咖啡果采摘后，经过加工（包括日晒/水洗/蜜处理）、干燥、脱壳可得咖啡生豆，根据需求进行烘焙即得咖啡豆，具有提神醒脑、抗疲劳、促进新陈代谢、抗氧化等功效[1-2]，受到世界各国人们的欢迎，目前主要有阿拉比卡咖啡豆（Arabica Coffee Beans）、罗布斯塔咖啡豆（Robusta Coffee Beans）、利比里亚咖啡豆（Liberica Coffee Beans）[3]。
从咖啡果到咖啡生豆的处理过程中，会经过发酵过程。发酵底物及发酵环境会影响其风味和口感[4-6]。在世界百瑞斯塔大赛（World Barista Championship，WBC）中有参赛者开创了一种名为Winey的咖啡豆处理方式，该方式采用纯种的酵母菌作为发酵剂，使得咖啡豆的品质能有质的飞跃。ZACHARY R L等[7-9]研究结果表明，接种酿酒酵母发酵后咖啡豆感官品质有所提升，然而，以纯种酵母或乳酸菌为发酵剂发酵咖啡豆存在参与的有益微生物较少，产物相对简单的问题。 酒曲是中国白酒固态发酵所用的发酵剂，其中富含的大量有益微生物（包括霉菌、酵母、乳酸菌等），可以有效地帮助咖啡豆发酵，微生物所分泌的酶类物质，如淀粉酶、蛋白酶和糖化酶等酶类，可以加速底物中的淀粉和蛋白质等物质转变成糖类、氨基酸，给发酵产物提供丰富的香气和滋味[10-13]。目前，鲜见将酒曲应用于咖啡豆发酵的研究报道。
海南省万宁市所种植的咖啡豆多为罗布斯塔咖啡果，风味相对单一[3]。为了增强其风味特征，本研究以海南罗布斯塔咖啡豆为研究对象，酒曲为发酵剂制备咖啡豆，并以杯测评分为评价指标对其发酵工艺条件进行优化，并采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）对咖啡豆的挥发性风味物质进行分析。 旨在丰富咖啡豆的风味，为海南罗布斯塔咖啡豆工业化生产提供理论依据及技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
咖啡鲜果：海南省万宁市兴隆镇；强香型酒曲（YF） ：宇丰生物科技有限公司；甜酒曲Ⅰ（AN）：广西南宁壮乡阿牛哥农产品开发有限公司；甜酒曲Ⅱ（JN）：今酿酿酒责任有限公司；酱香型大曲（RH） ：泸州瑞华生物制曲有限公司；2-辛醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、正构烷烃（C3～C30）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
MJ-160F型恒温培养箱：上海龙跃仪器设备有限公司；BN-98型咖啡烘焙机：浙江省义乌市博恩咖啡器具有限公司；CLITON CL-CFS04型手摇磨豆机：颍上头等舱科技发展有限公司；TRACE ULTRA-DSQII气相色谱-质谱联用仪：美国Thermo Fisher有限公司；顶空固相微萃取（HS-SPME）进样手柄、50/30 μm DVB/PDMS萃取头：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 咖啡豆加工工艺流程及操作要点
咖啡鲜果预处理→发酵→干燥、去银皮→烘焙→成品
操作要点：
咖啡鲜果预处理：选取颗粒饱满、无杂质、无霉烂的咖啡鲜果，清洗、沥干。 采用手工去除果壳，后加入去除果壳咖啡豆质量20%水分，以利于后续发酵。
发酵：取一定量上述经过预处理的鲜果，装料量为发酵容器承载量的60%，自然发酵或接种不同种类酒曲发酵36h。
干燥、去银皮：采用日晒法进行干燥，阳光充足，温度约为30 ℃，将水分含量控制在10%～12%后去除银皮。
烘焙：将去除银皮咖啡生豆置于150 ℃烘焙9 min，根据咖啡烘焙色卡确定达到中度烘焙[14]，即得咖啡豆成品。
1.3.2 酒曲的确定
在上述条件基础上，将不同种类酒曲（YF酒曲、AN酒曲、JN酒曲、RH酒曲）接种至经过预处理后的咖啡鲜果中，其酒曲添加量为咖啡豆的0.1%），以自然发酵样品为对照，于30 ℃条件下发酵36 h，经过干燥机中度烘培后，采用磨豆机将咖啡豆研磨至粉末（40目），根据美国精品咖啡协会（Specialty Coffee Association of America，SCAA）的标准进行杯测评分，选择最适酒曲。
1.3.3 咖啡豆发酵条件优化
