山西老陈醋作为中国传统四大名醋之一，以高粱为原料，麸皮、谷糠等为辅料，经过“蒸、酵、熏、淋、陈”5大工艺酿造而成，具有“绵、酸、香、甜、鲜”的风味特点[1]。在传统酿造工艺中，生产老陈醋时大曲与高粱的配料比高达62.5%，其中大曲是生产传统食醋的糖化剂、发酵剂，为食醋酸、醇、酯等风味物质的生成奠定了基础。传统酿造老陈醋采用的大曲是由大麦和豌豆等原料经自然接种多种微生物制成，存在使用量较多，糖化力和酒化力较低，造成原料中的淀粉和蛋白质类物质分解转化不完全等缺陷，这些缺陷不仅影响原料利用率和生产效率，更直接关联到成品醋的品质缺陷，如容易出现沉淀、有机酸含量不足、挥发性香气物质及氨基酸等风味成分含量偏低等现象。
为了克服传统大曲的缺陷并提升老陈醋品质，近年来研究者们积极探索微生物强化策略。彭杨等[2-3]将筛选后具有高糖化力的麸曲加入四川麸醋传统固态发酵工艺中，结果表明，相较于自然发酵的对照组，麸曲强化可显著提高四川麸醋淀粉利用率和出醋率，淀粉利用率提高14.2%，有效提高成品醋中有机酸和游离氨基酸的含量。红曲是以大米为原料，利用红曲霉（Monascus）经液态深层发酵生成的天然发酵剂，具有特殊的红曲香味和天然的鲜红色泽。其中，红曲霉能代谢产生α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶等高活性水解酶，催化淀粉转化成糖，并且能分泌蛋白酶、酯化酶和其他风味代谢物，丰富产品的风味[4]。四大名醋之一的永春老醋正是由于良好地发挥了红曲的糖化、酯化、色泽、功能上的优势，从而形成其特有风味和功能特色[5]。米曲是将面粉和蒸熟的黄豆混合后接入米曲霉（Aspergillusoryzae）发酵制成，其主要用在酱及酱油制品生产上。米曲霉在曲料上充分生长，大量产生和积累了丰富的酶类，如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等，能高效地将淀粉、蛋白质等原料大分子物质水解为糊精、葡萄糖、多肽和氨基酸等小分子物质，不仅有助于解决原料分解转化不完全的问题，更能显著提高原料利用率[6]。将红曲和米曲引入老陈醋酿造过程，有望解决传统大曲酿造中存在的问题，为提升山西老陈醋的品质与风味提供新的途径。
本研究创新采用红曲和米曲强化应用在山西老陈醋的酒精发酵阶段，采用稀释平板菌落计数法结合高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）动态监测酿造过程中微生物菌群、理化指标及风味物质的变化，研究红曲和米曲对老陈醋酿造品质、风味和功能的影响，探讨其在特色风味、功能强化等高质量老陈醋产品开发的应用潜能。旨在为功能曲在山西老陈醋产业化生产中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
大曲：山西老陈醋集团有限公司；高粱：山西汾阳市永信蔚高粱专业合作社；谷糠：文水县农盛贸易有限公司；米曲（酸性蛋白酶活力为40.00 U/g，中性蛋白酶活力为96.00 U/g）：山东和众康源生物科技有限公司；红曲（糖化力为753 U，酯化力为554 U）：龙红古源酒曲有限公司；酵母菌：安琪酵母股份有限公司。
1.1.2 主要试剂
草酸、丙酮酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸（均为色谱纯）：天津市光复精细化工研究所；氨基酸（丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸）标准品（纯度99.9%）：曼哈格生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、MRS培养基、孟加拉红培养基、平板计数琼脂（plate count agar，PCA）：北京奥博星生物技术有限责任公司。
醋酸菌固体培养基：葡萄糖20 g、酵母膏10 g、碳酸钙10 g、琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃条件下高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
PB-21酸度计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；戴安U3000高效液相色谱仪、Trace1300气相色谱仪、TraceISQ质谱分析仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；5425R离心机：艾本德（中国）有限公司；30+氨基酸自动分析仪：英国Biochrom公司。
1.3 方法
1.3.1 红曲与米曲在山西老陈醋酒精发酵阶段的强化应用
