近年来，全球精酿啤酒市场呈快速扩张趋势[1]，消费者对高品质、个性化啤酒的需求日益旺盛[2]。数据显示，据《2023年精酿啤酒行业研究报告》显示，截至2023年底，中国精酿啤酒市场规模已达到68亿元，同比增长3%。预计到2025年，中国精酿啤酒的渗透率将提升至6.3%，市场规模将达到1 040亿元[3]。但随精酿啤酒市场持续扩张，饮酒引起的痛风问题日益加重[4]。酒精代谢产生的乳酸会抑制尿酸的排泄，同时促进嘌呤合成的关键酶—黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活性，导致血尿酸水平升高[5-6]，而高嘌呤食物如肉类、海鲜等的摄入增加了关键酶的底物使肝脏功能受损[7-8]，进一步增加痛风风险[9]。
蒲公英（Taraxacum mongolicum）富含三萜类、黄酮类、植物甾醇类等活性物质[10-11]，具有抗炎、抗氧及利尿等功效[12]，其清香微苦的独特口味[13]，与啤酒的口感较为契合。研究显示，蒲公英啤酒能有效抑制XOD的活性，抑制率达65.16%[14]；另外，蒲公英醇和蒲公英苦素能减轻肝损伤并促进修复[15-16]，可赋予啤酒抗痛风、护肝等健康功能[17]。
兼具保健功效及独特风味的精酿啤酒是行业发展的重要方向[18]。 酯类成分是啤酒风味的关键成分，对其生产工艺进行优化能显著提升啤酒的品质[19]，另外还可平衡精酿啤酒的生物活性与风味特性，使啤酒在发挥缓解尿酸升高、抗痛风等作用的同时拥有更宜人的香气，为啤酒多元化、健康化发展提供新的方向[20]。
本研究在精酿啤酒的基础上添加蒲公英制备蒲公英精酿啤酒，通过单因素试验和Box-Behnken响应面试验对蒲公英精酿啤酒酿造工艺进行优化，并分析蒲公英精酿啤酒产品理化指标、微生物指标、风味物质及生物活性成分，旨在研发一款既有XOD抑制活性、又具有抗氧化活性及酯香浓郁特征的蒲公英精酿啤酒，为其产业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大麦芽（特制加拿大麦芽、焦香麦芽20型）、小麦麦芽：中粮集团有限公司；蒲公英：长白山地区野生蒲公英（自采）；酒花（普莱米特、极光酒花、黄金酒花）：斯丹纳酒花（珠海）有限公司；慕尼黑啤酒活性干酵母（上面酵母）：威海德科生物科技有限公司；β-葡聚糖酶：诺维信（中国）生物技术有限公司；乳酸、单宁（均为分析纯）：济南双麦啤酒物资有限公司；芦丁标准品（纯度＞98%）：国药化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海麦克林生化科技有限公司；黄嘌呤（分析纯）、黄嘌呤氧化酶（50 U/mg）：北京索莱宝科技有限公司；乙醛、甲酸乙酯等11种风味混合标样（均为色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
300 L啤酒中试设备（配有麦芽对辊粉碎机、糖化锅、过滤槽、煮沸锅、回旋沉淀槽、冷却薄板、麦汁充氧器、酵母添加罐、发酵罐、原地清洗（clean in place，CIP）罐、半自动真空灌装机）：哈尔滨汉德轻工医药装备有限责任公司；DMA5000全自动啤酒分析仪：Anton Paar股份有限公司；CLARUS500气相色谱（gas chromatography，GC）仪：美国PerkinElmer公司；UV2550紫外分光光度计：日本岛津公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蒲公英精酿啤酒加工工艺流程及操作要点
操作要点：
蒲公英粉制备：将蒲公英清洗晾干后，于58 ℃干燥12 h，进行粗粉碎至50目。
麦芽粉碎：以300 L麦汁，原麦汁浓度11.5°P为基准。称取特制加拿大麦芽42 kg，焦香麦芽20型4.5 kg，小麦麦芽3.5 kg，喷水增湿，手抓不黏手后用对辊粉碎机粉碎，辊间距0.15～0.20 mm。
糖化：37 ℃水投料200 L，倒入粉碎麦芽，休止20 min后，15 min升温至52 ℃休止30 min，19 min升温至71 ℃休止30 min，7 min升温至78 ℃，倒入过滤槽。
过滤：铺水20 L至没过筛板，倒醪结束回流10～20 min至麦汁清亮，再用220 L、78 ℃酿造水洗糟，总过滤量370 L。头道麦汁浓度14.5°P。
煮沸：过滤到280 L时，开启加热器，预热至98 ℃，加乳酸约20 g（根据麦汁发酵初始pH值要求调节乳酸添加量）。煮沸90 min，煮沸结束前15 min添加食用单宁15 g，卡拉胶3.0 g，煮沸强度12%，麦汁出锅浓度11.5°P。
酒花、蒲公英添加：第一次在煮沸开始时添加30 g普莱米特酒花；第二次在煮沸50 min时添加96 g极光酒花；第三次在煮沸结束前10 min添加90 g黄金香花和300 g蒲公英粉。
