李子（Prunus salicina）为蔷薇科李亚属木本植物的果实[1]。 果实皮薄多汁，酸甜可口，富含蛋白质、有机酸、类胡萝卜素、多酚类等多种营养与生物活性物质，被广泛应用于果酒加工[2]。香气是李子果酒最重要的感官品质指标之一，决定着果酒的质量和风格[3]。 其中，菌种可通过代谢产生醇、酯、酸、醛、酮等多种香气成分，影响李子果酒香气风味特征。酿酒酵母因其乙醇转化率高、发酵纯净彻底且风味优良被广泛应用于各种果酒生产，但纯种发酵菌导致果酒风味单一，不能满足消费者对多样化产品需求[4]。
除酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）外，非酿酒微生物不仅可通过代谢产生香气物质，同时还通过产生多种酶以及与酿酒酵母之间相互作用对果酒风味品质起到积极作用，同时还能够缩短发酵周期、降低成本[5-7]。 红曲菌是自然界广泛存在的一种丝状真菌，能产生红曲色素、酯化酶、糖化酶等，可提高原料利用率、缩短糖化时间、控制酯类合成， 增加酒体中氨基酸和挥发性风味物质种类和含量，提升果酒口感和香气，被广泛应用于白酒和黄酒发酵[8-11]。郑天柱[12]以红曲米发酵菠萝酒发现，醇类、酯类、酸类物质在红曲菠萝酒中相对含量较高， 共同赋予红曲菠萝酒独特的酒香和果香。 陈烁等[13]采用酵母一次发酵，红曲二次发酵技术酿造红曲火龙果酒， 其总酯含量可达15.415 g/L，其感官品质有所提升。 目前，关于红曲发酵制备李子果酒的研究鲜见报道。
本研究以脆红李为原料，以未添加红曲米的李子果酒为对照，以红曲米与酿酒酵母混合发酵的李子果酒为实验组，采用常规检测方法及顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS） 分别分析其理化指标、颜色参数及挥发性风味物质，并基于检测结果进行正交偏最小二乘法-判别分析 （orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）， 结合感官评价分析其感官品质。以期为红曲米在李子果酒发酵中的应用提供科学依据，为李子果酒的开发提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
脆红李：四川梦源巴山农业集团有限公司；红曲：福建省源曲生物科技有限公司；酿酒酵母：安琪公酵母股份有限公司。
1.1.2 化学试剂
酚酞试剂、NaOH、氯化钠、偏磷酸、甲醇、乙醇（均为分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；果胶酶（10万U/g）、1,1二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定试剂盒、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基清除能力测定试剂盒、铁离子还原/抗氧化能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定试剂盒：江苏科佑化学品有限公司。
1.2 仪器与设备
XY-8677型德玛仕破壁料理机：佛山市德玛仕网络科技有限公司；MDF-86V340E型医用低温保存箱、SW-CJ-2FD双人单面净化工作台：安徽中科都菱商用电器股份有限公司；高速榨汁机TD5A型低速离心机：河南北宏实业有限公司；CHROMA METEA CR-400型色差仪：日本柯尼卡美能达公司；ZORBAX-SB C18型液相色谱柱、Intuvo 9000气相色谱仪和5977B质谱仪、DW-WAX UI毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美国安捷伦技术科技（中国）有限公司；50 μm DVB/CAR/PDMS SPME固相微萃取头：美国默克色谱科技公司。
1.3 方法
1.3.1 李子果酒加工工艺流程及操作要点
李子→清洗、去核、打浆→成分调整→酶解→接种→发酵→皮渣分离→倒罐→陈酿→成品
操作要点：
挑选全熟、无机械伤、无霉变的李子，清洗晾干后将脆红李果肉和水按照1∶1的质量比打浆，于果浆中添加8%亚硫酸钠1.2 mL/kg（以果浆基质质量计），加蔗糖调节糖度至22%，添加0.03%的果胶酶，35 ℃保温5 h，加热至72 ℃保持15 min灭酶，冷却。单菌发酵组（SC）：将0.02%酿酒酵母接种至果浆中，混菌发酵组（HS）按4%红曲米、0.02%酿酒酵母接种至果浆中发酵，置于28 ℃发酵9 d，皮渣分离倒罐后15 ℃陈酿60 d，即得李子果酒。