对照组[7]：高粱粉碎至4～6瓣，100 kg高粱加入60 kg水润料12 h，将润好的高粱蒸1.5 h，无夹心不粘手时停火；再加入220 kg温水（80 ℃），搅拌均匀浸料，温度降至25～33 ℃时拌入40 kg的大曲，搅拌均匀后移入到酒精发酵缸（0.25 m3）中，按照高粱质量的0.1%加入酵母菌，搅拌均匀，酒精发酵10 d（敞口发酵3 d，封口发酵7 d）。酒精发酵结束后，加入120 kg麸皮和160 kg的谷糠，搅拌均匀，移入到醋酸发酵缸（0.10 m3）中，按照高粱质量加入10%火醅（上一批醋酸发酵第2天的醋醅），醋酸发酵9 d，按照高粱质量加入10%食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋工序得新淋醋。
红曲强化组：在酒精发酵阶段添加大曲时，同步添加5 kg红曲，即高粱质量的5%，其余工艺操作同对照组。
米曲强化组：在酒精发酵阶段添加大曲时，同步添加5 kg米曲，即高粱质量的5%，其余工艺操作同对照组。
1.3.2 样品采集
在酒精发酵第0、1、2、3、5、7、9、10天从3个酒精发酵缸内共采集约300 mL的酒醪样品，于灭菌广口瓶中均匀混合，编号分别为J0、J1、J2、J3、J5、J7、J9、J10；醋酸发酵第0、1、3、5、7、9天从3个醋酸发酵缸中，距醋醅表面30 cm处，共采集约300 g刚完成翻醅的醋醅样品于无菌自封袋中混匀，编号分别为C0、C1、C3、C5、C7、C9；上述样品及新淋醋样品存放于-80 ℃保存。
1.3.3 测定方法
微生物活菌数测定：取25g或25mL样品充分溶于225mL 0.85%的生理盐水中，连续稀释至合适倍数。吸取0.1 mL稀释液，分别均匀涂布于PCA平板（计细菌总数）、MRS平板（计芽孢杆菌、乳酸菌数）、孟加拉红培养基平板（计真菌总数、霉菌数）、PDA培养基平板（计酵母菌数）和醋酸菌固体培养基平板（计醋酸菌数），分别于37 ℃、37 ℃、30 ℃、30 ℃条件下培养48 h，根据菌落形态，选择菌落数在30～300之间的平板进行计数[7]。
理化指标的测定：参考国标GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》[8]中的方法测定总酸、氨基酸态氮、总酯、还原糖、不挥发性酸、可溶性固形物、黄酮和川芎嗪含量及浊度；参考GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒及配制酒卫生标准的分析法》[9]中比重计法测定酒精度。
风味物质的测定：采用氨基酸自动分析仪对游离氨基酸进行测定[6-7]；采用高效液相色谱法对有机酸含量进行测定[10]；采用HS-SPME-GC-MS法测定挥发性风味物质[11]。
感官评价：在干净舒适且无异味的环境下，由10名（5男5女）经过食醋感官培训的专业人员组成感官评价小组，参考文献[12]对3组（对照组、红曲强化组和米曲强化组）新淋醋样品进行感官评价，满分100分。
1.3.4 数据处理与统计分析
所有样品均重复进行3次测定，结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS_29.0.2.0软件对数据进行方差分析；采用Excel 2023及Origin 2018软件作图。
2 结果与分析
2.1 红曲和米曲强化对山西老陈醋发酵过程中微生物活菌数的影响
2.1.1 红曲和米曲强化对酒精发酵过程中微生物活菌数的影响
红曲和米曲强化对山西老陈醋酒精发酵过程中微生物活菌数的影响见图1。由图1可知，酒精发酵过程中，各组微生物活菌数的变化趋势一致。细菌总数和乳酸菌活菌数均呈现先上升后下降的趋势，均于发酵第3天达到峰值，对照组、红曲强化组和米曲强化组的细菌总数分别为8.28 lg（CFU/mL）、9.10 lg（CFU/mL）、8.90 lg（CFU/mL），乳酸菌活菌数分别为7.18 lg（CFU/mL）、7.52 lg（CFU/mL）和7.34 lg（CFU/mL），后期因酒精积累和底物耗尽，细菌总数和乳酸菌活菌数均持续下降至第10天的5.35～5.89 lg（CFU/mL）与4.20～4.55lg（CFU/mL）。芽孢杆菌活菌数则在发酵前期上升后趋于稳定，最终维持在5.37～5.78lg（CFU/mL）。真菌总数、酵母菌及霉菌活菌数均呈现先上升后下降变化趋势。酵母菌活菌数于发酵第1天迅速达到峰值，对照组、红曲强化组和米曲强化组分别为8.02 lg（CFU/mL）、8.48 lg（CFU/mL）、8.21 lg（CFU/mL），而真菌总数和霉菌活菌数则均在第2天达到峰值，对照组、红曲强化组和米曲强化组的真菌总数分别为8.70 lg（CFU/mL）、8.98 lg（CFU/mL）、8.82 lg（CFU/mL），霉菌活菌数分别为6.62 lg（CFU/mL）、6.98 lg（CFU/mL）、6.80 lg（CFU/mL）。随着酒精度升高和氧气减少，真菌数量逐步下降，其中对照组霉菌活菌数于发酵第9天降至0，而强化组因红曲或米曲添加延缓衰减，最终均于第10天降至0。结果表明，红曲和米曲的强化对山西老陈醋酒精发酵过程中的微生物活菌数产生了明显影响，其不仅促进了细菌、乳酸菌和酵母菌的生长繁殖，提高其活菌数峰值，同时延缓霉菌活菌数的衰减速度。
