牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特色畜种，牦牛乳营养价值丰富，是优质奶源[1]。枸杞（Lycium barbarum）含有多种功能活性成分，其中枸杞多糖能够改善人体肠道菌群丰度，促进短链脂肪酸的产生[2]，具有益生元作用[3]。牦牛酸奶由牦牛乳通过乳酸菌发酵生成，适合乳糖不耐人群食用[4]。近年来，牦牛酸奶的研究不断推进，已有研究表明，牦牛酸奶的挥发性风味物质的数量和含量多于普通酸奶[5]，并有胡萝卜汁枸杞酸奶[6]和黑枸杞酸奶的相关研究[7]，然而未见凝固型牦牛红枸杞酸奶的工艺研究相关报道。
牛乳在冷藏条件下只能保存2～3 d，且牦牛多为牧民或合作社养殖，因此常用-20 ℃冻藏缓解区域性和季节性短缺问题。冷冻时牦牛乳会出现液体、胶体悬浊液、过饱和溶液之间的相变，存在结晶和乳糖析出现象[8]。冰晶存在会破坏脂肪球结构，导致奶冻存后稳定性降低[9]。MA Y等[10]研究发现，冻融过程使羊奶表观黏度降低，蛋白质氧化程度增强，物理稳定性下降。且LI A L等[11]指出牦牛原乳-20 ℃下冷冻贮藏90 d后生产的酸奶质量显著下降。但关于冻融的牦牛乳对酸奶品质的影响鲜见报道。
目前从牧民收购的牦牛乳多为冻存乳，生产加工中会出现冻融现象。本试验以冻存的牦牛乳为试验原料制备牦牛枸杞酸奶，通过单因素及正交试验研究红枸杞浆添加量、白砂糖添加量、发酵剂添加量、发酵温度、发酵时间5种因素对牦牛枸杞酸品质的影响，确定牦牛枸杞酸奶最佳发酵工艺，并探究不同冻融循环次数的牦牛奶对枸杞酸奶微观结构及品质的影响，促进牦牛乳采购过程中质量控制，为牦牛乳制品的生产加工等环节提供数据参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌种
冻存牦牛乳：玉树阿米雪乳业发展有限公司；荷斯坦牛乳：内蒙古蒙牛乳业股份有限公司。红枸杞：青海西宁；白砂糖：桂林市顺风糖业有限公司；发酵剂（保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus））：苏州佰生优健康科技有限公司。
1.1.2 化学试剂
酚酞（分析纯）：上海展云化工有限公司；氢氧化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
MRS培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 仪器与设备
YM-50高压灭菌锅：上海三申实业发展有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏州泰安科技有限公司；XW-80旋涡振荡器：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；JP06C-1000发酵柜：上海加派机械科技公司；ETT-CP5000流变仪：广州来美科技有限公司；DHR流变仪：美国TA公司；H/T16MM离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；HZT-A电子天平：福州华志科学仪器有限公司；RCD-1A乳化均质机：常州市亿能机械有限公司；LZ4X2-100C榨汁机：美的集团股份有限公司；DGX-9073B电热恒温鼓风干燥箱：上海南荣实验室设备有限公司；XU-10N-60A真空冷冻干燥机：上海析牛莱伯仪器有限公司；Mastersizer 2000粒径分析仪：英国Malvern公司；JSM 7900F傅里叶红外光谱仪：岛津仪器有限公司；SPX-250生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；JSM7900F扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM）：日本电子株式会社。
1.3 方法
1.3.1 凝固型牦牛枸杞酸奶的制备
枸杞与水按照料液比1∶2（g∶mL）浸泡1 h，榨汁后用3层纱布过滤，得到枸杞浆。冻存牦牛乳3层纱布过滤，除去沉淀。过滤后牦牛乳中添加6%枸杞浆、白砂糖8%，使用乳化均质机于10 000 r/min条件下均质3 min后，95 ℃煮沸15 min进行灭菌。灭菌后降温至40 ℃，添加0.30%发酵剂并混匀，于发酵箱中42 ℃发酵8 h，发酵完成后于4 ℃冰箱后熟12 h，即得凝固型牦牛枸杞酸奶。