回旋沉淀与麦汁冷却：麦汁切线进入回旋沉淀槽，回旋3 min，静置沉淀20 min。 麦汁30 min内冷却至（16.0±0.5）℃，采用压缩空气给麦汁充氧，溶解氧为7～9 mg/L。
酵母活化与扩培：称取干酵母40 g，加入到400 mL、30 ℃无菌水内活化30 min，再加入40 L麦汁中，20 ℃活化48 h，酵母数达到1.7×107 CFU/mL。
发酵：满罐温度（16.0±0.5）℃，自然升温到（20.0±0.3）℃主发酵，满罐后18 h、24 h、30 h、60 h各排放一次冷凝固物。糖度降至4.0～4.5°P开始升压，且控制在0.08 MPa。 升压后酵母数降到1.0×107 CFU/mL以下排放酵母，总双乙酰降至0.18 mg/L并糖度降至2.7°P以下主酵结束，开始以1.0 ℃/h的速度降温至10 ℃，保温24 h，以0.5 ℃/h的速度降至4 ℃，保温24 h，以0.2 ℃/h的速度降至（-1.5±0.3）℃保温，低温储存20 d以上进行灌装。
成品灌装：灌装前24 h排放一次酵母，酒缸内二氧化碳背压0.18 MPa。取灭菌后的棕色啤酒瓶和瓶盖，进行半自动抽真空灌装、压盖，灌装后，即得蒲公英精酿啤酒成品。
1.3.2 蒲公英精酿啤酒的酿造工艺优化
（1）单因素试验
在上述酿造工艺基础上，采用单一变量原则，分别考察蒲公英添加量（0、1.5 g/L、2.5 g/L、3.5 g/L、4.5 g/L）、初始pH值（4.2、4.5、4.8、5.1、5.4）、发酵温度（14 ℃、16 ℃、18 ℃、20 ℃、22 ℃）对蒲公英精酿啤酒的总酯含量及苦味值的影响，其中总酯含量（甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯含量之和）为主要评价指标，苦味值作为辅助指标。
（2）响应面试验[21-22]
基于单因素试验结果，以总酯含量（Y）为响应值，以蒲公英添加量（A）、初始pH （B）、发酵温度（C）为自变量，进行3因素3水平Box-Benhnken试验设计，利用响应面分析软件Design Expert 10.0.3进行多元回归分析和模型验证，以获得蒲公英精酿啤酒的最佳酿造工艺。响应面试验因素与水平见表1。
表1 蒲公英精酿啤酒酿造工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for brewing process optimization of dandelion craft beer
水平 A 蒲公英添加量/（g·L-1） B 初始pH值 C 发酵温度/℃-1 01 1.5 2.5 3.5 4.5 4.8 5.1 16 18 20
1.3.3 分析检测
挥发性风味物质含量：采用气相色谱法测定。 气相色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.53 mm×1 μm）、进样口温度200 ℃、检测器温度230 ℃、氢气45 mL/min、空气450 mL/min、载气为高纯氮气（N2）、流速8 mL/min、分流比为1∶1；升温程序为38 ℃保温2 min，10 ℃/min升温至60 ℃保温0 min，20 ℃/min升温至120 ℃，40 ℃/min升温至200 ℃保温0 min。
酒精度、原麦汁浓度、色度、发酵度、α-氨基酸态氮、总酸、苦味值、双乙酰含量测定：采用国标GB/T 4927—2008《啤酒》中的方法[23]。
总黄酮含量的测定：参考YANG J Y等[24]的方法；DPPH自由基清除率测定：参考CAI L L等[25]的方法；XOD抑制率的测定：参考GHALLAB D S等[26]的方法。
1.3.4 感官评价
邀请啤酒企业12名受过专业训练的品评人员，对未添加蒲公英的精酿啤酒、工艺优化前的蒲公英精酿啤酒、工艺优化后的蒲公英精酿啤酒、市场上购买的普通工业啤酒，进行感官评分，结果取平均值。感官评分标准见表2。
表2 蒲公英精酿啤酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of dandelion craft beer
项目 评价标准 分值/分外观（20分）呈饱满琥珀色，微有酵母悬浮琥珀色轻微失光，较多酵母悬浮琥珀色严重失光，很浑浊18～20 15～16＜15香气（20分）酯香、酒花香和蒲公英的香气明显，综合香气协调酯香明显、酒花的香气突出，蒲公英的香气较淡酯香、酒花香不明显或过于突出，蒲公英的香气较淡或无香气18～20 10～15＜10口味（40分）口感纯净清新，酒体协调无突出的酵母味、老化味和其他异味，蒲公英的清苦明显、协调口感较纯净，酒体协调无突出的酵母味、老化味和其他异味，有蒲公英的清苦味、但不协调口感不纯正，酒体的协调性不佳，有老化味或发酵糖的甜味、酵母味，蒲公英苦味轻微、有后苦35～40 20～35＜20