图1 红曲和米曲强化对山西老陈醋酒精发酵过程中微生物活菌数的影响
Fig.1 Effect of Hongqu and Miqu enhancement on the viable microbial count during alcohol fermentation process of Shanxi aged vinegar
2.1.2 红曲和米曲强化对醋酸发酵过程中微生物活菌数的影响
红曲和米曲强化对山西老陈醋醋酸发酵过程中微生物活菌数的影响见图2。由图2可知，醋酸发酵阶段，各组微生物活菌数的变化趋势一致。细菌总数及乳酸菌、芽孢杆菌、醋酸菌活菌数均呈现先上升后下降的趋势，因辅料（麸皮、谷糠）补充并引入醋酸菌，发酵第3天细菌总数达到最高，对照组、红曲强化组和米曲强化组的细菌总数分别为8.40 lg（CFU/g）、8.49 lg（CFU/g）、8.30 lg（CFU/g），此外，乳酸菌、芽孢杆菌、醋酸菌活菌数也均在发酵第3天达到最高，乳酸菌活菌数分别为8.03 lg（CFU/g）、8.34 lg（CFU/g）、8.20 lg（CFU/g），芽孢杆菌活菌数分别为5.48 lg（CFU/g）、6.08 lg（CFU/g）、5.86lg（CFU/g），醋酸菌活菌数分别为7.12lg（CFU/g）、7.55 lg（CFU/g）、7.46 lg（CFU/g）。随着发酵底物耗尽和酸度上升，细菌数量逐渐下降，发酵末期，乳酸菌、芽孢杆菌及醋酸菌活菌数分别降至4.25～4.87lg（CFU/g）、2.86～3.20lg（CFU/g）和2.49～2.78 lg（CFU/g）。在醋酸发酵阶段，由于醋酸菌对乙醇的快速消耗导致碳源竞争加剧，真菌因营养物质缺乏而进入衰亡期，真菌总数和酵母菌活菌数均呈下降趋势并逐渐消亡，对照组醋醅中真菌总数和酵母菌活菌数均在醋酸发酵第9天降至0，而强化组酵母菌活菌数则在醋酸发酵第7天降至0。结果表明，红曲与米曲强化通过优化底物利用效率，明显提高了醋酸发酵前期细菌（尤其醋酸菌）的活菌数，但加剧了细菌与真菌间的营养竞争，导致酵母菌提前消亡。
图2 红曲和米曲强化对山西老陈醋醋酸发酵过程中微生物活菌数影响
Fig.2 Effect of Hongqu and Miqu enhancement on the viable microbial count during acetic acid fermentation process of Shanxi aged vinegar
2.2 红曲和米曲强化对山西老陈醋发酵过程中理化指标的影响
红曲和米曲强化对山西老陈醋发酵过程中理化指标的影响见图3。酒精度反映酵母菌将还原糖转化为乙醇的效率，是判断酒精发酵是否彻底的关键指标[13]。由图3A可知，在酒精发酵过程中，对照组酒精度由发酵第1天的3.70%vol急剧上升至发酵第2天的6.00%vol，随后呈缓慢上升趋势，酒精发酵结束达到7.80%vol；在醋酸发酵过程中，醋醅酒精度由初始的4.50%vol迅速降至第3天的0.30%vol，随后发酵第5天时降至0。强化组的酒精度变化趋势与对照组类似，酒精发酵结束，与对照组相比，红曲强化组和米曲强化组的酒精度分别提高了12.82%、6.41%，这是因为红曲和米曲中含有大量的淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、蛋白酶等酶类，能充分分解原料中淀粉、纤维素和蛋白质等大分子物质，提供充足的营养物质，促进了酵母菌的生长和代谢，从而加速酒精的生成[4]。
图3 红曲和米曲强化对山西老陈醋发酵过程中理化指标的影响
Fig.3 Effect of Hongqu and Miqu enhancement on physicochemical indicators during fermentation process of Shanxi aged vinegar
还原糖是衡量食醋发酵与糖化协同性的关键指标，既作为食醋基础成分，又通过参与美拉德反应生成糠醛等风味物质，同时作为褐变前体物质主导老陈醋的色泽形成[14]。由图3B可知，酒精发酵阶段，各组还原糖含量均呈现出持续下降的趋势，酒精发酵结束时，红曲强化组和米曲强化组的还原糖含量分别为0.14 g/100 mL、0.11 g/100 mL，较对照组提高了40.00%、10.00%。进入醋酸发酵，各组还原糖含量均呈现先升高后下降的趋势，醋酸发酵结束时，红曲强化组和米曲强化组的还原糖含量分别为0.42 g/100 mL、0.28 g/100 mL，较对照组分别提高了110.00%、40.00%。总体来说，红曲强化组对还原糖含量提高更明显，这是由于红曲含有淀粉酶，能促进原料中的淀粉逐步分解为还原糖，形成“边糖化边发酵”的动态平衡，延缓还原糖的快速下降[4]。