单因素试验：在基础发酵条件基础上，分别考察发酵时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h）、发酵温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、装料量（10%、30%、60%、90%、100%）对杯测评分的影响。
正交试验：在单因素试验结果的基础上，以发酵时间（A）、发酵温度（B）、装料量（C）为影响因素，以杯测评分为评价指标，设计3因素3水平的L9（33）正交试验，发酵条件优化正交试验因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation condition optimization
水平 A 发酵时间/h B 发酵温度/℃ C 装料量/%1 2 3 24 36 48 20 25 30 30 60 90
1.3.4 感官评价
采用SCAA标准杯测法对咖啡进行综价[15]。称取8.25 g咖啡粉于温度约为94 ℃的150 mL过滤水中静置5 min，在充分浸泡过后，观察咖啡表面形成的由漂浮物形成的壳，用专用勺子轻轻搅拌破坏壳后，撇去这层漂浮物；用勺子取杯中中上层咖啡液，采用“吸入”的方式将咖啡液与空气同时送入口中。当咖啡液温度降低至70 ℃左右时，开始第二轮品尝；第二轮品尝时，从香气、干净度、甜质、酸质、口腔触感、风味、余韵、均衡度及整体9个方面进行评价，每项评分满分为10分，最终得分为各项分数平均分。
1.3.5 咖啡豆挥发性风味成分分析
采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）方法测定自然发酵及酒曲发酵咖啡豆的挥发性风味成分[16]。
前处理：称取1.0 g粉碎的发酵咖啡豆样品（40目）至20 mL顶空瓶中，加入适量饱和氯化钠，加入内标物2-辛醇（质量浓度为3 mg/L），于80 ℃加热30 min，30 min后用将顶空微萃取进样针扎入顶空瓶中继续加热30 min后，250 ℃进样口解吸5 min[17]。
GC条件[17]：HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序为初始温度50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升温至180 ℃保持5 min，再以10 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min；进样口温度250 ℃；传输线温度280 ℃；载气流速为1.0 mL/min；不分流进样。
MS条件：离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，电子电离（electronic ionization，EI）源，全扫描模式40～600 m/z。
定性定量分析：采用美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14检索，对所得挥发性风味物质进行初步定性；将样品和C3～C30的正构烷烃标准品在相同的气相色谱-质谱条件下分析，根据待测物质的保留时间进行定性分析，采用内标法进行定量分析。
1.3.6 数据处理
采用SPSS 26.0处理数据，Origin 8.5绘图。
2 结果与分析
2.1 酒曲的筛选
不同酒曲对咖啡杯测评分的影响见图1。 由图1可知，发酵剂种类对咖啡豆品质有较大的影响。YF酒曲的杯测评分最高，为9.5分，JN酒曲和RH酒曲次之，杯测评分分别为8.0分和7.7分。 AN酒曲与自然发酵（不加入酒曲）的杯测评分较低，分别为7.4分和6.9分。综合考虑，确定为最佳发酵剂为酒曲YF。
图1 不同酒曲对咖啡杯测评分的影响
Fig.1 Effect of different Jiuqu on cupping score of coffee
2.2 发酵条件优化单因素试验结果
2.2.1 发酵时间的确定
不同发酵时间对咖啡杯测评分的影响见图2。 由图2可知，随着发酵时间在12～60 h范围内的增加，杯测评分呈先升高后下降的趋势，当发酵时间为36 h时，咖啡的杯测评分最高，为8.4分；其原因是，发酵时间过短代谢产物较少，导致风味不足[18]，发酵时间过长，咖啡豆发酵的后期会产生令人不悦的化合物[19]。因此，确定最佳发酵时间为36 h。