1.3.2 牦牛枸杞酸奶发酵工艺优化
（1）单因素试验
为了确定最适的凝固型牦牛枸杞酸奶工艺，以牦牛乳质量为基准，分别考察枸杞浆添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、白砂糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、发酵剂添加量（0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%）、发酵时间（6 h、7 h、8 h、9 h、10 h）、发酵温度（36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃）5个因素对牦牛枸杞酸奶持水力、酸度、表观黏度曲线、感官评分的影响。
（2）正交试验
根据单因素试验结果，以感官评分为考察指标，枸杞浆添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为影响因素，进行3因素3水平正交试验，确定最优牦牛枸杞酸奶发酵工艺。
1.3.3 牦牛乳冻融处理
牦牛乳进行分装，分别冻融2、4、6、8、10次。冷冻条件为-20 ℃，解冻条件为40 ℃。冻融处理后的牦牛乳存于-20 ℃冰箱备用。
1.3.4 酸奶感官评定
感官评定小组由10名经过培训的人员组成，对凝固型牦牛枸杞酸奶的外观、气味、组织状态、滋味进行评价，满分为100分，感官评分标准见表1。
表1 牦牛枸杞酸奶感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of yak wolfberry yogurt
项目 判断维度 评价标准 分值/分外观（15分）气味（25分）色泽由淡黄色到橙色到微红色酸奶表面反光程度，越均匀分值越大切面色泽均匀程度，越均匀分值越大酸奶发酵的乳酸味越浓分值越大枸杞风味越浓分值越大牦牛乳风味越浓分值越大0～5 0～5 0～5 0～9 0～8 0～8组织状态（30分）舀一勺酸奶竖立，酸奶下落速度越慢，分值越大酸奶切面颗粒越小，越细腻，分值越高乳清析出越少分值越高0～10 0～10 0～10滋味（30分）颜色光泽均匀性发酵味枸杞味乳香味黏性细腻度乳清酸度甜度枸杞味酸度越适中分值越高甜度越适中分值越高枸杞味越适中分值越高0～10 0～10 0～10
1.3.5 分析检测
（1）牦牛乳粒径
样品解冻后静置24 h后摇匀使用Mastersizer 2000粒径分析仪进行粒径分析[12]。
（2）牦牛乳蛋白傅里叶红外光谱分析
经过冻融处理后的乳样，解冻后于4 ℃、4 500 r/min离心15 min，弃上层乳脂后-80 ℃冷冻12 h后，冷冻干燥。参照孙佳悦等[13]的方法进行傅里叶红外光谱分析。
（3）酸度
参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》中的滴定法测定。
（4）表观黏度检测
采用LI S Q等[14]的方法并进行修改。使用ETT-C5000流变仪测定黏度随剪切时间的变化：温度4 ℃、转速50 r/s，进行300 s测试，取50个数据点。
（5）流变特性
采用DHR流变仪进行测定[11]。在测试前，酸奶样品放置于4 ℃冰箱中。采用40 mm 2.0°锥板，检测酸奶扫描频率对模量的影响。设置板-板间隙为1 mm，检测温度为4 ℃，振荡应变为0.1%，频率扫描范围为0.1～20 Hz，检测酸奶的弹性模量（G′）和粘性模量（G″）。
（6）扫描电镜
酸奶块置于5%戊二醛溶液（pH 6.8）中固定，在4 ℃下放置12 h以上。固定后，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.2）洗涤样品3次，每次5 min。分别用体积分数为50%、70%、80%和90%乙醇溶液在PBS清洗后脱水10 min，并用100%乙醇脱水两次，每次10 min。操作完成后，放入-80 ℃冰箱冷冻过夜，用真空冷冻机（10 Pa以下、-40 ℃24 h）干燥试样[9]。采用离子溅射仪镀铂金膜，5 kV，SEM观测放大倍数分别为5 000倍和20 000倍。
（7）乳酸菌检测