续表
项目 评价标准 分值/分泡沫（20分）泡沫洁白细腻，持久挂杯泡沫略微洁白细腻，较持久挂杯泡沫不够洁白，持久性差18～20 10～15＜10
2 结果与分析
2.1 蒲公英精酿啤酒酿造工艺优化单因素试验结果
2.1.1 蒲公英添加量对总酯含量及苦味值的影响蒲公英添加量对总酯含量及苦味值的影响见图1。
图1 蒲公英添加量对蒲公英精酿啤酒总酯含量及苦味值的影响
Fig.1 Effect of dandelion addition on total esters contents and bitterness values of dandelion craft beer
由图1可知，蒲公英精酿啤酒的总酯含量及苦味值随着蒲公英添加量在0～4.5 g/L范围内的的增加而呈先上升后下降的趋势。当蒲公英添加量分别为0～2.5 g/L时，总酯含量随之升高；当蒲公英添加量为2.5 g/L时，总酯含量达到最大值，为26.78 mg/L，此时苦味值为19.1 IBU；当蒲公英添加量＞2.5 g/L之后，总酯含量有所下降。啤酒的苦味值随蒲公英添加量增加无明显变化。 这可能是由于蒲公英影响酵母发酵及产酯能力，但其添加量对啤酒中的α-酸转化成异α-酸影响不大。 综上，选择最适蒲公英添加量为2.5 g/L。
2.1.2 发酵初始pH对总酯含量及苦味值的影响
发酵初始pH对总酯含量及苦味值的影响见图2。
图2 初始pH值对蒲公英精酿啤酒总酯含量及苦味值的影响
Fig.2 Effect of initial pH on total esters contents and bitterness values of dandelion craft beer
由图2可知，麦汁发酵初始pH值在4.2～5.4范围内时，总酯含量呈先升高后降低的趋势，苦味值呈逐渐升高的趋势。 当初始pH值为4.2～4.8时，总酯含量随之升高；当初始pH值为4.8时，总酯含量达到最大值，为26.25 mg/L，此时苦味值为17.6 IBU；当初始pH值＞4.8之后，总酯含量有所下降。 较低的pH会增强酵母的酯酶活性，提高总酯含量，但试验证明当pH低于4.5时，产酯量反而降低，可能是因为更低的pH，抑制酵母发酵产酸，降低酵母整体活力。 综上，选择发酵最适初始pH值为4.8。
2.1.3 发酵温度对总酯含量及苦味值的影响
发酵温度对总酯含量及苦味值的影响见图3。
图3 发酵温度对蒲公英精酿啤酒总酯含量及苦味值的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on total esters contents and bitterness values of dandelion craft beer
由图3可知，啤酒中的总酯含量、苦味值随发酵温度在14～22 ℃范围内的升高分别呈先上升后趋于平稳、先上升再下降的趋势。发酵温度在14～18 ℃时，啤酒中的总酯含量、苦味值随发酵温度增加而逐渐上升；当发酵温度为18 ℃时，苦味值最高，为18.5 IBU，此时总酯含量为26.78 mg/L；当发酵温度＞18 ℃之后，总酯含量趋于稳定，苦味值逐渐下降。这可能是由于发酵温度影响酵母发酵活性导致酵母代谢过慢或过快[27-28]，使酵母产生絮凝沉淀，吸附苦味物质，使苦味值变低。综上，选择最适发酵温度为18 ℃。
2.2 蒲公英精酿啤酒酿造工艺优化响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面及方差分析
在单因素试验结果的基础上，以总酯含量（Y）为响应值，以蒲公英添加量（A）、初始pH（B）、发酵温度（C）为自变量，采用Design Expert 10.0.3软件进行3因素3水平Box-Benhnken试验设计，并对试验结果进行回归分析。响应面试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 蒲公英精酿啤酒酿造工艺优化响应面试验设计与结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for brewing process optimization of dandelion craft beer
试验号 A 蒲公英添加量/（g·L-1）B 初始pH值C 发酵温度/℃ Y 总酯含量/（mg·L-1）1 234567891 0 11 12 13 14 15 16 17 2.5 1.5 2.5 3.5 2.5 2.5 3.5 2.5 3.5 1.5 1.5 2.5 2.5 3.5 2.5 2.5 1.5 5.1 5.1 5.1 5.1 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.5 4.5 4.5 4.5 16 18 20 18 18 18 20 18 16 16 20 18 18 18 16 20 18 24.35 24.26 21.79 23.96 27.63 27.85 22.55 27.56 24.72 24.05 24.36 28.12 27.48 22.77 22.91 22.04 23.87