图2 不同发酵时间对咖啡杯测评分的影响
Fig.2 Effect of different fermentation time on cupping score of coffee
2.2.2 发酵温度的确定
不同发酵温度对咖啡杯测评分的影响见图3。由图3可知，随着发酵温度在20～40 ℃范围内的增加，杯测评分呈现先升高后下降的趋势，当发酵温度为25 ℃时，咖啡的杯测评分最高，为8.8分。 其原因可能是，较低的温度条件下酵母和细菌的代谢活动缓慢，无法充分分解咖啡豆中的糖分和其他化合物，导致风味不足；当发酵温度为25 ℃时，微生物的代谢活动处于最佳状态，酵母和细菌等微生物可有效地发酵，促进了的糖分转化及其他风味化合物的生成；当发酵温度超过25 ℃时，过度发酵产生了过多的醇类或酸类物质，影响咖啡的整体风味[20]。因此，确定最佳发酵温度为25 ℃。
图3 不同发酵温度对咖啡杯测评分的影响
Fig.3 Effect of different fermentation temperature on cupping score of coffee
2.2.3 装料量的确定
不同装料量对咖啡杯测评分的影响见图4。由图4可知，随着装料量在20%～100%范围内的增加，杯测评分呈现先升高后降低的趋势，当装料量为60%时，杯测评分最高，为8.4分。 较少的装料量使咖啡豆之间的接触面积较小，导致发酵不充分；当装料量为60%时，咖啡豆的密度适宜，促进发酵过程中芳香物质和酸性的合理形成[21]，微生物的数量以及氧气含量达到最佳，微生物代谢旺盛[22]。若装料量过多，氧气供应不足影响微生物生长代谢。因此，确定最佳装料量为60%。
图4 不同装料量对咖啡杯测评分的影响
Fig.4 Effect of different loading volume on cupping score of coffee
2.3 发酵条件优化正交试验结果
在单因素试验结果的基础上，以发酵时间（A）、发酵温度（B）、装料量（C）为影响因素，以杯测评分为评价指标，设计3因素3水平的L9（33）正交试验，正交试验结果与分析见表2。
表2 发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation condition optimization
试验号 A B C 空白 杯测评分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 2 1 1 1 3 3 2 3 2 1 3 1 2 3 2 2 1 3 3 2 1 3 3 1 2 2 1 2 2 1 3 1 2 1 3 3 7.2±0.04 8.6±0.03 7.3±0.10 6.9±0.08 7.2±0.11 7.4±0.09 9.0±0.04 7.1±0.05 7.0±0.08 k2 k3R 7.60 7.73 7.23 0.50 7.20 7.77 7.60 0.57 7.23 8.23 7.10 1.10 7.83 7.73 7.00 0.83
由表2可知，各因素对咖啡杯测评分的影响顺序为C＞B＞A，通过正交试验结果的极差分析可知，最佳发酵工艺组合为A2B2C2，即发酵时间36 h，发酵温度25 ℃，装料量60%，在此优化条件下，杯测评分为9.0分。
2.4 自然发酵与酒曲发酵咖啡豆挥发性风味物质分析
自然发酵及YF酒曲发酵咖啡豆中共检出124种挥发性风味物质，选取相对含量差值＞0.1%的挥发性风味化合物进行分析，结果见表3。由表3可知，相对含量差值＞0.1%的挥发性风味化合物共22种，其中，酚类5种，醛类、吡嗪类、杂环类及烷烃类均为3种，芳香族化合物、酯类、酮类、醇类及醚类各1种。 其中，差异最大的挥发性风味物质为2-乙基吡嗪，与对照相比（相对含量6.985%），其在酒曲发酵的咖啡豆中增加2.035%（相对含量4.950%），其次为5-乙烯基-2-甲氧基-苯酚，该化合物在添加酒曲发酵的咖啡豆中相对含量增加1.835%。 其他化合物相对含量差值范围在0.10%～0.25%。