乳酸菌检测采用稀释平板菌落计数法。取0.1 g酸奶，添加灭过菌的生理盐水进行稀释，稀释梯度为10-6、10-7，37 ℃培养36 h，检测乳酸菌菌落总数。
（8）持水力
酸奶的持水力（water holding capacity，WHC）就是酸奶的蛋白凝胶网络对水的保持能力，能力弱，则易发生乳清析出，酸奶质地差。酸奶的持水力也能侧面反映凝胶网络的致密性及酸奶的质地。准确称取1.000 g样品，置于10 mL离心管中，在（25±2）℃、4 000 r/min条件下离心15 min后，倾去上层清液，称质量。持水力计算公式如下：
式中：m0为10 mL离心管质量；m1为倾倒上清液后酸奶和离心管质量之和；m2为倾倒上清液后酸奶和离心管质量之和。
1.3.6 数据处理与统计分析
使用Omnic 32软件、PeakFit v 4.12软件进行数据处理。试验重复3次，结果表示为“平均值±标准差”。实验数据采用SPSS 25.0进行分析（P＜0.05表明具有显著性），采用Origin 8.0软件绘图。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验结果
枸杞浆添加量、白砂糖添加量、发酵剂添加量、发酵温度及发酵时间对牦牛枸杞酸奶品质的影响结果见表2。
表2 各影响因素对牦牛枸杞酸奶酸度、持水力、感官评分及表观黏度的影响
Table 2 Effects of various influencing factors on acidity, water holding capacity,sensory score and apparent viscosity of yak wolfberry yogurt
注：字母不同表示同一指标不同水平差异显著（P＜0.05）。
因素 水平 持水力/% 酸度/°T 感官评分/分表观黏度/（Pa·s）枸杞添加量/%13579 80.60±0.53cd 81.32±0.82bc 83.42±0.72a 82.36±0.76ab 79.40±0.94d 103.86±0.76d 111.43±1.00c 115.79±1.63b 118.89±1.39a 114.11±1.60b 70.88±3.72b 73.88±4.09b 78.63±3.20a 79.13±4.97a 77.38±4.98a 5.57±0.20a 5.03±0.11b 4.83±0.10b 3.86±0.10c 3.96±0.14c白砂糖添加量/%24681 0 77.00±5.25a 80.50±4.37a 81.00±5.87a 83.17±5.98a 79.00±7.67a 3.28±0.07c 3.84±0.10b 4.21±0.11a 4.13±0.10a 4.13±0.10a发酵剂添加量/%0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 71.29±2.14a 72.14±4.53a 74.00±5.07a 73.29±5.02a 71.14±4.78a 3.15±0.07c 3.35±0.09b 3.35±0.07b 3.62±0.07a 3.60±0.10a发酵时间/h 67891 0 67.13±3.44c 70.88±3.09bc 77.88±2.23a 78.25±4.06a 74.38±6.28ab 1.36±0.02c 3.30±0.18b 3.62±0.07a 3.66±0.09a 3.72±0.09a发酵温度/℃36 38 40 42 44 71.64±0.84a 74.28±2.42a 74.65±0.19a 75.02±0.94a 73.34±1.70a 79.85±2.98a 84.47±2.79a 85.16±4.23a 85.14±2.10a 82.30±1.14a 90.56±1.29a 80.87±3.51b 80.27±3.70b 78.53±1.85b 81.10±2.06b 64.43±1.07c 68.23±0.68b 70.56±0.80b 78.23±1.55a 76.48±1.82a 116.67±2.80a 118.00±3.18a 109.05±2.13b 110.72±3.03b 109.27±2.35b 97.63±2.70d 108.39±1.56c 117.17±3.07a 114.99±2.67ab 110.31±1.07bc 71.63±0.95d 102.77±1.58c 103.82±1.32bc 106.56±0.93b 115.57±1.67a 77.90±1.08d 84.93±0.93c 94.26±1.24b 105.83±3.61a 83.84±1.20c 2.12±0.05e 3.30±0.06d 4.13±0.10c 4.80±0.08b 5.75±0.13a 63.00±3.82c 71.00±4.72b 73.63±2.45ab 77.88±2.23a 74.13±3.60ab
