流速为2滴/s时，回收率在80%～120%的化合物数上升至9个；当滤出流速为1滴/s和0.5滴/s时，27个化合物的回收率均达到80%～120%。综合考虑回收率及处理效率，最终选择1滴/s的速度进行固相萃取。
图2 不同滤出流速对31种农兽药化合物回收率的影响
Fig.2 Effect of different flow rates on recovery rates of 31 pesticide and veterinary drug compounds
2.4 方法学考察结果
2.4.1 线性关系及检出限、定量限分析
31种农兽药化合物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限见表2。由表2可知，25种兽药均在质量浓度0.2～100 ng/mL范围内线性关系良好，6种农药均在质量浓度1～250 ng/mL范围内线性关系良好，其相关系数R2在0.995 4～0.999 9之间。31种农兽药的检出限和定量限分别为0.006～0.057 μg/kg和0.021～0.191 μg/kg。
表2 31种农兽药化合物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限
Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient, limits of detection and limits of quantitative of 31 pesticide and veterinary drug compounds
化合物 线性范围/（ng·mL-1） 回归方程 相关系数R2 检出限/（μg·kg-1） 定量限/（μg·kg-1）磺胺甲嘧啶磺胺甲恶唑磺胺二甲嘧啶磺胺间二甲氧嘧啶磺胺间甲氧嘧啶磺胺喹恶啉磺胺嘧啶甲氧苄啶氯霉素氟苯尼考甲砜霉素恩诺沙星环丙沙星沙拉沙星依诺沙星地塞米松甲基泼尼松龙可的松甲硝唑地美硝唑洛硝哒唑苯硝咪唑二甲氧苄啶维吉尼霉素M1氨苯砜噻虫嗪噻虫胺0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 0.2～100 1.0～250 1.0～250 Y=27 119.2X+40 700.2 Y=18 138.2X+954.3 Y=66 548.7X-8 958.4 Y=88 867.2X-16 275.9 Y=30 769.7X+2 975.2 Y=50 601.4X-12 530.3 Y=23 017.8X+64 528.6 Y=31 267.8X+38 417.0 Y=23 153.7X+46 352.5 Y=50 589.4X+122 747.0 Y=8 382.8X+7 748.5 Y=7 082.5X+14 899.7 Y=3 972.7X+7 263.2 Y=12 312.3X+22 251.6 Y=6 641.0X+9 439.8 Y=1 334.3X+58.4 Y=14 098.5X+6 057.5 Y=12 742.7X-505.9 Y=13 915.8X+42 165.8 Y=39 803.0X+30 977.0 Y=1 223.56X+4 682.4 Y=59 491.2X+16 691.7 Y=2 312.5X+3 712.9 Y=1 246.8X+437.8 Y=21 292.0X+40 338.7 Y=14 065.6X+64 037.3 Y=2 373.6X-2 824.3 0.997 8 0.999 7 0.999 7 0.999 5 0.999 3 0.999 7 0.996 4 0.998 6 0.999 2 0.997 8 0.998 8 0.996 0 0.997 9 0.995 4 0.998 6 0.999 9 0.999 9 0.999 8 0.995 9 0.999 2 0.996 5 0.999 4 0.997 0 0.997 7 0.997 8 0.998 1 0.999 9 0.009 0.009 0.010 0.008 0.008 0.009 0.008 0.011 0.010 0.009 0.008 0.010 0.010 0.010 0.006 0.008 0.006 0.008 0.006 0.008 0.011 0.010 0.010 0.006 0.006 0.057 0.055 0.031 0.029 0.033 0.027 0.026 0.029 0.027 0.037 0.032 0.031 0.025 0.034 0.034 0.034 0.021 0.026 0.021 0.026 0.021 0.025 0.036 0.032 0.033 0.020 0.021 0.191 0.184