1.3.2 理化指标检测
总糖、pH、总酸、挥发酸、干浸出物和酒精度检测：参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
颜色参数：采用色差仪进行检测。 L*值表示明亮度，+表示偏亮，-表示偏暗；a*值表示红绿度，+表示偏红，-表示偏绿；b*值表示黄蓝度，+表示偏黄，-表示偏蓝。C*值表示色度，C*值越大，表示颜色的饱和越高，反之则饱和度越低。
1.3.3 挥发性风味物质检测
采用HS-SPME-GC-MS检测李子果酒挥发性风味物质[14]。
HS-SPME条件：称取1.0 g NaCl到5 mL李子果酒样品中，转移到20 mL顶空瓶中，将DVB/CAR/PDMS固相微纤维头于45 ℃条件下平衡10 min后插入顶空瓶中，于45 ℃条件下吸附萃取40 min后拔出，插入气相色谱仪进样口，250 ℃条件下解吸5 min。
GC条件：DW-WAX UI毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25μm），载气为氦气（He）（纯度≥99.999%），流速1mL/min；无分流进样；程序升温条件为起始温度35 ℃，维持3 min；以6 ℃/min升至150 ℃，维持1 min；然后再以12 ℃/min升至250 ℃，维持3 min。MS条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV；离子源温度为230 ℃；接口温度为280 ℃；质量扫描范围为20～550 u。
定性定量分析：将获得的质谱数据与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）70标准谱库进行检索，并结合保留指数进行定性分析；选取匹配度＞60%的挥发性风味成分，采用峰面积归一化法进行相对定量。
1.3.4 感官评价
采用定量描述分析法对葡萄酒样品的感官特性进行评价，评审小组由15名经过感官培训的专业人员组成，从色泽、澄清度、香气、口感、滋味及典型性6个方面对李子果酒进行感官评价，每项指标满分10分，李子果酒感官评价标准见表1。
表1 李子果酒感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of plum wine
项目 评分标准 得分/分色泽（10分）澄清度（10分）香气（10分）口感（10分）滋味（10分）典型性（10分）色泽鲜明，有原果汁颜色，无氧化褪色颜色基本协调，色彩分布稍微不均有颜色暗沉，看不出原果汁色泽酒体完全透明，无悬浮物或沉淀，透光均匀酒体轻度浑浊，有少量悬浮颗粒物酒体重度浑浊，有大量悬浮颗粒物酒香和果香浓郁、纯正、和谐酒香和果香较少、无明显不良气味酒香和果香不足、有明显不良气味口感细腻柔和、无颗粒感、整体协调适当有轻微刺激感、酒体较粗糙、有颗粒感有明显刺激、酒体粗糙、协调性差酒体丰满、醇厚协调、酸甜适中具有较好的李子酒风味、酸甜适当酒体酸涩、寡淡或有异味典型性突出、风格独特有典型性、风格良好典型性欠缺、风格一般8～10 4～7 0～3 8～10 4～7 0～3 8～10 4～7 0～3 8～10 4～7 0～3 8～10 4～7 0～3 8～10 4～7 0～3
1.3.5 数据处理与统计分析
采用Microsoft Office 2010软件进行数据统计；SPSS 22.0软件对不同发酵处理酒样的理化指标、颜色参数及挥发性香气成分进行单因素方差分析，邓肯法（Duncan）进行多重比较，P＜0.05表示差异显著；采用Hiplot平台（https：//hiplot.com.cn/cloud-tool/drawing-tool/detail/106）进行聚类分析，采用SIMCA 14.1进行OPLS-DA分析。
2 结果与分析
2.1 李子果酒的理化指标及颜色参数分析