在酒精发酵阶段，总酸和不挥发性酸含量的变化趋势同步性较强，这是因为酒精发酵阶段产酸主要为乳酸，不挥发性酸在总酸中占比较高[15]。由图3C和图3D可知，各组在整个发酵过程中总酸和不挥发性酸均整体呈上升趋势。在醋酸发酵阶段，红曲强化组和米曲强化组的总酸和不挥发性酸含量整体明显高于对照组，这是由于红曲和米曲中含有多种微生物，通过糖酵解途径产生丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下可以转化为乳酸，同时促进其他微生物产乙酸、柠檬酸等有机酸[3]。醋酸发酵结束时，红曲强化组和米曲强化组的总酸含量分别为6.33 g/100 mL、5.31 g/100 mL，较对照组分别提高了22.67%、2.90%；红曲强化组和米曲强化组的不挥发性酸含量分别为1.94 g/100 mL、1.58 g/100 mL，较对照组分别提高了38.57%、12.86%。总体来说，红曲强化组对总酸和不挥发性酸含量提高更明显。
氨基酸态氮是衡量食醋品质的重要指标之一，它反映了食醋中氨基酸的含量，而氨基酸是构成食醋风味的重要物质[16]。由图3E可知，酒精发酵阶段，对照组氨基酸态氮含量从发酵第1天的0.01 g/100 mL持续上升至第9天的0.13 g/100 mL。强化组与其变化趋势一致，酒精发酵结束，红曲强化组和米曲强化组氨基酸态氮含量分别为0.14g/100mL、0.19 g/100 mL，较对照组分别提高了7.69%、46.15%。醋酸发酵1～7 d，对照组氨基酸态氮含量由0.13 g/100 g上升至0.18 g/100 g，之后略微下降至0.17 g/100 g。强化组变化趋势与其一致，醋酸发酵结束，米曲强化组的氨基酸态氮含量为0.19 g/100 g，较对照组提高了11.76%。总体来说，米曲强化组对氨基酸态氮含量提高更明显，这是由于米曲含有大量蛋白酶，在发酵的初期阶段，碱性和中性蛋白酶起主导作用，随着发酵过程的进行，pH值逐渐下降，此时酸性蛋白酶开始活跃，在酸性条件下继续分解蛋白质[17]。
总酯作为食醋的重要理化指标之一，是食醋香气的主要来源，同时反映食醋发酵过程中的生物化学变化[18]。由图3F可知，在发酵过程中，各组总酯含量均呈现上升的变化趋势，酒精发酵和醋酸发酵结束时，对照组的总酯含量分别为1.38 g/100 mL、4.78 g/100 g，醋酸发酵结束，与对照组相比，红曲强化组和米曲强化组的总酯含量分别提高了10.04%、3.56%。红曲强化组对总酯的提升效果更为明显，这是由于红曲中含有糖化酶、酯化酶等酶类物质，在食醋发酵过程中，这些酶能够催化酸与醇发生酯化反应，从而增加酯类物质的生成量，使总酯含量上升[4]。
综上，红曲和米曲的强化对山西老陈醋发酵过程中的理化指标产生了明显影响。红曲强化组对还原糖、总酸和不挥发性酸以及总酯含量的提高效果更为明显，而米曲强化组对氨基酸态氮含量的提高效果更为明显。
2.3 红曲和米曲强化对新淋醋品质的影响
2.3.1 基本理化指标和功能成分分析
红曲和米曲强化对新淋醋基础理化指标和功能成分的影响见表1。由表1可知，相较于对照组，红曲强化组新淋醋中的总酸、不挥发性酸、总酯、可溶性固形物分别显著提高4.57%、14.49%、35.09%、16.38%（P＜0.05），还原糖、食盐含量分别显著降低6.83%、7.08%（P＜0.05）；米曲强化组新淋醋总酸、不挥发性酸、氨基酸态氮、可溶性固形物含量分别显著提高4.08%、5.14%、33.33%、22.98%（P＜0.05），还原糖、食盐含量分别显著降低14.29%、5.31%（P＜0.05）。
表1 新淋醋理化指标的测定结果
Table 1 Determination results of physicochemical indicators of the new leaching vinegar
注：同行不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
项目 对照组 红曲强化组 米曲强化组总酸/（g·100 mL-1）不挥发性酸/（g·100 mL-1）氨基酸态氮/（g·100 mL-1）总酯/（g·100 mL-1）还原糖/（g·100 mL-1）食盐/（g·100 mL-1）可溶性固形物/（g·100 mL-1）总黄酮/（mg·100 mL-1）川芎嗪/（mg·L-1）浊度/NTU 6.13±0.03c 2.14±0.02c 0.15±0.02bc 4.36±0.02bc 1.61±0.01a 1.13±0.01a 13.49±0.04c 86.55±0.72c 24.39±0.77c 235.40±8.27a 6.41±0.02a 2.45±0.03a 0.17±0.02ab 5.89±0.02a 1.50±0.02b 1.05±0.03bc 15.70±0.05b 104.36±0.75a 36.44±0.67a 168.32±2.27b 6.38±0.03ab 2.25±0.03b 0.20±0.02a 4.69±0.03b 1.38±0.03c 1.07±0.02b 16.59±0.03a 98.28±0.66b 34.37±0.70b 108.68±2.62c