续表
化合物 线性范围/（ng·mL-1） 回归方程 相关系数R2 检出限/（μg·kg-1） 定量限/（μg·kg-1）吡虫啉啶虫脒杀虫脒多菌灵1.0～250 1.0～250 1.0～250 1.0～250 Y=5 908.4X-2 094.7 Y=46 755.1X+146 024.0 Y=1 112.3X-2 595.2 Y=18 402.7X+42 487.1 0.999 9 0.998 7 0.998 7 0.998 8 0.051 0.056 0.045 0.050 0.171 0.188 0.151 0.167
2.4.2 加标回收率及精密度试验
不同蜂产品中31种农兽药化合物的加标回收率及精密度试验结果见表3。由表3可知，31种化合物在蜂蜜中的加标回收率为60.3%～114.2%，精密度试验结果的RSD为0.3%～13.2%；在蜂花粉中的加标回收率为61.7%～114.8%，精密度试验结果的RSD为0.4%～12.1%；在蜂王浆中的加标回收率为64.1%～116.7%，精密度试验结果的RSD为0.7%～12.3%。结果表明该方法准确可靠，可用于蜂产品中农兽药残留的检测分析。
表3 不同蜂产品中31种农兽药化合物的加标回收率及精密度试验结果（n=5）
Table 3 Results of standard recovery rates and precision tests results of 31 pesticide and veterinary drug compounds in different bee products (n=5)
化合物 样品类型5 μg/kg回收率/%RSD/%10 μg/kg回收率/%RSD/%20 μg/kg回收率/%RSD/%磺胺甲嘧啶磺胺甲恶唑磺胺二甲嘧啶磺胺间二甲氧嘧啶磺胺间甲氧嘧啶磺胺喹恶啉磺胺嘧啶甲氧苄啶氯霉素蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆84.2 81.7 80.3 85.2 79.6 81.3 94.3 91.2 87.6 81.9 84.6 82.3 71.5 73.9 72.4 81.7 84.9 86.7 82.9 89.2 83.4 91.5 94.8 96.7 88.7 87.4 85.8 10.1 7.2 8.9 5.7 6.2 1.8 6.1 6.7 1.7 11.4 7.6 9.8 13.2 12.1 10.0 8.1 7.2 6.9 6.2 5.1 4.9 7.1 6.0 5.4 6.2 6.9 4.7 86.1 85.2 81.4 82.9 89.3 86.1 96.7 93.3 90.2 79.9 83.5 86.7 71.1 71.6 73.2 80.3 81.6 82.9 86.3 81.8 82.6 96.8 94.3 97.1 91.2 92.6 91.4 2.7 9.6 12.3 6.7 4.2 6.1 5.4 3.2 9.8 8.0 6.5 7.1 3.9 3.2 3.7 6.2 5.4 5.1 1.6 4.3 3.7 2.2 2.7 1.8 3.1 2.5 2.4 81.5 87.9 83.2 84.5 81.9 88.7 88.9 87.2 89.1 78.3 75.6 86.3 70.1 70.9 71.6 85.1 81.3 83.9 86.1 85.4 86.9 98.3 96.2 94.4 93.8 94.7 93.1 3.3 5.7 6.2 4.9 8.3 5.2 0.4 0.9 1.8 5.6 5.1 4.0 3.1 3.0 1.7 0.5 1.3 1.9 5.1 3.8 2.9 5.1 5.6 3.7 2.1 1.7 1.0
续表
化合物 样品类型氟苯尼考甲砜霉素恩诺沙星环丙沙星沙拉沙星依诺沙星地塞米松甲基泼尼松龙可的松甲硝唑地美硝唑洛硝哒唑苯硝咪唑二甲氧苄啶蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆5 μg/kg回收率/%RSD/%85.3 86.4 81.7 81.5 83.9 83.1 94.1 97.6 98.3 107.6 108.4 104.3 114.2 111.4 113.2 108.2 107.6 106.8 91.2 94.8 97.6 67.2 62.9 64.7 64.8 65.7 64.1 96.4 98.2 95.7 78.2 74.3 75.9 103.9 97.8 104.2 81.7 87.6 84.3 101.4 106.9 105.1 2.7 6.7 5.4 5.7 4.1 3.3 1.8 1.7 0.9 9.2 7.8 8.1 5.1 1.7 1.9 2.6 1.1 3.9 7.0 