李子果酒常规理化指标及颜色参数检测结果见表2。由表2可知，2个组别果酒总酸、挥发酸含量无显著差异（P＞0.05），HS组样品中pH值、酒精度及干浸出物含量均显著高于SC组样品（P＜0.05），总糖含量显著低于SC样品（P＜0.05）。该研究结果与ZHAO W H等[15]研究结果一致，红曲霉添加不仅可提高酒中乙醇含量，同时还可增加氨基酸及多肽等物质含量，提高干浸出物含量。SC组样品发酵后的总糖含量为5.01 g/L，参照标准NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》可知属于半干型果酒，HS组样品发酵后总糖含量为2.3 g/L，属于干型果酒，分析其原因可能是红曲霉发酵过程中可产生糖化酶，增加了对糖类成分的利用度[16]。两种果酒各项指标均符合国家标准，发酵效果良好。因此，红曲霉混合酿酒酵母应用于李子发酵可显著改善果酒品质，使果酒口感更加丰厚、柔和。
表2 李子果酒常规理化指标及颜色参数检测结果
Table 2 Detection results of conventional physicochemical indexes and color parameters of plum wine
注：“*”代表同一指标差异显著（P＜0.05）。
项目 SC组 HS组pH值总酸/（g·L-1）酒精度/%vol总糖/（g·L-1）挥发酸/（g·L-1）干浸出物/（g·L-1）L*值a*值b*值C*值3.26±0.01 7.58±0.27 10.24±0.23 5.01±0.09*0.20±0.01 20.79±0.76 39.30±2.08*-0.48±0.05 21.63±0.29*21.41±0.61 3.41±0.01*7.43±0.13 11.36±0.23*2.30±0.05 0.21±0.01 28.70±1.02*31.19±0.57 12.42±0.12*16.01±0.20 19.66±1.23
与SC组李子果酒相比，HS组的L*值、b*、C*值分别下降9.11、5.62和1.75，a*值由负值（-0.48）变为正值（12.42），说明两组样品色泽差异较大。 研究表明，果酒色泽受原料中呈色物质、酶促和非酶促褐变以及微生物代谢产物影响[12，17]。其中果实中呈色物质如花色苷、类胡萝卜素等在发酵过程中易受光热等影响变为淡黄色[18]，因此李子经单一酿酒酵母发酵后产品颜色呈现出亮黄色。红曲霉在发酵过程中可产生聚酮类化合物，为天然色素[19-20]，可使果酒颜色变红亮，使果酒更能体现脆红李原料本身的色泽品质。 综上，红曲添加应用于李子发酵可显著改变果酒色泽，提升果酒品质。
2.2 李子果酒挥发性风味物质分析
李子果酒中挥发性风味物质GC-MS检测结果及香气特征见表3。 由表3可知，SC组、HS组样品中共检出37种挥发性风味物质，其中，醇类9种、酯类15种、酸类7种、醛类2种、其他类4种。SC组样品和HS组样品分别检出30和35种挥发性风味物质，共有挥发性风味物质共28种，SC组样品独有挥发性风味物质为3-环己烯-1-甲醇、棕榈酸乙酯；而SC组样品独有挥发性风味物质有7种，分别4-萜品醇、2-苄氧基乙醇、甲酸异丙酯、水杨酸甲酯、月桂酸乙酯、二丙二醇甲醚、2,3,5,6-四甲基哌嗪。在SC、HS样品中醇类物质相对含量分别为65.48%和70.37%，酯类物质相对含量分别为19.19%和13.37%，酸类、醛类和其他类物质相对含量较低。
表3 李子果酒中挥发性风味物质含量GC-MS检测结果及香气特征
Table 3 Detection results of volatile flavor substances in plum wine and aroma characteristics
注：“/”代表未检出或未知。
种类 化合物 香气特征[37-39]相对含量%SC组 HS组酯类乙酸乙酯甲酸异丙酯乙酸戊酯辛酸乙酯壬酸乙酯癸酸乙酯苯酸乙酯丁二酸二乙酯9-十六烯酸乙酯水杨酸甲酯乙酸苯乙酯己酸-2-苯乙酯月桂酸乙酯十四酸乙酯棕榈酸乙酯香蕉香、苹果香李子香、梅子香类似苹果和香蕉混合的香味菠萝、苹果香果香及玫瑰样香气椰子香蜂蜜香微弱的水果香类似桃子、苹果或梨的香冬青香玫瑰花香、蜂蜜香菠萝香花果香、奶油香鸢尾油香、油脂香蜡香、果爵和奶油香合计醇类乙醇3-环己烯-1-甲醇3-甲基-1-丁醇2,3-二甲基-2,3-丁二醇芳樟醇4-萜品醇1-壬醇2-苄氧基乙醇苯乙醇类似水果发酵的微甜香气清新、芳香的香气独特的芳香浓烈的果香玫瑰木香辛香、壤香、青香和木香玫瑰香微有芳香气味玫瑰样花香合计酸类乙酸2-甲基己酸2-甲基丙酸4-羟基丁酸辛酸N-癸酸十二烷酸刺激性气味猪油、鸡脂肪香浆果类香微弱芳香气味腐臭味脂肪香、蜡香月桂油香合计醛类苯甲醛苯乙醛苦杏仁味风信子的香合计0.97±0.12/0.28±0.06 