表4 回归模型方差分析结果
Table 4 Variance analysis results of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“ns”表示对结果影响不显著（P＞0.05）。
来源 离差平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型**ABCA B****AC BC A2 B2 C2 96.26 9.35 11.13 40.58 1.86 17.84 8.28 100.26 325.17 275.55＜0.000 1 0.018 4 0.012 5 0.000 4 0.215 3 0.003 9 0.023 7 0.000 0 0.000 0 0.000 0 ns*********残差失拟项纯误差总和74.69 0.81 0.96 3.50 0.16 1.54 0.71 8.64 28.03 23.76 0.60 0.34 0.27 75.29 91111111117341 6 8.30 0.81 0.96 3.50 0.16 1.54 0.71 8.64 28.03 23.76 0.09 0.11 0.07 1.67 0.309 2 ns
采用Design Expert 10.0.3软件对表3数据进行回归分析，得到多元二次回归方程：
由表4可知，回归模型F值为96.26，回归模型P值＜0.000 1，极显著；失拟项P值=0.309 2＞0.05，不显著，表明模型可靠。回归模型决定系数R2=0.992 0，校正决定系数R2adj为0.981 7，表明本试验回归模型与实际试验拟合度较高。由P值可知，一次项A、B，交互项BC对结果影响显著（P＜0.05），一次项C，交互项AC，二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01）。由F值可知，影响蒲公英精酿啤酒总酯含量的因素顺序为：发酵温度（C）＞初始pH（B）＞蒲公英添加量（A）。
2.2.2 各因素的交互作用
响应面越陡峭，等高线越趋于椭圆形，表明各因素间交互作用对蒲公英精酿啤酒总酯含量影响越强；反之，响应面越平缓，等高线越趋于圆形，表明各因素间交互作用对蒲公英精酿啤酒总酯含量影响越弱。各因素的交互作用对蒲公英精酿啤酒总酯含量影响的响应面及等高线见图4。
图4 各因素间交互作用对蒲公英精酿啤酒总酯含量影响的响应面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the total ester contents of dandelion craft beer
由图4可知，AB间交互作用响应面坡度较为平缓，等高线趋于圆形，说明蒲公英添加量和初始pH值有交互作用，但交互作用对结果影响较小，AC、BC间交互作用的响应面坡度陡峭、等高线呈椭圆形，说明交互作用对结果影响较大，这与方差分析结果一致。
2.2.3 验证试验结果
采用Design Expert 10.0.3软件分析回归模型，得到蒲公英精酿啤酒优化后的最佳酿造工艺为蒲公英添加量为2.424 g/L，初始pH值4.823、发酵温度为17.727 ℃。在此条件下，总酯含量预测值为27.798 mg/L。为方便实际操作，修正酿造工艺条件为蒲公英添加量2.4 g/L，初始pH值4.8、发酵温度为18 ℃。在此条件下进行3次平行验证试验，得到总酯含量实际值为27.648 mg/L，与预测值相比，误差值在5%范围内，可见本模型能够较好地模拟和预测蒲公英精酿啤酒的总酯含量。
2.3 蒲公英精酿啤酒挥发性风味物质、理化指标及其生物活性分析
2.3.1 成品酒主要挥发性风味物质检测
采用气相色谱法对优化后的蒲公英精酿啤酒的11种主要挥发性风味物质进行检测，结果见表5。由表5可知，蒲公英精酿啤酒的总酯（甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯）、总高级醇（异丁醇、异戊醇、正丙醇）含量分别为27.648 mg/L、100.732 mg/L，醇酯比为3.64，乙醛、二甲基硫（dimethyl sulphide，DMS）含量分别为1.476 mg/L、0.05 mg/L。
表5 蒲公英精酿啤酒主要挥发性风味物质检测结果