1.9 5.2 7.6 0.9 4.2 9.2 6.4 3.7 5.7 4.1 3.9 1.4 2.7 5.2 5.0 3.7 2.1 1.6 5.4 6.3 1.7 0.4 4.8 10 μg/kg回收率/%RSD/%92.6 91.7 93.6 85.2 89.3 84.7 89.7 87.6 85.1 99.6 98.2 101.4 106.7 107.2 106.1 104.9 104.3 103.2 81.6 82.9 86.7 60.3 61.7 66.8 77.9 76.2 74.8 90.1 91.8 90.5 74.1 76.2 70.3 94.6 97.8 93.2 82.9 84.7 85.1 91.8 94.3 91.2 5.1 5.9 5.7 3.1 2.4 0.7 7.8 5.4 1.8 4.4 6.9 8.7 5.3 5.9 4.7 3.0 1.5 5.1 8.1 6.4 2.9 6.9 4.8 8.7 1.7 5.6 4.2 1.6 0.7 3.0 1.9 2.7 3.8 3.3 5.6 1.7 3.6 4.8 0.9 2.0 2.9 1.1 20 μg/kg回收率/%RSD/%89.7 88.3 90.2 88.6 84.7 89.8 85.5 89.2 86.4 103.3 105.2 103.9 101.2 99.5 103.6 97.8 95.2 96.7 85.2 86.3 88.7 64.9 67.2 68.7 72.6 71.3 73.9 89.7 92.6 90.1 70.8 72.4 71.1 90.1 91.7 93.8 85.5 83.9 88.2 96.7 98.2 94.7 2.9 2.1 2.2 0.9 2.4 1.9 5.6 9.7 1.5 3.8 6.2 5.1 4.1 5.9 6.4 3.6 0.4 5.7 1.2 0.9 4.7 1.8 5.9 4.2 4.9 3.1 2.7 3.1 4.8 6.2 3.2 4.1 2.9 2.4 8.3 6.5 3.7 7.8 5.4 3.6 2.8 1.9
续表
化合物 样品类型5 μg/kg回收率/%RSD/%10 μg/kg回收率/%RSD/%20 μg/kg回收率/%RSD/%维吉尼霉素M1氨苯砜噻虫嗪噻虫胺吡虫啉啶虫脒杀虫脒多菌灵蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆蜂蜜蜂花粉蜂王浆98.7 96.8 94.3 97.3 94.1 93.8 84.6 87.9 81.6 112.3 114.8 116.7 82.8 88.7 84.6 81.0 87.3 86.8 81.3 83.1 80.9 96.5 97.3 91.2 3.9 1.4 2.6 3.8 9.2 1.1 8.3 2.8 2.6 8.2 1.4 5.5 2.4 6.6 3.8 4.4 6.1 10.2 6.2 3.2 3.5 6.0 1.9 4.2 90.2 91.7 92.8 84.9 81.6 87.3 90.7 91.8 87.6 90.5 91.7 96.3 95.2 97.2 93.7 97.2 92.0 96.2 86.6 82.9 84.8 105.7 104.2 100.9 2.6 5.4 1.8 0.3 2.9 5.4 2.1 5.1 1.5 1.4 3.2 10.2 5.1 3.6 8.2 1.9 0.8 4.2 1.8 2.9 0.8 1.3 6.4 3.7 88.7 90.1 87.6 90.0 91.8 94.3 92.7 94.2 89.8 100.2 103.4 97.8 91.6 90.8 94.3 88.5 87.0 86.3 87.7 90.1 89.2 90.6 94.3 92.7 3.1 5.2 7.8 2.1 0.7 1.8 2.9 3.0 4.3 1.9 2.8 1.6 4.3 1.6 3.1 2.0 2.4 3.6 2.7 1.6 4.8 6.8 6.1 1.8
2.5 实际蜂产品样品中31种农兽药残留的测定
采用本研究建立的方法对来自重庆市不同区县的206份蜂产品中的31种农兽药残留进行检测，结果见表4。由表4可知，142份蜂蜜中检出12种农兽药残留；51份蜂花粉中检出6种农兽药残留；13份蜂王浆中检出1种兽药残留。其中蜂蜜中多菌灵、吡虫啉、啶虫脒、噻虫胺、氯霉素和甲氧苄啶检出率较高，为2.1%～4.9%；蜂花粉中吡虫啉、啶虫脒、噻虫胺、噻虫嗪、多菌灵和甲硝唑检出率较高，为2.0%～9.8%；蜂王浆中主要为恩诺沙星。
表4 206份市售蜂产品中31种农兽药化合物残留检测结果
Table 4 Determination results of 31 pesticide and veterinary drug compounds in the 206 commercially available bee products