由表2可知，枸杞浆添加量为1%～5%时，牦牛枸杞酸奶持水力随之增加；枸杞浆添加量为5%时，酸奶持水力最高，为（83.42±0.72）%；枸杞浆添加量＞5%之后，牦牛枸杞酸奶持水力下降，表明枸杞多糖能与酪蛋白相互作用增强凝胶结构，减少乳清析出[15]。枸杞浆添加量为1%～7%时，酸奶酸度随之增加；枸杞浆添加量为7%时，酸奶酸度最高，为（118.89±1.39）°T；枸杞浆添加量＞7%之后，酸奶酸度下降，可能是较高渗透压能抑制乳酸菌的增殖，降低酸度[16]。枸杞浆添加量为1%～7%时，感官评分随之升高；枸杞浆添加量为7%时，酸奶感官评分最高，为（79.13±4.97）分；枸杞浆添加量＞7%之后，感官评分下降。枸杞浆添加量为1%时酸奶表观黏度最大。综上，选取枸杞浆最适添加量为7%。
由表2可知，当白砂糖添加量为2%～8%时，牦牛枸杞酸奶持水力、感官评分随之上升；当白砂糖添加量为8%时，牦牛枸杞酸奶持水力、感官评分最高，分别为（75.02±0.94）%、（83.17±5.98）分；当白砂糖添加量＞8%之后，牦牛枸杞酸度、感官评分降低，但不存在显著性差异。持水力上升，牦牛枸杞酸奶保持水分的能力增加，凝胶立体网络对水分子的束缚能力增强。当白砂糖添加量为4%时，酸度最高为（118.00±3.18）°T，4%～6%酸度降低原因是可能是由于保加利亚乳杆菌利用乳糖发酵的最大产酸能力高于蔗糖[17]，随着白砂糖添加量的增加，乳酸菌由利用乳糖发酵转为优先利用白砂糖进行发酵，导致乳酸最终产品酸度降低。白砂糖添加量为6%～10%时，表观黏度较大，且没有显著差异。综上，选取白砂糖最适添加量为8%。
由表2可知，当发酵剂添加量为0.15%～0.25%时，牦牛枸杞酸奶持水力、酸度及感官评分随之升高；当发酵剂添加量为0.25%时，牦牛枸杞酸奶持水力、酸度及感官评分最高，分别为（85.16±4.23）%、（117.17±3.07）°T、（74.00±5.07）分；当发酵剂添加量＞0.25%之后，牦牛枸杞酸奶持水力、酸度及感官评分下降，但与发酵剂添加量0.3%时，不存在显著性差异。发酵剂添加量为0.30%时，酸奶表观黏度最大。发酵剂添加量过高，酸奶体系产酸速度过快，蛋白质凝胶体系不稳定，酸奶表观黏度降低[18]。综上，选取发酵剂最适添加量为0.30%。
由表2可知，当发酵时间为6～9 h时，感官评分随之上升，持水性随之下降；当发酵时间为9 h时，感官评分最高，为（78.25±4.06）分，持水性最低，为（78.53±1.85）%；当发酵时间＞9 h之后，感官评分下降，持水性上升。当发酵时间为6～10 h时，酸度逐渐升高。发酵时间短时，乳酸菌生长及产酸时间较短，酪蛋白分子所形成的微小亚胶体分子团较少，酸奶凝固性较差[18]。发酵时间为10 h时酸奶表观黏度最大。综上，选取最适发酵时间为9 h。
由表2可知，当发酵温度为36～42 ℃时，牦牛枸杞酸奶持水力、酸度及感官评分随之升高；当发酵温度为42 ℃时，牦牛枸杞酸奶持水力、酸度及感官评分最高，分别为（78.23±1.55）%、（105.83±3.61）°T、（77.88±2.23）分；当发酵温度＞42℃之后，牦牛枸杞酸奶持水力、酸度及感官评分下降。随着发酵温度升高，酸奶表观黏度增大，发酵温度为44 ℃时，酸奶表观黏度较高。综上，选取最适发酵温度为42 ℃。
2.2 正交试验结果与分析
在单因素试验结果基础上，固定白砂糖添加量8%，发酵剂添加量0.30%，以感官评分为考察指标，枸杞浆添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为影响因素，进行3因素3水平正交试验，正交试验结果与分析见表3。由表3可知，枸杞浆添加量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）三个因素对凝固型牦牛枸杞酸奶感官评分影响的主次顺序为发酵温度（B）＞发酵时间（C）＞枸杞浆添加量（A），最优组合为A2B1C2，即枸杞浆添加量为7%，发酵温度41 ℃，发酵时间9 h。在此优化条件进行3次平行验证试验，牦牛枸杞酸奶感官评分为（85.14±1.86）分，表观黏度为（5.14±0.17）Pa·s。