对照组新淋醋的浊度较高，食醋浊度偏高主要源于原辅料处理与反应产物堆积，此外，加工环节中蛋白质、果胶等与设备金属离子络合生成不溶性化合物，进一步加剧浑浊现象[19-20]。相较于对照组，红曲强化组和米曲强化组新淋醋浊度分别显著降低了36.14%、53.83%（P＜0.05），这是由于在酒精发酵阶段添加米曲和红曲，可通过酶解大分子、菌体吸附及代谢协同等多重机制显著降低新淋醋的浊度。
山西老陈醋中的川芎嗪和总黄酮是独特风味与保健功能的关键物质[21-22]，其形成机制与发酵工艺密切相关，在熏醅阶段，高温弱酸性环境促使醋醅中的淀粉、蛋白质水解为还原糖和氨基酸，通过美拉德反应生成吡嗪类物质（如川芎嗪），同时热效应诱导微生物裂解释放胞内代谢产物参与黄酮类化合物合成[23-24]。与对照组相比，红曲强化组和米曲强化组新淋醋中的川芎嗪含量分别提高了49.41%、40.92%，分析原因可能是红曲霉与米曲霉分泌的蛋白酶、淀粉酶等可加速原料分解，为川芎嗪合成提供前体；红曲强化组和米曲强化组新淋醋中的总黄酮含量分别提高了20.58%、13.55%，这与杨碧月等[25]的研究结果一致。
综上，红曲和米曲的强化应用显著提升了山西老陈醋的品质。红曲强化主要侧重于风味物质的合成，其分泌的酶类有效加速原料分解，为川芎嗪等吡嗪类物质的生成提供了必要的前体，同时显著增强了不挥发性酸和总酯的积累。而米曲强化则着重于提升醋液的澄清度，并有效增强氨基酸态氮的积累。
2.3.2 游离氨基酸含量分析
游离氨基酸对食醋的口感和风味具有直接影响，其能作为挥发性化合物的前体，参与风味物质的合成，进而增强醋的丰富性。游离氨基酸主要来自微生物对原料中蛋白质的降解，根据味觉强度可以将氨基酸分为鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸[26]。对3组新淋醋中的游离氨基酸含量进行测定，结果见表2。由表2可知，红曲强化组新淋醋中游离氨基酸总量为368.95 mg/100 mL，较对照组显著提高12.18%（P＜0.05），其中异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、组氨酸的含量显著高于对照组和米曲强化组（P＜0.05）。米曲强化组新淋醋中游离氨基酸总量高达439.25 mg/100 mL，较对照组显著提高35.56%（P＜0.05）。尤其是谷氨酸和天冬氨酸的含量显著高于对照组和红曲强化组（P＜0.05），这是因为米曲霉分泌的复合蛋白酶系（包括酸性、中性和碱性蛋白酶）可高效分解原料中的大分子蛋白质，能分泌谷氨酰胺酶，能催化水解谷氨酰胺成为谷氨酸[27]。
表2 新淋醋游离氨基酸含量测定结果
Table 2 Determination results of free amino acids contents of the new leaching vinegar
氨基酸甘氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸脯氨酸赖氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸蛋氨酸苯丙氨酸精氨酸天冬氨酸谷氨酸酪氨酸胱氨酸组氨酸总含量含量/（mg·100 mL-1）对照组 红曲强化组 米曲强化组19.06±1.10a 81.06±2.40b 8.07±0.12b 13.58±1.48b 28.44±2.19ab 12.30±0.21bc 35.77±0.85bc 48.78±0.85b 14.98±0.99c 7.18±0.88a 13.85±1.25a 5.32±0.28a 5.81±0.21bc 26.88±0.28c 3.17±0.14c 3.32±0.13b 1.31±0.32b 328.88±13.68c 20.93±0.71a 88.06±2.40ab 6.43±0.21c 19.39±0.81a 21.26±1.63c 14.71±0.35b 38.86±0.75b 56.48±1.41ab 21.92±0.48a 1.14±0.07b 13.77±1.39a 3.29±0.21b 7.69±0.28b 38.57±0.92b 6.46±0.46a 6.63±0.21a 3.36±0.15a 368.95±12.44b 19.00±0.76ab 95.07±3.68a 10.74±0.13a 16.79±1.56ab 29.38±1.10a 18.52±0.35a 63.02±1.41a 61.25±0.80a 17.78±0.35b 1.17±0.21b 16.64±0.76a 4.93±0.14a 16.18±1.13a 58.83±0.46a 5.33±0.21b 3.14±0.14b 1.48±0.08b 439.25±13.27a