类型 化合物 检出数 检出率/%样品 检出范围/（μg·kg-1）残留均值/（μg·kg-1）蜂蜜吡虫啉啶虫脒噻虫胺多菌灵氯霉素恩诺沙星7 5 3 8 3 2 4.9 3.5 2.1 5.6 2.1 1.4 2.2～29.8 1.5～18.6 2.3～23.4 5.7～49.8 1.8～15.9 13.8～51.4 13.2 8.9 14.1 21.9 7.6 32.6
续表
类型 化合物 检出数 检出率/%样品 检出范围/（μg·kg-1）残留均值/（μg·kg-1）蜂花粉蜂王浆环丙沙星甲硝唑洛硝哒唑甲氧苄啶磺胺甲恶唑维吉尼霉素M1吡虫啉啶虫脒噻虫胺噻虫嗪多菌灵甲硝唑恩诺沙星2 2 1 3 1 1 4 3 1 1 5 1 1 1.4 1.4 0.7 2.1 0.7 0.7 7.8 5.9 2.0 2.0 9.8 2.0 7.7 14.1～34.2 12.0～15.6 36.5 1.8～37.4 20.3 14.2 3.8～35.3 2.3～22.9 7.3 11.2 2.4～35.8 6.8 19.7 24.3 13.8 36.5 21.9 20.3 14.2 16.0 12.0 7.3 11.2 16.0 6.8 19.7
2.6 膳食暴露风险评估
对蜂产品中31种农兽药残留进行膳食暴露风险评估，结果见表5。由表5可知，蜂花粉和蜂王浆中农兽药的IFS值均＜1，表明其风险较低。蜂蜜中恩诺沙星、甲氧苄啶、洛硝哒唑、环丙沙星、氯霉素和甲硝唑的IFS分别为4.338、4.302、3.764、3.234、2.090和1.627，均＞1，因此存在较高风险，应加强对蜂蜜中这些农兽药进行监管。
表5 蜂产品中31种农兽药化合物残留的膳食暴露风险评估
Table 5 Dietary exposure risk assessment of 31 pesticide and veterinary drug residues in bee products
产品类别 化合物 R/（μg·kg-1）F/（g·d-1）SI/[μg·（kg·d）-1] IFS蜂蜜蜂花粉蜂王浆吡虫啉啶虫脒噻虫胺多菌灵氯霉素恩诺沙星环丙沙星甲硝唑洛硝哒唑甲氧苄啶磺胺甲恶唑维吉尼霉素M1吡虫啉啶虫脒噻虫胺噻虫嗪多菌灵甲硝唑恩诺沙星13.2 8.9 14.1 21.9 7.6 32.6 24.3 13.8 36.5 21.9 20.3 14.2 16.0 12.0 7.3 11.2 16.0 6.8 19.7 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 30 30 30 30 30 30 10 60.0 70.0 100.0 30.0 3.0 6.2 6.2 7.0 8.0 4.2 50.0 250.0 60.0 70.0 100.0 80.0 30.0 7.0 6.2 0.182 0.105 0.116 0.602 2.090 4.338 3.234 1.627 3.764 4.302 0.335 0.047 0.132 0.085 0.036 0.069 0.264 0.481 0.524
3 结论
本研究建立了一种可同时测定蜂产品中31种农兽药残留的UPLC-MS/MS检测方法。样品用体积分数80%乙腈-水（含0.2%甲酸）提取后，采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化样品，流速控制为1滴/s；采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，以甲醇和5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸-水溶液为流动相梯度洗脱，电喷雾离子源，正负离子切换的多反应监测模式结合外标法进行定性、定量分析。在此条件下，25种兽药及6种农药分别在0.2～100 ng/mL和1.0～250 ng/mL范围内线性关系良好（R2≥0.990），检出限为0.006～0.057 μg/kg，定量限为0.021～0.191 μg/kg，加标回收率为60.3%～116.7%，精密度试验结果的相对标准偏差（RSD）为0.3%～13.2%，说明该方法准确度高且重复性好，适用于蜂产品中农兽药残留的检测。从蜂产品样品中共检出19种农兽药残留，其中恩诺沙星、甲氧苄啶、洛硝哒唑、环丙沙星、氯霉素、甲硝唑的食品安全指数（IFS）＞1，膳食暴露风险较高，应加强监管。该结果可为重庆市蜂产品质量监管提供参考。
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