表3 发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization
试验号A 枸杞浆添加量/% B 发酵温度/℃ C 发酵时间/h 感官评分/分1 2 6 7 41 42 8 8 82.13 83.13
续表
试验号A 枸杞浆添加量/% B 发酵温度/℃ C 发酵时间/h 感官评分/分3456789K1K2K3R 8876678 89991 0 79.63 81.50 84.50 82.75 83.00 80.88 84.00 247.88 248.51 245.13 0.92 43 42 41 43 42 43 41 250.63 247.63 243.26 2.46 10 10 244.89 248.75 247.88 1.29
2.3 凝固型牦牛乳枸杞酸奶与凝固型牦牛乳酸奶、荷斯坦牛乳酸奶品质分析
凝固型牦牛乳枸杞酸奶（样1）、牦牛乳酸奶（样2）、荷斯坦牛乳酸奶（样3）理化指标测定结果见表4。由表4可知，牦牛乳枸杞酸奶持水力、酸度和表观黏度均处于二者之间。牦牛乳枸杞酸奶、牦牛乳酸奶、荷斯坦牛乳酸奶乳酸菌总数分别为（5.13±0.32）×109 CFU/g、（4.40±0.56）×109 CFU/g、（4.17±0.49）×109 CFU/g，牦牛乳枸杞酸奶乳酸菌总数略高于牦牛乳酸奶和荷斯坦牛乳酸奶。因此，枸杞浆的添加对酸奶中乳酸菌的繁殖具有一定的促进作用[19]。
表4 凝固型牦牛乳枸杞酸奶、凝固型牦牛乳酸奶和荷斯坦牛乳酸奶的持水力、酸度、表观黏度及乳酸菌总数
Table 4 Water holding capacity, acidity, apparent viscosity and lactic acid bacteria count of coagulated yak milk wolfberry yogurt,coagulated yak milk yogurt and Holstein milk yogurt
注：字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
项目 持水力/% 酸度/°T样1样2样3表观黏度/（Pa·s）乳酸菌总数/（×109 CFU·g-1）85.15±1.36a 74.05±2.41b 63.96±0.93c 105.90±0.01a 96.15±2.73b 83.22±1.42c 5.97±0.15a 5.14±0.17b 3.04±0.41c 5.13±0.32a 4.40±0.56a 4.17±0.49a
2.4 冻融处理对牦牛乳粒度的影响
不同冻融处理次数对牦牛乳粒度分布的影响结果见图1。由图1可知，冻融循环2、4次的牦牛乳粒度呈单峰分布。随着冻融循环的进行，粒径分布峰值向左偏移，并出现双峰。这与MA Y等[10]研究冻融循环对羊奶粒径的影响不同，可能是由于随着冻融次数的增加，牦牛乳乳蛋白氧化，蛋白质结构发生改变，牛乳稳定性降低，蛋白和脂肪聚集体增加，从牦牛乳均一体系中分离出来，导致牛乳粒度降低。因此，随着冻融处理次数的增加，牦牛乳稳定性降低。从牦牛乳粒度分布的结果来看，冻融处理次数6次以内为宜。
图1 不同冻融处理次数对牦牛乳粒度分布的影响
Fig.1 Effect of different freeze-thaw treatment times on particle size distribution of yak milk
2.5 不同冻融牦牛乳蛋白的FT-IR图谱
不同冻融处理次数牦牛乳蛋白质的傅里叶红外光谱分析结果见图2。由图2可知，不同冻融处理次数的牦牛乳蛋白FT-IR图谱谱型无较大差异。在波数3 400 cm-1左右出现宽而强的吸收峰，表明存在大量分子内或分子间氢键[13]。随着冻融循环次数的增加，特征峰出现蓝移现象，峰型变窄，氢键缔合度降低[20]。
图2 不同冻融处理次数的牦牛乳蛋白傅里叶红外光谱
Fig.2 Fourier infrared spectroscopy of yak milk protein with different freeze-thaw treatment times
