以预防为主导、注重维护健康的观念正在逐渐成为当今社会的主流健康理念。功能饮料近年来的规模持续扩大。据统计，至2023年底，中国功能饮料市场的总价值已达到1 569.04亿元人民币，相较于2022年增长了8.5%[1]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），作为一种新兴的功能性成分，在人体内参与多种代谢过程，具备安定神经系统、降低血压与血糖水平等多种生物活性作用[2-5]。 因此，它被广泛应用于药品制造、保健品开发以及功能性食品生产。
GABA是一种由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶作用下转化而成的非蛋白质氨基酸，广泛分布于动植物体内[6-7]。2009年，中国卫生部正式将GABA认定为一种新的食品资源，每日摄入量不得超过500 mg。欧洲食品安全局则建议GABA的日膳食摄入上限为550 mg。GABA在食品工业中的应用日益广泛，特别是在饮料领域，GABA的应用潜力受到了市场的普遍认可。自20世纪80年代起，人们开始尝试开发GABA成分的饮料；通过厌氧发酵技术处理后的茶饮，其GABA含量显著提高[8-9]，如今市场上已经出现了多种类型的高GABA含量茶饮，以及乳酸菌饮料[10]、草本植物饮料[11]、风味饮料、果蔬汁饮料、蛋白饮料以及固体饮料[12]。 然而值得注意的是，过量摄入GABA可能会抑制中枢神经系统活动，导致疲劳感增强或反应速度下降等问题，存在潜在的安全隐患[5，13]。因此，建立能适用于饮料中GABA含量检测的方法，并开展相关人膳食暴露风险评估显得尤为重要。
当前，对于GABA的测定主要采用了纸层析法[14]，Berthelot比色法[15-16]，高效液相色谱技术[17-19]以及高效液相色谱串联质谱分析[20-22]。 在使用纸层析法与Berthelot比色法时，存在其他氨基酸干扰、重现性差、灵敏度低及定量准确性不足等问题；鉴于GABA缺乏发光基团，其在紫外和可见光下检测响应较弱，采用高效液相色谱测定时需要对其进行衍生化处理，存在操作复杂繁琐、耗时长，衍生物不稳定性，不适合大规模样本检测的问题；相比之下，利用超高效液相色谱串联质谱技术（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）测定GABA，可以避免衍生处理的繁琐操作，具有高效、专属性好，重复性好，准确度高、灵敏度高的优点。
本研究采用超高效液相色谱串联质谱法建立饮料中GABA的测定方法，对市售产品进行含量测定，并基于测定结果进行饮料中GABA的膳食暴露风险评估，以期为国家在相关领域的风险评估以及监管提供强有力的技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
66份饮料样品（茶饮料33份，咖啡饮料12份，植物饮料8份，果蔬汁饮料7份，蛋白饮料3份，其他饮料3份）：市售。
乙腈、乙酸铵（均为色谱纯）：美国Thermo Fisher Scientific公司；γ-氨基丁酸标准品（纯度＞98%）：北京曼哈格生物科技有限公司；聚醚砜滤膜（0.22 μm）：天津亿鼎鑫分析仪器有限公司。
1.2 仪器与设备
岛津30A超高效液相色谱仪、Sciex4000 Q TRAP三重四级杆液质联用系统：美国AB SCIEX公司；XPR106DUH/AC分析天平：德国赛多利斯公司；IRM IDH30超声仪：德国IRM Technology GmbH公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液的配制
标准储备溶液的制备：准确称取GABA标准品10 mg（精确至0.01 mg）置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，制成1 mg/mL的标准储备溶液。
标准工作溶液的制备：精密吸取标准储备溶液适量，用水配制成质量浓度依次为1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL的标准工作溶液，用于制作标准曲线。
1.3.2 样品前处理
精确称量2 g已均匀混合的样品（精度0.01 g），置于100 mL容量瓶内，加入适量的水，超声5 min，恢复至室温后，用水定容至刻度，摇匀。将标准品溶液中GABA的质量浓度稀释至标准曲线的有效范围内，过滤膜，所得滤液供仪器分析。