此外，2-苯基-1H-吡咯-3-甲醛、乙酸异丁香酚酯、丁香酚、2,5-二叔丁基酚、3-羟基-β-大马士革酮、3,5-二甲基-2-苯基1H吡咯、十二烷、2-甲基十六烷、5,8-二乙基十二烷9种挥发性风味物质在自然发酵咖啡豆香气物质中未检出，2-苯基-1H-吡咯-3-甲醛、乙酸异丁香酚酯、丁香酚赋予咖啡豆丁香、肉桂味的香辛料香；2,5-二叔丁基酚赋予咖啡豆以烟薰香；3-羟基-β-大马士革酮赋予咖啡豆果香、花香；7-甲基-1,8-萘啶-4-醇提供胡椒味；十二烷、2-甲基十六烷和5,8-二乙基十二烷3种物质赋予咖啡豆脂肪香。 挥发性风味物质含量增加的挥发性风味物质成分较多且香气成分复杂，为咖啡的香气增加了复杂性和突出性。挥发性风味物质含量减少的香气成分共5种，分别为赋予咖啡豆泥土味的2-乙基吡嗪和1-（2-呋喃基甲基）-1H-吡咯，赋予咖啡豆焦糖味的5-甲基呋喃醛和α-呋喃基登-α-呋喃甲基胺，以及赋予咖啡豆烤坚果、可可香的2,6-二乙基吡嗪。
表3 自然发酵及酒曲发酵咖啡豆中相对含量差值＞0.1%的挥发性风味物质分析
Table 3 Analysis of volatile flavor substances with relative content difference＞0.1% in naturally fermented and Jiuqu-fermented coffee beans
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续表
对照组发酵组序号 种类 化合物 保留时间/min 香气特征[23-25]相对含量/%17 18 19 20 21 22杂环类2.465 2.393烷烃类1-（2-呋喃基甲基）-1H-吡咯α-呋喃基登-α-呋喃甲基胺3,5-二甲基-2-苯基1H吡咯十二烷2-甲基十六烷5,8-二乙基十二烷14.448 20.725 24.224 14.884 24.444 25.124-- - -2.373 2.175 0.143 0.132 0.109 0.153泥土味焦糖香微弱焦香脂肪香气脂肪香气油脂味
对咖啡香气特征影响较大的挥发性成分主要为吡嗪类、醇类、酯类、醚类、酚类、醛类等组分[26]。其中吡嗪类通常赋予咖啡坚果、土壤、烘焙的香气，样品中2-乙基吡嗪和2,6-二乙基吡嗪相对含量较高，能够很好解释咖啡中坚果、可可等香气来源[27-30]。 醇类通常赋予咖啡果香、花香等香气，酒曲发酵咖啡中7-甲基-1,8-萘啶-4-醇相对含量较高（2.12%），该化合物中的萘啶基团将会为咖啡提供木制香气和类似草药的植物性香气；酯类赋予咖啡果香、甜美、清新的香气。茴香醚在发酵组及对照组中相对含量分别为2.111%、1.901%，为咖啡豆提供茴香味和甘草甜香，增加了咖啡香气的丰富度；醛类赋予咖啡果香、绿叶、香草的香气。酚类所带给咖啡的香气更为复杂，通常表现为烟熏、木制以及香料的味道[31]。5-乙烯基-2-甲氧基苯酚在发酵组及对照组组中相对含量分别为17.367%、15.532%，通常带有香草和些许花香气息，能够为咖啡增添细腻和清新的香气，4-乙基-2-甲氧基苯酚的相对含量也较高，在发酵组及对照组中相对含量分别为4.404%、0.437%，该物质将为咖啡带来烟熏和木制等香气，与其他香气组合一起后使咖啡香气更有层次感与复杂感。
综上，添加酒曲发酵的咖啡豆中5-乙烯基-2-甲氧基-苯酚、丁香酚等具有优良风味的物质相对含量增加，而呈泥土味的2-乙基吡嗪等对风味有负面作用的香气物质减少，从而有效提升了咖啡豆的品质。
3 结论
本研究对海南产罗布斯塔咖啡豆的发酵条件进行优化，并采用HS-SPME-GC-MS技术对其挥发性成分进行分析。结果表明，最佳发酵条件为：以YF酒曲作为发酵剂，装料量60%、发酵温度25 ℃、发酵时间36 h。在此优化条件下，咖啡杯测评分为9.0分，自然发酵、酒曲发酵咖啡豆中相对含量差值＞0.1%的挥发性风味化合物共22种，包括酚类5种，醛类、吡嗪类、杂环类及烷烃类各3种，芳香族化合物、酯类、酮类、醇类及醚类各1种，其中，添加酒曲发酵的咖啡豆中5-乙烯基-2-甲氧基-苯酚、丁香酚等具有优良风味的物质含量增加，而呈泥土味的2-乙基吡嗪等对风味有负面作用的香气物质减少，从而有效提升了咖啡豆的品质，本研究可为咖啡风味品质提升提供数据支撑。
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