使用PeakFit v 4.12软件对酰胺Ⅰ带红外光谱图进行基线校正、去卷积处理、二阶导数拟合，并对蛋白质二级结构进行占比计算，结果见表5。
表5 不同冻融处理次数的牦牛乳蛋白质二级结构的占比
Table 5 Proportion of secondary structure of yak milk protein with different freeze-thaw treatments times
注：字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
冻融循环次数/次二级结构占比/%α-螺旋 β-折叠 β-转角 无规则卷曲2 4 6 8 1 0 11.91±0.07d 20.65±0.13a 19.36±0.14c 20.06±0.06b 10.39±0.23e 23.68±0.10d 25.48±0.06b 27.15±0.08a 24.38±0.39c 23.83±0.08d 41.71±0.08b 41.44±0.29b 40.68±0.14c 41.73±0.25b 42.65±0.31a 22.63±0.04b 12.23±0.18d 12.49±0.09d 13.66±0.42c 23.35±0.30a
由表5可知，α-螺旋、β-折叠先升高再降低，β-转角、无规则卷曲含量先降低再升高。在冻融循环6次后，无规则卷曲含量升高表明二级结构部分被破坏，结构随机性增强，可能是由于蛋白质在冻融循环中加速氧化，发生变性，氢键断裂重组，蛋白质结构紊乱[21]。因此，冻融处理次数增加会影响牦牛乳蛋白的二级结构。从牦牛乳的红外光谱分析和蛋白质二级结构占比计算结果来看，冻融处理次数6次以内为宜。
2.6 冻融处理次数对牦牛枸杞酸奶持水力及酸度的影响
不同冻融处理次数牦牛乳制备牦牛枸杞酸奶的酸度及持水力见图3。由图3可知，随着牦牛乳冻融次数的增加，持水力整体呈下降趋势，在冻融2次时取得最大值（80.04±0.18）%。可能与冻融循环改变了酪蛋白的蛋白结构，影响酸奶发酵过程中酪蛋白网状结构的形成有关。酸度变化趋势为先升高再降低，于冻融次数为6时取得最大值（131.96±4.79）T°。因此，冻融处理次数增加，酸奶品质降低。从牦牛枸杞酸乳的酸度及持水力测定结果来看，冻融处理次数6次以内为宜。
图3 不同冻融处理次数的牦牛乳制备牦牛枸杞酸奶的酸度和持水力
Fig.3 Acidity and water holding capacity of yak wolfberry yogurt prepared from yak milk with different freeze-thaw treatment times
2.7 冻融处理次数对牦牛枸杞酸奶流变特性的影响
流变特性对产品质量起着至关重要的作用。酸奶的流变特性与牛乳总固体含量有关，其中脂肪含量的增加有助于减少脱水收缩，提升G′改善酸奶流变特性[22]。不同冻融处理次数牦牛乳制备牦牛枸杞酸奶的流变曲线见图4。由图4可知，不同冻融处理次数条件下酸奶G′＞G″，具有较好的蛋白质网络结构和高粘弹性[23]。随着冻融次数的增加，蛋白质部分氧化变性，形成聚集体，影响酸奶发酵和凝胶网络的形成，G′和G″降低。冻融8、10次的牦牛乳制备的酸奶的G′和G″与冻融6次以内的存在显著差异，是由于此时蛋白质和乳脂肪聚集体明显增大，原料乳处理过程中被除去，凝胶网络形成较少导致。因此，冻融处理次数超过6次时，对牦牛枸杞酸奶G′和G″影响较大，产品质量降低。从牦牛枸杞酸乳的流变特性测定结果来看，冻融处理次数6次以内为宜。
图4 不同冻融处理次数牦牛乳制备牦牛枸杞酸奶的流变曲线
Fig.4 Rheological curves of yak wolfberry yogurt prepared from yak milk with different freeze-thaw treatment times
2.8 冻融处理次数对牦牛枸杞酸奶微观结构的影响
酸奶是一种弱凝胶状粘弹性混合物，主要由酪蛋白胶束构建并由乳清蛋白聚集体增强的网络结构组成[24]。随着乳酸菌发酵，pH降低胶体磷酸钙溶解，酪蛋白形成凝胶网络结构[25]，同时游离水被保存在网络的空腔中[22]。不同冻融处理次数牦牛乳制备牦牛枸杞酸奶的扫描电镜结果见图5。