1.3.3 分析条件
超高效液相色谱条件：Agilent Zorbax HILIC色谱柱（2.1×100mm，3.5μm）；柱温为35℃；进样量为2μL；流动相A：5 mmol/L乙酸铵溶液；流动相B：乙腈；流速为0.40 mL/min；具体的流动相梯度洗脱程序见表1。
表1 流动相梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program of mobile phase
时间/min 流动相A/% 流动相B/%0.00 0.50 4.00 4.50 5.00 5.50 7.50 10 10 30 50 50 10 10 90 90 70 50 50 90 90
三重四级杆质谱条件：采用电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；正离子扫描；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；离子源温度为450 ℃；离子化电压为5 500 V；喷雾气为40 psi；辅助气为40 psi。GABA的定量离子、定性离子及质谱参数见表2。
表2 γ-氨基丁酸测定质谱参数
Table 2 Mass spectrometry parameters for γ-aminobutyric acid determination
注：“*”代表定量离子。
名称 母离子（m/z） 碎片离子（m/z） 去簇电压/DP 碰撞能量/eV γ-氨基丁酸 104.2 87.1*69.1 45.1 15 15 15 17 23 30
1.3.4 膳食暴露风险评估
通过计算饮料中GABA的危害商（hazard quotient，HQ）来评估其膳食暴露风险[23-24]。当HQ值＞1时，说明膳食暴露风险较高；当HQ值＜1时，说明膳食暴露风险相对较小。HQ的计算公式如下：
式中：“检出含量”为饮料样品中检出GABA的具体含量，mg/kg；“平均膳食量”的数据来源于《中国居民饮料、乳类、茶水和酒消费状况调查报告》[25]；按照平均体质量60 kg进行计算；ADI（acceptable dailyintake）代表每日允许摄入量。
1.3.5 数据分析
采用美国AB SCIEX公司的Analyst 1.6.3软件进行分析处理，Microsoft Office Excel 2016软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的优化
2.1.1 色谱柱的选择
GABA是亲水化合物，在常规的C18色谱柱上几乎不被保留，需要采用亲水色谱柱来实现其有效分离[22，26]。实验考察了四种不同填料、品牌和规格的色谱柱，结果见图1。由图1可知，Waters UPLC
HSS T3 C18色谱柱（2.1×100mm，1.7μm）与ThermoRSLC120C18色谱柱（2.1×100mm，2.2 μm）两种常规C18色谱柱对GABA的保留能力较弱，出峰时间在1 min左右，不能实现对GABA的有效分离；Agilent Zorbax HILIC色谱柱（2.1×100 mm，3.5 μm）和Waters BEH Amide色谱柱（2.1×50 mm，1.7 μm）两种亲水作用色谱柱显著改善了GABA的保留行为，能够实现样品中GABA的有效分离。但是GABA在WatersBEH Amide色谱柱上会出现色谱峰拖尾的现象，相比之下，利用Agilent Zorbax HILIC色谱柱可以获得更为理想的色谱峰。基于上述考察结果，选择了Agilent Zorbax HILIC（2.1×100 mm，3.5 μm）作为分析色谱柱。
图1 不同色谱柱对γ-氨基丁酸峰型的影响
Fig.1 Effect of different chromatographic columns on the peak shape of γ-aminobutyric acid
2.1.2 流动相的选择