综上，红曲和米曲的强化应用显著提升了新淋醋中游离氨基酸的含量，且不同强化组对特定氨基酸的影响各有差异。红曲强化组主要作用于支链氨基酸（如异亮氨酸）和芳香族氨基酸（如苯丙氨酸），有效增强甜味与焦香风味，并适度调节苦味；而米曲组则重点促进谷氨酸和天冬氨酸的富集，显著增强鲜味强度，并与甜味氨基酸协同作用。
2.3.3 有机酸含量的测定
有机酸是食醋中关键风味代谢物，对3组新淋醋样品的乙酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸和丙酮酸等主要有机酸含量进行测定，结果见图4。由图4可知，红曲强化组新淋醋中有机酸总量高达4.54 g/100 mL，较对照组显著提高了23.18%（P＜0.05），尤其是乳酸和柠檬酸含量显著高于对照组（P＜0.05）。有机酸的形成主要依赖于微生物的代谢，与乳酸呈正相关的微生物为乳杆菌属（Lactobacillus），而与酵母属则呈负相关[28-29]，红曲霉创造的酸性环境促进乳杆菌属增殖并抑制酵母属，强化同型乳酸发酵；JING Y J等[30]通过对红曲米醋发酵过程中有机酸含量的监测发现，柠檬酸是终产品中除乙酸和乳酸外含量最高的有机酸，与本研究结果一致。米曲强化组新淋醋中有机酸含量高达4.17 g/100 mL，较对照组显著提高13.30%（P＜0.05），其中琥珀酸和丙酮酸含量较高，琥珀酸和丙酮酸分别赋予山西老陈醋酸咸苦复合味、酸咸味，使山西老陈醋酸味更加丰富[31]。
图4 新淋醋有机酸含量测定结果
Fig.4 Determination results of organic acids contents of the new leaching vinegar
综上，红曲和米曲强化显著提高了新淋醋有机酸含量，且各具特色，红曲强化组以乳酸、柠檬酸为主，赋予醋体柔和酸感与清新果香；米曲强化组则以琥珀酸、丙酮酸为特色，形成酸咸鲜复合味感。
2.3.4 挥发性风味物质的测定
3组新淋醋中挥发性风味物质的测定结果见表3。由表3可知，共检测到76种挥发性香气物质，包括酯类29种、醇类9种、酸类11种、醛类12种、酮类11种、吡嗪类3种、其他类1种，其中酸类、酯类和醛类是主要物质。与对照组相比，强化组新淋醋挥发性风味物质种类和含量均高于对照组，米曲强化组和红曲强化组分别检测到50种和59种挥发性香气成分，总含量分别达到5 953.24 μg/100 mL和6 612.40 μg/100 mL，较对照组分别提高了2.04%、13.33%。
表3 新淋醋挥发性风味物质气相色谱-质谱分析结果
Table 3 GC-MS analysis results of volatile flavor substances in the new leaching vinegar
种类 化合物对照组含量/（μg·100 mL-1）红曲强化组 米曲强化组酯类（29种）2-甲基丁基乙酸酯乙酸异戊酯甲酸-2-甲基丁酯丙二醇甲醚醋酸酯γ-己内酯γ-戊内酯丙位壬内酯乙酸异丁酯乙酸苯乙酯乙酸丙酯乙酸庚酯丁二酸单炔丙基酯2-甲基丁酸乙酯异戊酸乙酯丁酸乙酯0.00b 22.51±2.37a 8.26±0.18b 0.00c 0.00c 0.00c 2.50±0.08b 100.45±13.35b 183.35±15.32b 20.98±2.86c 212.3±30.87a 0.00b 4.24±0.19c 16.40±2.92a 1.90±0.06b 0.00b 11.55±0.89b 8.90±0.06a 3.31±0.03b 1.30±0.04b 0.51±0.02b 3.80±0.04a 132.70±9.57a 233.31±28.42a 31.75±1.92a 0.00b 4.51±0.34b 6.85±0.11a 0.00b 2.60±0.05a 108.40±30.64a 26.04±3.17a 7.54±0.13c 8.77±0.07a 6.42±0.15a 1.20±0.04a 1.81±0.06c 0.00c 196.29±8.44ab 27.04±2.10b 0.00b 43.21±4.29a 4.82±0.15b 0.00b 1.61±0.08c
续表