图5 不同冻融处理次数牦牛乳制备牦牛枸杞酸奶扫描电镜结果
Fig.5 Scanning electron microscopy results of yak wolfberry yogurt with different freeze-thaw treatment times
a-1、a-2冻融循环2次酸奶×5 000、×20 000 SEM；b-1、b-2冻融循环4次酸奶×5 000、×20 000 SEM；c-1、c-2冻融循环6次酸奶×5 000、×20 000SEM；
d-1、d-2冻融循环8次酸奶×5 000、×20 000 SEM；e-1、e-2冻融循环10次酸奶×5 000、×20 000 SEM。
由图5可知，在冻融处理2、4、6次数时，酸奶表面结构及蛋白质三维网状结构较好，随着冻融次数的继续增加，蛋白质交联所形成的三维网状结构坍塌。可能是随着冻融次数的增加牦牛乳分子内和分子间氢键缔合度降低，静电作用被削弱，从而降低牦牛乳发酵过程中蛋白质三维网状结构的稳定性[24]。因此，冻融处理对牦牛枸杞酸奶内部三维网状结构有一定影响。从牦牛枸杞酸乳扫描电镜结果来看，冻融处理次数6次以内为宜。
2.9 冻融对牦牛枸杞酸奶乳酸菌数的影响
不同冻融处理次数牦牛乳制备牦牛枸杞酸奶的乳酸菌数测定结果见图6。
图6 不同冻融处理次数牦牛乳制备牦牛枸杞酸奶乳酸菌总数测定结果Fig.6 Determination results of total lactic acid bacteria count of yak wolfberry yogurt prepared from yak milk with different freeze-thaw treatment times
由图6可知，乳酸菌总数先升高再降低，这与酸奶酸度的变化一致。菌落数增加可能是由于冻融循环降低了蛋白质的稳定性，更容易被乳酸菌利用。菌落数降低可能是由于聚集体的形成导致营养物质的减少，从而降低乳酸菌总数。牦牛乳在冻融处理6～10次制备牦牛枸杞酸奶乳酸菌含量有所下降，但不存在显著差异。从牦牛枸杞酸乳乳酸菌测定结果来看，冻融处理次数6次以内为宜。
3 结论
通过单因素及正交试验对牦牛枸杞酸奶最佳发酵工艺进行优化，结果表明，牦牛枸杞酸奶最佳发酵工艺为红枸杞浆添加量7%，白砂糖添加量8%，发酵剂添加量0.3%，发酵温度41 ℃，发酵时间9 h。在此优化条件下，酸奶感官评分为（85.14±1.86）分，表观黏度为（5.14±0.17）Pa·s，乳酸菌数为（5.13±0.32）×109 CFU/g。且当冻融处理次数低于6次时，酸奶拥有较好的品质。因此，从原料乳的采购、运输至生产乳制品的过程中，应尽量避免原料乳多次冻融。同时研究过程中发现在冻融循环6次后，酸奶G′和G″显著降低，且酸奶表面孔状变多，内部三维网状结构存在坍塌现象。但流变学曲线未呈线性降低，这可能与枸杞浆的存在有关，多糖能与酪蛋白分子结合稳定凝胶结构。在后续实验中可以将枸杞浆和牦牛乳冻融处理分别研究，以便进一步深入揭示冻融对牦牛乳及酸奶品质的影响。
[1]WANG D D,ZHOU Y X,ZHENG X P,et al.Yak milk:Nutritional value,functional activity,and current applications[J].Foods,2023,12(11):2090.
[2]关天越，任怡琳，管祺杰，等.枸杞多糖体外调节人体肠道菌群的功能研究[J].食品与生物技术学报，2023，42（9）：74-81.
[3]ZHU W, ZHOU S X, LIU J H, et al.Prebiotic, immuno-stimulating and gut microbiota-modulating effects of Lycium barbarum polysaccharide[J].Biomed Pharmacother,2020,121:109591.
[4]DU H X, WANG X P, YANG H G, et al.Effects of mulberry pomace polysaccharide addition before fermentation on quality characteristics of yogurt[J].Food Control,2023,153:109900.