乙腈是亲水色谱柱的常用有机流动相，而在水相中添加适量的乙酸铵能够改善GABA的峰型，并增强其离子化效率，提高灵敏度[27]。实验考察了两种的流动相体系，分别为乙腈+水、乙腈+乙酸铵，从分离效果、峰形质量及响应强度三个方面进行评估。结果表明，在乙腈-水的流动相体系中GABA会出现色谱峰拖尾的情况；而在乙腈-乙酸铵的流动相体系中，峰形能得到明显改善，同时还能增强了目标化合物的响应。 实验进一步对乙酸铵浓度进行了考察，分别考察了2 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L的乙酸铵对分离效果的影响，结果表明，γ-氨基丁酸的保留时间为4.51 min，5 mmol/L乙酸铵条件下GABA的响应强度优于2 mmol/L，但浓度增加至10 mmol/L和20 mmol/L时，并未观察到更优的效果。基于考察结果，最终选择乙腈-5 mmol/L乙酸铵作为流动相。
2.2 质谱条件的优化
通过直接进样标准品的方法来优化质谱分析条件。采用100 ng/mL的GABA标准溶液作为样品，直接注入质谱仪进行测试。研究表明，在正离子模式下，GABA能够产生显著的质谱信号；相比之下，在负离子模式下则几乎没有检测信号。 在ESI+全扫描模式中，观察到了m/z为104.2的[M+H]+分子离子峰，并在此基础上调整了离子源的相关参数。 进一步通过二级质谱分析，选择了三个具有较好稳定性和响应度的特征碎片离子，其m/z分别为87.1、69.1和45.1，结果见图2。其中，m/z87.1处的碎片离子响应最好，推测该碎片可能是母离子失去NH3后形成的[M-NH3+H]+离子，实验选择m/z 87.1作为定量离子，而另外两个碎片离子作为定性离子。
图2 γ-氨基丁酸的离子提取图
Fig.2 Ion extraction diagram of γ-aminobutyric acid
响应强度由高到低的碎片离子分别为：m/z：87.1、m/z：69.1、m/z：45.1。
2.3 前处理条件的优化
2.3.1 提取时间的考察
GABA是小分子氨基酸，具有良好的水溶性而难溶于有机溶剂[7]，实验选用纯水作为提取溶剂[26]，采用超声作为提取方式。考察不同超声提取时间（5 min、10 min及15 min）对GABA提取量的影响，结果表明，延长超声时间并未显著提升目标化合物的提取含量，因此选择5 min作为超声提取时间。
2.3.2 净化方式的选择
在液相色谱串联质谱技术的电喷雾离子化阶段，食品基质里的非挥发性成分会与目标分析物竞争离子化机会，影响离子化效率，产生基质效应。 降低或消除基质效应的前处理方法包括蛋白质沉淀、液-液萃取、固相萃取、样品稀释[28-29]。 研究表明，在满足灵敏度的前提下，采用样品稀释法可以达到最佳效果[30]。 基于前期的研究，饮料中含有较高水平的GABA，可以通过稀释法来降低基质效应而同时保证检测灵敏度，实验选择样品稀释法作为净化方式。
2.4 基质效应的考察
采用已知含量的样品，对不同稀释倍数下的基质效应进行考察[22]。 将样品中目标化合物的测定值与实际值之比定义为K，根据基质效应的强度划分，当K≤0.5或K≥1.5，为强基质效应；而当0.5＜K＜0.8或者1.2＜K＜1.5时，为中等基质效应；当0.8≤K≤1.2，为弱基质效应，通常情况下可以忽略不计[32-33]。考察样品稀释倍数对基质效应的影响，结果见图3。
图3 在不同稀释倍数下饮料中γ-氨基丁酸的K值
Fig.3 K-values of γ-aminobutyric acid in beverages at different dilution ratios
由图3可知，基质效应随稀释倍数增大而减弱，当六种饮料样本稀释倍数达到100时，K值为0.93～0.99，表明基质效应可以忽略。因此，在前处理过程中决定采用100倍稀释度，并利用溶剂标准曲线法来进行定量分析。
2.5 线性范围、检出限和定量限
通过所建立的方法对标准工作溶液进行了分析，以GABA定量离子峰面积（y）作为纵坐标，GABA质量浓度（x）为横坐标绘制了线性回归方程。 结果显示，在1～200 ng/mL范围内，GABA标准曲线的线性回归方程为y=1 616.97x+92.5，相关系数r达到了0.999 9。 采用信噪比法来确定该方法的检出限和定量限，表明此条件下饮料中的GABA检出限可达25 μg/kg；定量限为50 μg/kg。
2.6 加标回收率和精密度试验