含量/（μg·100 mL-1）红曲强化组 米曲强化组对照组醇类（9种）酸类（11种）醛类（12种）种类 化合物癸酸乙酯乙酸乙酯庚酸乙酯棕榈酸乙酯己酸异丁酯正己酸乙酯异硫氰酸异丁酯己酸异戊酯壬酸乙酯辛酸乙酯戊酸乙酯异丁酸乙酯苯乙酸乙酯乳酸乙酯总量异丁醇异戊醇正己醇1-辛烯-3-醇辛醇1-辛烯-3-醇2,3-丁二醇糠醇苯乙醇总量DL-3-氨基-N-丁酸乙酸2-甲基丁酸异戊酸己酸2-甲基己酸L-丝氨酸辛酸正戊酸异丁酸肌氨酸总量（E）-壬烯醛3-糠醛苯甲醛苯乙醛异戊醛癸醛缩醛糠醛96.37±9.48a 861.48±44.50b 13.41±2.17a 9.48±0.62b 20.92±2.11a 10.78±1.36b 126.32±21.19a 4.54±0.27a 12.61±0.84b 151.57±45.35a 55.77±6.51a 7.10±0.21a 62.70±6.62b 0.00c 2 005.94±209.43b 12.26±1.19a 204.05±20.03a 0.00b 0.00b 0.00b 0.00b 58.56±5.46b 0.00b 207.52±42.16b 482.39±68.84b 1.40±0.06a 1 661.39±74.39b 0.00c 0.00b 27.08±5.29a 1.50±0.05a 0.00b 0.00b 0.00b 211.81±24.95a 0.00b 1 903.18±104.74b 0.00b 0.00b 6.29±0.73b 0.30±0.02a 1.30±0.12a 0.60±0.04c 5.30±0.42a 1 038.23±64.91a 138.91±32.15a 1285.53±78.31a 11.94±1.67a 13.08±1.76a 27.38±5.33a 29.52±4.96a 164.58±33.65a 2.61±0.16c 6.82±0.15c 177.70±38.90a 28.64±3.84c 2.81±0.06b 86.25±7.22a 22.70±4.07a 2 439.56±253.72a 8.36±0.74b 125.51±19.43b 4.00±1.42a 0.00b 5.00±1.51a 9.00±1.32a 95.53±9.38a 0.00b 430.16±35.72a 677.53±65.52a 0.00b 1 970.52±126.01a 0.69±0.04b 12.74±2.81a 25.12±3.79a 0.90±0.06b 0.00b 0.00b 0.00b 211.40±31.68a 6.70±0.23a 2 227.26±164.62a 1.00±0.03a 0.00b 10.38±1.57b 0.00b 0.00b 1.71±0.22a 0.00b 1 205.74±102.41a 124.18±15.08a 950.55±32.63b 12.10±1.90a 12.65±1.90ab 24.36±2.35a 16.94±4.56b 123.88±21.83a 3.85±0.12b 17.41±1.80a 222.77±42.02a 44.27±5.37b 6.74±0.27a 58.22±5.77b 13.17±1.19b 2 064.24±186.11b 0.00c 67.85±8.11c 0.00b 46.00±1.99a 0.00b 0.00b 0.20±0.03c 0.70±0.09a 229.53±23.30b 344.28±33.52bc 0.00b 2 125.28±109.96a 4.45±0.19a 14.71±2.22a 0.99±0.05b 0.00c 7.90±0.32a 0.80±0.02a 3.80±0.23a 235.13±33.63a 0.00b 2 393.06±146.37a 0.00b 2.20±0.12a 66.07±6.65a 0.00b 0.00b 0.94±0.06b 0.00b 1 048.37±69.90a
续表
种类 化合物对照组含量/（μg·100 mL-1）红曲强化组 米曲强化组酮类（11种）吡嗪类（3种）其他类（1种）庚醛正己醛壬醛戊醛总量苯丙酮4-氧代异佛尔酮3-羟基-2-丁酮2-庚酮2-壬酮2-辛酮3-羟基-2-丁酮苯乙酮苯基丙酮4-羟基-2-丁酮2,3-戊二酮总量2,3-二甲基吡嗪2,3,5,6-四甲基吡嗪2,3,5-三甲基吡嗪总量2-乙酰基呋喃总量0.00c 0.00b 0.00b 124.70±10.45a 1 176.72±76.69a 0.00b 0.00b 0.00b 0.50±0.03a 0.30±0.02a 0.50±0.04b 0.00c 0.00b 0.00b 0.80±0.16a 0.40±0.05b 2.50±0.30b 0.00b 1.18±0.09b 0.00b 1.18±0.09c 17.49±4.50a 17.49±4.50a 2.21±0.12b 0.60±0.02a 7.90±0.42a 0.00b 1 229.00±104.77a 7.70±0.56a 0.90±0.04a 2.50±0.36a 0.00b 0.00b 1.59±0.14a 0.59±0.04b 0.81±0.08a 1.20±0.08a 0.00b 3.43±0.24a 18.72±1.46a 0.00b 1.30±0.16b 0.60±0.02a 1.80±0.18b 18.53±3.52a 18.53±3.52a 8.82±0.11a 0.00b 0.00b 0.00b 1 126.40±78.84a 0.00b 0.00b 0.00b 0.00b 0.00b 0.00c 1.63±0.11a 0.80±0.04a 0.00b 0.00b 0.00c 2.43±0.15b 3.70±0.18a 2.63±0.45a 0.00b 6.33±0.63a 16.50±3.64a 16.50±3.64a