Table 5 Determination results of main volatile flavor substances of dandelion craft beer
化合物 含量/（mg·L-1） 化合物 含量/（mg·L-1）乙醛甲酸乙酯乙酸异丁酯异丁醇异戊醇辛酸乙酯总酯1.476±0.15 0.641±0.05 0.479±0.01 20.127±2.05 60.518±3.55 0.109±0.01 27.648 DMS乙酸乙酯正丙醇乙酸异戊酯己酸乙酯总高级醇醇酯比0.050±0.01 23.518±2.15 20.087±2.03 2.567±0.15 0.334±0.02 100.732 3.64
2.3.2 成品酒理化及微生物指标分析
对蒲公英精酿啤酒成品酒进行理化及微生物指标检测，结果见表6。由表6可知，蒲公英精酿啤酒的理化及其微生物指标均满足国标GB 4927—2008《啤酒》要求。
表6 蒲公英精酿啤酒理化及微生物指标测定结果
Table 6 Determination results of physicochemical and microbial indexes of dandelion craft beer
注：“-”表示未检出。
项目 结果 项目 结果原麦汁浓度/°P酒精度/%vol发酵度/%色度/EBC pH值细菌总数/（CFU·mL-1）11.40±0.01 4.63±0.02 70.00±0.15 10.20±0.15 4.23±0.01＜40总酸/（mL·100 mL-1）苦味值/IBU总双乙酰/（mg·L-1）悬浮酵母数/（×107 CFU/mL-1）大肠菌群/（MPN·100 mL-1）1.72±0.01 18.60±0.15 0.14±0.01 0.35±0.10-
2.3.3 生物活性分析
对蒲公英精酿啤酒的总黄酮含量、XOD抑制率和DPPH自由基清除率进行检测并与未添加蒲公英的啤酒进行对比分析，结果见表7。
表7 蒲公英精酿啤酒活性成分含量及生物活性检测结果
Table 7 Determination results of active component contents and biological activities of dandelion craft beer
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
酒样 总黄酮含量/（mg·L-1）DPPH自由基清除率/%未添加蒲公英精酿啤酒蒲公英精酿啤酒XOD抑制率/%69.38±0.54a 123.56±1.23b-20.81±0.55a 35.08±1.13b 88.77±1.65a
由表7可知，蒲公英的精酿啤酒的总黄酮含量、DPPH自由基清除率分别为123.56 mg/L、88.77%，均显著高于普通精酿啤酒（P＜0.05），同时对XOD具有较好的抑制作用，抑制率达到20.81%，由此可以说明蒲公英的添加能够显著提高蒲公英精酿啤酒的总黄酮含量和DPPH自由基清除率，从而抑制XOD的活性，赋予蒲公英精酿啤酒抗氧化、清除自由基、缓解尿酸升高的生物活性。
2.3.4 感官评价结果
以未添加蒲公英的精酿啤酒为对照组，工艺优化前的蒲公英精酿啤酒为比较组，工艺优化后的蒲公英精酿啤酒为优化组及市场上购买的普通工业啤酒为市场组，对4组啤酒样品进行感官评价，结果见图5。由图5可知，优化组精酿啤酒感官评分最高，为93.33分，酒体醇厚、酯香浓郁协调，有酒花香及蒲公英特有的清香，口感纯正，苦味适当；比较组精酿啤酒的感官评分为88.67分，酯香及苦味协调性稍显不足；对照组精酿啤酒感官评分为81.50分，酯香不明显，口感粗糙，有后苦；市场组啤酒感官评分为76.75分，香气不明显，口感寡淡，微有老化味。
图5 各组啤酒样品感官评价结果
Fig.5 Sensory evaluation results of various groups beer samples
3 结论
蒲公英精酿啤酒酯类香气优化及其生物活性分析的研究，创新研发了一款具备XOD抑制活性，同时酯香浓郁的精酿啤酒，开拓了精酿啤酒市场，缓解了爱酒人士对痛风的焦虑，同时解决了精酿啤酒后苦问题，提升了酯香品质。在本研究操作要点的独特工艺下，通过响应面分析优化，得到最佳酿造工艺条件为：蒲公英添加量为2.4 g/L、初始pH值4.8、发酵温度18 ℃。在此工艺下总酯含量可达27.648 mg/L，酯香浓郁、水果香气明显、酒体厚重，苦味适中、回甘。蒲公英精酿啤酒总黄酮含量为123.56 mg/L、XOD抑制率为20.81%、DPPH自由基清除率为88.77%，感官评分为93.33分。蒲公英精酿啤酒具有体外抗氧化活性及XOD抑制活性，具有良好的开发应用前景。
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