7.63±0.62 0.14±0.02 4.76±0.62 4.16±0.08 0.10±0.01 0.06±0.01/0.08±0.01 0.24±0.05/0.48±0.08 0.08±0.02 19.19 45.06±1.36 0.15±0.04 18.21±0.35 0.42±0.13 0.07±0.01/1.52±0.25/0.05±0.01 65.28 0.89±0.04 0.20±0.02 0.08±0.01 0.10±0.02 7.69±0.21 0.36±0.06 0.22±0.13 9.75 5.61±0.13 0.06±0.01 5.68 0.06±0.01其他类2,4-二叔丁基苯酚2,3,5,6-四甲基哌嗪二丙二醇甲醚N-甲基-2-氨基-丙酰胺//烷基酚气味巧克力、可可、咖啡香醚类气味/合计0.10±0.02 0.16 1.72±0.36 0.29±0.10 0.17±0.06 4.01±0.40 0.15±0.01 2.34±0.15 2.84±0.25 0.56±0.04 0.25±0.02 0.28±0.02 0.08±0.01 0.14±0.01 0.12±0.13 0.30±0.04/13.37 48.86±1.39/16.43±0.06 0.16±0.02 0.16±0.01 0.12±0.04 4.25±0.07 0.19±0.07 0.21±0.02 70.23 1.07±0.05 0.14±0.01 0.10±0.01 0.13±0.01 6.13±0.17 0.72±0.26 0.14±0.04 8.57 7.38±0.74 0.07±0.01 7.46 0.04±0.03 0.20±0.02 0.05±0.01 0.09±0.04 0.38
醇类是发酵酒风味物质的主要来源[21-22]。 多为糖类或氨基酸经酵母代谢产生，在适宜浓度下可以衬托酯香，促进香气协调性[23-24]。 形成发酵香的风味物质主要是乙醇、杂醇和酯类[25-26]。 SC、HS组样品中乙醇含量最高，分别为45.06%、48.86%，与SC组相比，HS样品中芳樟醇、4-萜品醇、2-苄氧基乙醇、1-壬醇、苯乙醇有所增加。与单菌发酵相比，由于红曲菌的加入使得乙醇含量增加，提高了李子果酒的醇香味，这与付志英等[27-29]的研究结果相似。芳樟醇是类异戊二烯途径由葡萄糖合成，能够明显赋予李子酒花香[30]，苯乙醇是苯丙氨酸代谢产生，且能够为李子酒带来玫瑰、蜂蜜等香气[26]。3-甲基-1-丁醇在发酵过程中通过亮氨酸的脱氨和脱羧反应生成[31]，由于其草本香气，可能对发酵酒质量产生负面影响[32]，红曲菌的加入使其含量有所降低。
酯类物质是果酒特征香气成分，通常可以赋予发酵酒一定的花香、果香[25]。在发酵李子酒的样品中共检测出15种酯类物质。SC组样品酯类物质相对含量（19.19%）高于HS组（13.37%），这可能与红曲霉酯化力高有关[33]。SC、HS组样品中辛酸乙酯、癸酸乙酯及苯酸乙酯含量较高，甲酸异丙酯、水杨酸甲酯、月桂酸乙酯在SC组样品中未检出，这三种酯类物质能赋予果酒甜香、果香、清香。与SC组相比，HS样品中乙酸乙酯、甲酸异丙酯、月桂酸乙酯等物质含量有所增加，而辛酸乙酯、苯酸乙酯和癸酸乙酯有所降低，这与ENGLEZOS V等[32，34]研究结果一致。但与CANONICO L等[35-36]研究结果相反，推断是和采用非酿酒酵母的种类和原材料有关。
果酒中的酸主要来源于乳酸菌代谢，低浓度时散发奶酪、奶油的风味，浓度过高则会带来醋酸味、刺激味和腐败味[37]。 在本实验中共检测到7种酸类，SC组样品酸类物质相对含量（9.55%）高于HS组（8.43%），与SC组相比，乙酸、2-甲基丙酸、4-羟基丁酸、N-癸酸有所增加，而辛酸、十二烷酸有所降低。酸类物质含量有所降低更有利于李子酒香气的平衡[32]，与张曼等[38]的研究结果相似。
2.3 李子果酒的挥发性风味物质正交偏最小二乘-判别分析