[5]刘雪，吴莉蔚，杨勇，等.牦牛酸奶加工工艺参数优化及其品质分析[J].中国测试，2023，49（6）：68-74.
[6]蒋涵珺，李双娇，张哲川，等.胡萝卜汁发酵牦牛酸奶的品质评价[J].农产品加工，2023（16）：74-78，83.
[7]李文浩，马琳，张建华，等.黑枸杞牦牛酸奶的制备工艺探究[J].青海畜牧兽医杂志，2021，51（5）：20-25.
[8]ALINOVI M,MUCCHETTI G,WIKING L,et al.Freezing as a solution to preserve the quality of dairy products:the case of milk,curds and cheese[J].Crit Rev Food Sci Nutr,2021,61(20):3340-3360.
[9]YU Z Z,QIAO C Y,ZHANG X R,et al.Screening of frozen-thawed conditions for keeping nutritive compositions and physicochemical characteristics of goat milk[J].J Dairy Sci,2021,104(4):4108-4118.
[10]MA Y,LI J Z,HUANG Y X,et al.Physicochemical stability and in vitro digestibility of goat milk affected by freeze-thaw cycles[J].Food Chem,2023,404:134646.
[11]LI A L,HAN X T,ZHENG J,et al.Effects of freezing raw yak milk on the fermentation performance and storage quality of yogurt[J].Foods,2023,12(17):3223.
[12]许小刚，周雪松，曾建新.粒径分析法快速判定均质工艺对水牛奶稳定性的影响[J].中国乳品工业，2009，37（1）：42-44.
[13]孙佳悦，钱方，姜淑娟，等.基于红外光谱分析热处理对牛乳蛋白质二级结构的影响[J].食品科学，2017，38（23）：82-86.
[14]LI S Q,YE A Q,SINGH H.Effects of seasonal variations on the quality of set yogurt,stirred yogurt,and Greek-style yogurt[J].J Dairy Sci,2021,104(2):1424-1432.
[15]QU X Q, NAZARENKO Y, YANG W, et al.Effect of oat beta-glucan on the rheological characteristics and microstructure of set-type yogurt[J].Molecules,2021,26(16):4752.
[16]ZHOU F,JIANG X Y,WANG T,et al.Lycium barbarum polysaccharide(LBP):A novel prebiotics candidate for Bifidobacterium and Lactobacillus[J].Front Microbiol,2018,9:1034.
[17]贾庆超，李望铭，韩亚飞.黑枸杞风味酸奶发酵条件优化及低聚果糖和水苏糖对其品质的影响[J].中国酿造，2023，42（3）：187-193.
[18]ZHANG W B,CHEN C,WANG P J.Formation and physical properties of skimmed milk/low-acyl gellan gum double gels:Influence of gelation sequence[J].Carbohydr Polym,2025,349:123012.
[19]FAN X K,SHI Z H,XU J,et al.Characterization of the effects of binary probiotics and wolfberry dietary fiber on the quality of yogurt[J].Food Chem,2023,406:135020.
[20]康鹏，雷晓民，葛武鹏，等.不同巴氏杀菌处理对绵羊乳总蛋白及乳清蛋白二级结构的影响[J].食品安全质量检测学报，2021，12（23）：9219-9225.
[21]YE T, CHEN X, ZHU Y J, et al.Freeze-thawing treatment as a simple way to tune the gel property and digestibility of minced meat from red swamp crayfish(Procambarus clarkiix)[J].Foods,2022,11(6):837.
[22]ATIK D S,ÖZTÜRK H I˙,AKIN N.Perspectives on the yogurt rheology[J].Int J Biol Macromol,2024,263:130428.
[23]YANG J J,SUN J W,YAN J Y,et al.Impact of Potentilla anserine polysaccharide on storage properties of probiotic yak yoghurt[J].Int Dairy J,2023,141:105585.
[24]FU R J,LI J,ZHANG T,et al.Salecan stabilizes the microstructure and improves the rheological performance of yogurt[J].Food Hydrocoll,2018,81:474-480.
[25]NÖBEL S, SEIFERT B, DAFFNER K, et al.Instantaneous gelation of acid milk gels via customized temperature-time profiles: Screening of concentration and pH suitable for temperature triggered gelation towards 3D-printing[J].Food Hydrocoll,2021,113:106450.