与对照组相比，红曲强化组新淋醋中的酸类、酯类、醇类和酮类物质含量显著升高（P＜0.05），分别为2 227.26 μg/100 mL、2 439.56 μg/100 mL、677.53 μg/100 mL、18.72 μg/100mL，较对照组分别提高了17.03%、21.62%、40.45%、648.80%。其中，乙酸、异戊酸、肌氨酸、丙位壬内酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、乙酸丙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、正己酸乙酯、苯乙酸乙酯、乳酸乙酯、正己醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、苯丙酮、4-氧代异佛尔酮、3-羟基-2-丁酮等挥发性香气物质的含量显著增加（P＜0.05）。值得注意的是，乙酸苯乙酯、棕榈酸乙酯、乳酸乙酯、苯乙醇等典型特征挥发性香气物质，分别赋予新淋醋蜂蜜香、奶油香、蜡质果香和玫瑰甜香[32]。邱雪等[32]的研究表明，红曲强化对四川麸醋中挥发性组分乙酸苯乙酯和棕榈酸乙酯的含量影响显著，其含量随红曲用量的增加而提升。
米曲强化组新淋醋中吡嗪类物质含量达6.33μg/100mL，较对照组显著增加426.44%（P＜0.05），并显著提升酸类（乙酸、2-甲基丁酸、异戊酸、L-丝氨酸、辛酸、正戊酸）、酯类（2-甲基丁基乙酸酯、丙二醇甲醚醋酸酯、γ-己内酯、γ-戊内酯、丁二酸单炔丙基酯、壬酸乙酯）、醛类（3-糠醛、苯甲醛）及酮类（3-羟基-2-丁酮、苯乙酮）等挥发性风味物含量（P＜0.05）；同时，醇类物质含量降低26.28%，其中异丁醇、异戊醇等苦涩醇显著减少（P＜0.05）。米曲强化通过优化蛋白酶活性及微生物群落结构，将原本倾向于生成苦涩醇类的代谢流转化为醛类、酯类等风味正向物质[33]。
综上，红曲和米曲强化显著改善了山西老陈醋挥发性风味物质组成，赋予新淋醋更丰富的风味：红曲强化组通过提升酸类、酯类、醇类和酮类物质含量，增加香气层次与浓郁度；米曲强化组则通过增加吡嗪类、优化其他风味物质组成及减少苦涩醇类，使风味更纯正协调。
2.3.5 感官评价
对3组新淋醋进行感官评价，结果见图5。由图5可知，红曲强化组和米曲强化组新淋醋感官评分分别为88.79分、83.27分，均高于对照组新淋醋感官评分（72.81分）。3组新淋醋的色泽和体态差异较小，均呈现深褐色，有光泽，醋液较为澄清，几乎无沉淀、悬浮物、霉花浮膜等异物，但各组香气和滋味有明显差异，红曲强化后新淋醋口感以酸味为主，入口柔和，带有熏味和鲜甜味，闻起来有酯香味；米曲强化后新淋醋口感以酸甜适中，入口柔和，带有熏味和鲜味，闻起来无异味；对照组新淋醋口感偏酸，入口较为刺激，带有熏味，但鲜味不足，闻起来有轻微的刺激性气味。
图5 新淋醋感官评分雷达图
Fig.5 Radar chart of sensory score of the new leaching vinegar
3 结论
本研究于山西老陈醋酒精发酵阶段强化红曲与米曲，探究其对发酵过程中微生物活菌数量、理化指标以及新淋醋品质产生的影响。结果表明，红曲与米曲强化显著提升了山西老陈醋的发酵品质与风味。发酵过程中，两者延缓酒精阶段霉菌衰亡，但因营养竞争加速醋酸阶段酵母菌衰亡；红曲显著提升还原糖、总酸、不挥发酸、总酯含量；米曲大幅提高氨基酸态氮含量。与对照组新淋醋相比，红曲强化组的总酸、不挥发性酸、总酯、可溶性固形物、川芎嗪、总黄酮、游离氨基酸、有机酸及挥发性风味物质含量分别显著提高4.57%、14.49%、35.09%、16.38%、49.41%、20.58%、12.18%、23.18%、13.33%（P＜0.05），浊度显著下降36.14%（P＜0.05），挥发性风味物质种类增加14种，感官评分（88.79分）提高；米曲强化组的总酸、不挥发性酸、氨基酸态氮、可溶性固形物、川芎嗪、总黄酮、游离氨基酸、有机酸的含量分别显著提高了4.08%、5.14%、33.33%、22.98%、40.92%、13.55%、35.56%、13.30%，浊度显著下降53.83%（P＜0.05），挥发性风味物质种类增加5种，感官评分（83.27分）提高。红曲组以乳酸、柠檬酸为核心，赋予柔和酸感与果香，并提升酯类、醇类含量增强香气；米曲组以吡嗪类为特色，协同琥珀酸、丙酮酸构建酸咸鲜味，削减苦涩醇类提升风味纯正性。后续研究将聚焦于红曲-米曲复配强化对微生物互作网络的调控机制，同时拓展其在陈醋降苦增鲜、功能性成分富集等产业化应用中的适配性工艺参数。
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