李子果酒挥发性风味物质OPLS-DA散点图、载荷图、200次置换检验结果及变量重要性投影值见图1。由图1A可知，模型预测能力（Q2）为0.991、拟合优度（R2X）为0.839，解释能力（R2Y）为0.999，表明模型预测性能及准确性较好。SC组、HS组样品可完全区分开，此结果与聚类分析一致，表明两种发酵方式对李子果酒风味物质影响存在显著差异。 由图1B可知，HS组样品中二丙二醇甲醚、2,3,5,6-四甲哌嗪、9-十六烯酸乙酯、4-萜品醇、丁二酸二乙酯、芳樟醇、棕榈酸乙酯、1-壬醇、甲酸异丙酯、2-苄氧基乙醇、乙酸、苯乙醛、乙醇等13种物质含量较高，SC组样品中苯乙醇、水杨酸甲酯、苯酸乙酯、辛酸、3-甲基-1-丁醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-环己烯-1-甲醇、2-甲基己酸、N-甲基-2-氨基-丙酰胺等10种物质含量较高。由图1C可知，R2和Q2值均低于原始值，且Q2回归线横穿横坐标并与纵轴负向相交，证明模型未过拟合且稳定可靠。
图1 李子果酒挥发性风味物质正交偏最小二乘-判别分析散点图(A)，载荷图(B)，置换检验结果(C)及变量重要性投影值(D)
Fig.1 Orthogonal partial least squares-discriminant analysis scatter plot (A), loading plot (B), permutation test results (C) and variable importance in the projection values (D) of volatile flavor substances in plum wine
由图1D可知，根据方差分析P值＜0.05、VIP值＞1.0的筛选标准，共筛选出23种显著差异挥发性风味化合物，包括二丙二醇甲醚、2,3,5,6-四甲哌嗪、苯乙醇、水杨酸甲酯、9-十六烯酸乙酯、4-萜品醇、丁二酸二乙酯、苯酸乙酯、芳樟醇、辛酸、3-甲基-1-丁醇、辛酸乙酯、棕榈酸乙酯、1-壬醇、癸酸乙酯、3-环己烯-1-甲醇、甲酸异丙酯、2-苄氧基乙醇、乙酸、2-甲基己酸、苯乙醛、乙醇、N-甲基-2-氨基-丙酰胺。综上，混菌发酵可增加果酒中风味物质种类如芳樟醇、4-萜品醇、2-苄氧基乙醇、甲酸异丙酯、水杨酸甲酯、月桂酸乙酯等，这些物质与红曲菌呈正相关，且能赋予李子果酒花香、甜香、果香、清香等香气特征[32]，表明红曲菌的加入使酒中风味物质相对含量更趋于平衡，风味更加协调。此外，相比于单一接种发酵，混合发酵均提高了酒体中香气物质的质量浓度。表明混菌发酵比单菌发酵李子果酒更具有潜力，与YAN G L等[39]研究结果相似。
2.4 感官评价
李子果酒感官评分雷达图见图2。由图2可知，HS组样品典型性、香气、滋味、口感和色泽评分（分别为9.0分、9.4分、8.8分、8.2分和9.6分）均优于SC组样品（分别为7.3分、6.8分、6.5分、6.8分和7.9分），而两组样品澄清度得分一致，均为9.0分，HS组、SC组样品感官评分分别为54分、44.3分。因此，采用红曲、酵母混合发酵李子果酒感官品质更佳，其原因可能是，混菌发酵丰富微生物菌群，导致代谢产物种类增加，此外，微生物之间的相互作用还可影响代谢途径和代谢产物发生变化，影响果酒中呈色、呈味物质[38]。
图2 李子果酒感官评分雷达图
Fig.2 Radar chart of sensory score of plum wine
3 结论
本研究以红曲米与酿酒酵母混合发酵李子果酒，与未添加红曲米的李子果酒为对照，分析两种李子果酒理化指标、挥发性风味物质及感官品质的差异。结果表明，与对照相比，混合发酵李子果酒pH值、a*值、酒精度及干浸出物含量均显著增加（P＜0.05），分别为3.41、12.42、11.36%vol、28.70 g/L，L*值显著下降（P＜0.05），为39.30，两者色泽差异较大；添加红曲米发酵的李子果酒挥发性风味物质种类更丰富（35种），独有4-萜品醇、2-苄氧基乙醇等7种挥发性风味物质；结合方差分析P值＜0.05、变量重要性投影（VIP）值＞1.0，共筛选出23种显著差异挥发性风味化合物；HS组李子果酒感官评分（54分）高于SC组（44.3分）。说明红曲应用于李子果酒能够显著提高其品质，该研究对提升李子果酒品质、丰富果酒产品具有重要意义。
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