本研究通过添加不同质量浓度（50 μg/kg、100 μg/kg、500μg/kg）标准物质，依照1.3.2“样品前处理”及1.3.3“分析条件”进行回收率考察。每个加标水平考察6个平行样本，计算各水平的回收率及其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。 由表3可知，饮料中GABA三个不同加标水平下的平均回收率为99.08%～101.21%，精密度试验结果RSD为1.12%～3.21%。上述考察结果符合GB5009.295—2023《食品安全国家标准化学分析方法验证通则》的相关规定，表明该方法准确性高且稳定，适用于快速准确地测定饮料中GABA的含量。
表3 γ-氨基丁酸的加标回收率和精密度试验结果相对标准偏差
Table 3 Spiked recovery rates and relative standard deviation of precision tests results of γ-aminobutyric acid
化合物 加标水平/（μg·kg-1） 平均回收率/% RSD/%γ-氨基丁酸50 100 500 101.21 100.17 99.08 3.21 1.12 1.56
2.7 实际样品测定
本研究采用所建立的检测方法，对市场上66批次饮料中的GABA含量进行了测定，结果见表4。
表4 不同饮料中γ-氨基丁酸含量的测定结果
Table 4 Determination results of γ-aminobutyric acid in different beverages
饮料品种 含量范围/（mg·kg-1） 批次 检出率/%平均值/（mg·kg-1）茶饮料咖啡饮料果蔬汁饮料植物饮料蛋白饮料风味饮料0.05～4.01 0.05～0.94 3.66～314.00 0.05～4.33 3.26～14.20 ND～0.13 33 12 8733 100 100 100 100 100 66.67 0.62 0.20 83.87 20.14 9.20 0.05
由表4可知，除了一批风味饮料（其配料为水、三氯蔗糖及天然薄荷提取物）未检测出GABA外，其余65批次饮料中均检测到了该物质，这表明GABA在各类饮料产品中普遍存在。 值得注意的是，果蔬汁类饮料中的GABA平均含量最高，其中一批次的复原橙汁（配料为水和浓缩橙汁）的GABA含量达到了314 mg/kg。 研究结果显示，相较于其他类型，果蔬汁饮料中的GABA含量水平更高。
2.8 膳食风险评估
根据中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的2009年第12号公告中关于GABA的日推荐摄入量，假设成年人平均体质量为60 kg，推算出GABA的每日允许摄入量（ADI）为8.33 mg/（kg·bw）。本研究选取了实际检测样本作为分析对象，参考《中国居民饮料、乳类、茶水和酒消费状况调查报告》提供的饮料平均消费量（注：此报告未提供风味饮料的具体消费信息），按照1.3.4所述方法对不同饮料中GABA的膳食风险进行评估，结果见表5。
表5 饮料中γ-氨基丁酸的膳食风险评估结果
Table 5 Results of the dietary risk assessment of γ-aminobutyric acid in beverage
饮料品种 检出含量/（mg·kg-1）膳食量/（mL·d-1）参考ADI值/[mg·（kg·bw）-1] HQ茶饮料咖啡饮料植物饮料果蔬汁饮料蛋白饮料0.62 0.20 20.14 74.42 9.20 186.5 96.6 134.2 134.2 127.5 8.33 0.000 231 0.000 039 0.005 408 0.019 982 0.002 347
由表5可知，饮料中的GABA的危害商（HQ值）远低于安全阈值1，这意味着通过饮料摄入GABA所带来的膳食风险较低。
3 结论
本研究建立了快速测定饮料中GABA含量的超高效液相色谱串联质谱分析方法。 样品经过纯水超声提取后，采用稀释法降低基质效应，在乙腈-5 mmol/L乙酸铵的流动相条件下，经由亲水色谱柱Agilent Zorbax HILIC分离后，采用外标法定量。该方法前处理简便快捷、准确性高、精密度好，能够实现饮料中GABA的快速精确测定。 利用所建立的方法对市场上销售的部分饮料进行了GABA含量的测定，基于测定结果进行了膳食风险评估，结果显示饮料中GABA的膳食风险较低。本研究成果可以为后期饮料中GABA风险评估和政府监管提供有力的技术支撑。
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